Nghiên cứu điều kiện sinh trưởng phát triển và phân tích một số vitamin trong nấm linh chi th04 trên môi trường thạch, lỏng

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS Lê Văn Điệp LỜI CẢM ƠN 664 Để hồn thành khóa luận này, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến giảng viên TS Lê Văn Điệp giao đề tài, hết lòng hướng dẫn, bảo, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm q báu cho tơi suốt q trình hồn thành đồ án tốt nghiệp Tơi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Vinh, ban chủ nhiệm khoa Hóa học, thầy giáo phịng thí nghiệm khoa Hóa học hết lịng tạo điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành đồ án Đặc biệt xin bày tỏ lịng biết ơn đến PGS.TS Trần Đình Thắng - Phó trưởng khoa Hóa Học, ThS Hồng Văn Trung - giảng viên khoa Hóa học tạo điều kiện, giúp đỡ góp ý cho tơi thời gian nghiên cứu hoàn thành đồ án tốt nghiệp Một lần xin gửi lời cảm ơn chân thành đến bạn sinh viên lớp 50K- Công nghệ thực phẩm giúp đỡ thời gian làm đồ án tốt nghiệp Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới gia đình, người thân, bạn bè động viên, giúp đỡ tơi suốt q trình học tập hoàn thành đồ án tốt nghiệp Vinh, tháng 12 năm 2013 Sinh viên Nguyễn Thị Vinh SVTH: Nguyễn Thị Vinh i Lớp 50K – CNTP ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS Lê Văn Điệp MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục đích Yêu cầu PHẦN TỔNG QUAN 1.1 Nấm linh chi 1.1.1 Khái quát chung 1.1.1.1 Đặc điểm hình thái nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) 1.1.1.2 Đặc điểm sinh lý nấm Linh chi 1.1.1.3 Chu trình sống nấm Linh chi 1.1.1.4 Vị trí phân loại 1.1.2 Thành phần hóa học nấm Linh chi 1.1.3 Giới thiệu sơ lược hoạt chất có nấm Linh chi 10 1.1.3.1 Ganoderma polysaccarit (GLPs) 10 1.1.3.2 Axit ganoderic 11 1.1.3.3 Ganoderma Adenosin 12 1.1.3.4 Hợp chất Saponin 12 1.1.3.5 Germanium hữu 13 1.1.4 Khả chữa bệnh nấm Linh chi 13 1.1.4.1 Đối với bệnh tim mạch 14 1.1.4.2 Đối với bệnh hô hấp 14 1.1.4.3 Hiệu chống ung thư 15 1.1.4.4 Khả kháng HIV 15 1.1.4.5 Khả chống oxy hóa 15 1.1.5 Một số ứng dụng lâm sàng 16 1.1.6 Tình hình nghiên cứu ni trồng nấm Linh chi giới Việt Nam 16 1.1.6.1 Tình hình nghiên cứu ni trồng nấm Linh chi giới 16 1.1.6.2 Tình hình nghiên cứu ni trồng nấm Linh chi Việt Nam 17 1.1.7 Nấm Linh chi TH04 18 1.2 Vitamin 19 1.2.1 Đại cương vitamin 19 1.2.2 Sơ lược vitamin E, C 20 1.2.2.1 Vitamin E (tocopherol) 20 SVTH: Nguyễn Thị Vinh ii Lớp 50K – CNTP ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS Lê Văn Điệp 1.2.2.2 Vitamin C 21 1.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 22 1.3.1 Cơ sở lý thuyết 22 1.3.2 Nguyên tắc trình sắc ký cột 23 1.3.3 Phân loại 23 1.3.4 Cấu tạo hệ thống HPLC 24 1.3.5 Các đại lượng đặc trưng HPLC 26 1.3.6 Cách đo HPLC 26 PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 Đối tượng, địa điểm, thời gian nghiên cứu 27 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 27 2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 27 2.1.3 Thời gian nghiên cứu 27 2.2 Vật liệu nghiên cứu 27 2.2.1 Nghiên cứu điều kiện sinh trưởng phát triển nấm Linh chi TH04 27 2.2.2 Phân tích số vitamin nấm Linh chi TH04 28 2.3 Phương pháp nghiên cứu 30 2.3.1 Phân lập nấm Linh chi TH04 30 2.3.2 Quan sát hình thái sợi nấm Linh chi TH04 31 2.3.3 Khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ lan hệ sợi nấm Linh chi môi trường thạch 31 2.3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng 31 2.3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ 31 2.3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng pH 32 2.3.4 Khảo sát tăng sinh khối nấm Linh chi TH04 môi trường lỏng môi trường với thành phần dinh dưỡng khác 32 2.3.4.1 Khảo sát yếu tố môi trường ảnh hưởng đến tăng sinh khối nấm Linh chi TH04 môi trường lỏng 32 2.3.4.2 Khảo sát hàm lượng khoáng ảnh hưởng đến tăng sinh khối nấm Linh chi TH04 môi trường lỏng 32 2.3.4.3 Khảo sát hàm lượng glucose ảnh hưởng đến tăng sinh khối nấm Linh chi TH04 môi trường lỏng 33 2.3.5 Phân tích vitamin E nấm Linh chi TH04 34 2.3.5.1 Sơ đồ xử lý chất chuẩn 34 SVTH: Nguyễn Thị Vinh iii Lớp 50K – CNTP ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS Lê Văn Điệp 2.3.5.2 Cách tiến hành 35 2.3.5.3 Điều kiện sắc ký 37 2.3.6 Phân tích vitamin C nấm Linh chi TH04 37 2.3.6.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn 37 2.3.6.2 Chuẩn bị mẫu 38 2.3.6.3 Điều kiện sắc ký 38 PHẦN 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 39 3.1 Phân lập nấm Linh chi TH04 thu thập Hà Tĩnh 39 3.2 Hình thái sợi nấm Linh chi TH04 39 3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ lan hệ sợi nấm Linh chi TH04 môi trường thạch 40 3.3.1 Ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng 40 3.3.2 Ảnh hưởng nhiệt độ 41 3.3.3 Ảnh hưởng pH 43 3.4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến tăng sinh khối nấm Linh chi TH04 môi trường lỏng 44 3.4.1 Ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng 44 3.4.2 Ảnh hưởng hàm lượng khoáng 46 3.4.2.1 Hàm lượng MgSO4 46 3.4.2.2 Hàm lượng KH2PO4 47 3.4.3 Ảnh hưởng hàm lượng glucose 49 3.5 Phân tích vitamin E nấm Linh chi TH04 50 3.5.1 Xây dựng đường chuẩn vitamin E 50 3.5.2 Xác định hàm lượng vitamin E nấm Linh chi TH04 52 3.6 Phân tích vitamin C nấm Linh chi TH04 54 3.6.2 Xác định hàm lượng vitamin C nấm Linh chi TH04 55 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 SVTH: Nguyễn Thị Vinh iv Lớp 50K – CNTP ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS Lê Văn Điệp DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1: Các hoạt chất triterpenoit có tác dụng chữa bệnh nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) .12 Bảng 1.2: Lục bảo Linh chi tác dụng dược liệu 14 Bảng 2.1: Hàm lượng MgSO4 vào môi trường 33 Bảng 2.2: Hàm lượng KH2PO4 vào môi trường 33 Bảng 2.3: Hàm lượng glucose vào môi trường 34 Bảng 3.1: Tốc độ lan hệ sợi loại môi trường khác (mm) 40 Bảng 3.2: Tốc độ lan hệ sợi giá trị nhiệt độ khác (mm) .41 Bảng 3.3: Tốc độ lan hệ sợi giá trị pH khác (mm) .43 Bảng 3.4: Khối lượng sinh khối nấm Linh chi TH04 loại môi trường khác (g/50ml) 44 Bảng 3.5: Khối lượng sinh khối nấm Linh chi TH04 nghiệm thức khác (g/50ml) 46 Bảng 3.6: Khối lượng sinh khối nấm Linh chi TH04 nghiệm thức khác (g/50ml) 47 Bảng 3.7 Khối lượng sinh khối nấm Linh chi TH04 nghiệm thức khác (g/50ml) 49 Bảng 3.8: Diện tích pic vitamin E tương ứng với nồng độ chuẩn 51 SVTH: Nguyễn Thị Vinh v Lớp 50K – CNTP ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS Lê Văn Điệp DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.1: Một số hình ảnh nấm Linh chi .4 Hình 1.2: Nấm Linh chi Hình 1.3: Chu trình sống nấm Linh chi [5] Hình 1.4: Hình ảnh nấm Linh chi TH04 19 Hình 1.5: Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC 24 Hình 3.1: Giống gốc phân lập đĩa peptri 39 Hình 3.2: Hình thái hệ sợi nấm Linh chi TH04 .39 Hình 3.3: Hệ sợi nấm Linh chi TH04 sau ngày ni cấy .41 Hình 3.4: Hệ sợi nấm Linh chi TH04 sau ngày ni cấy .42 Hình 3.5: Hệ sợi nấm Linh chi TH04 sau ngày nuôi cấy .44 Hình 3.6: Sinh khối nấm Linh chi TH04 sau ngày nuôi cấy 45 Hình 3.7: Sinh khối nấm linh chi TH04 sau ngày nuôi cấy 47 Hình 3.8: Sinh khối nấm Linh chi sau ngày ni cấy 48 Hình 3.9 Sinh khối nấm Linh chi sau ngày nuôi cấy 50 Hình 3.10: Đường chuẩn biểu thị mối quan hệ diện tích pic thu nồng độ chuẩn vitamin E .51 Hình 3.11: Sắc đồ chuẩn vitamin E có nồng độ 10ppm 54 Hình 3.12: Sắc đồ chuẩn vitamin E có nồng độ 40ppm 54 Hình 3.13: Sắc đồ vitamin E cuả nấm Linh chi TH04 544 Hình 3.14: Đường chuẩn biểu thị mối quan hệ diện tích pic thu nồng độ chuẩn vitamin C 555 Hình 3.15: Sắc đồ chuẩn vitamin C có nồng độ 5ppm 546 Hình 3.16: Sắc đồ chuẩn vitamin C có nồng độ 50ppm 546 Hình 3.17: Sắc đồ vitamin C nấm Linh chi TH04Error! Bookmark not defined.7 SVTH: Nguyễn Thị Vinh vi Lớp 50K – CNTP ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS Lê Văn Điệp DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1: Môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng đến tốc độ lan hệ sợi nấm Linh chi TH04 môi trường thạch 40 Biểu đồ 3.2: Nhiệt độ ảnh hưởng đến tốc độ lan hệ sợi nấm Linh chi TH04 môi trường thạch .42 Biểu đồ 3.3: pH ảnh hưởng đến tốc độ lan hệ sợi nấm Linh chi TH04 môi trường thạch 43 Biểu đồ 3.4: Môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng đến tăng sinh khối nấm Linh chi TH04 môi trường lỏng 45 Biểu đồ 3.5: Hàm lượng MgSO4 ảnh hưởng đến tăng sinh khối nấm Linh chi TH04 môi trường lỏng .46 Biểu đồ 3.6: Hàm lượng KH2PO4 ảnh hưởng đến tăng sinh khối nấm Linh chi TH04 môi trường lỏng 48 Biểu đồ 3.7: Hàm lượng glucose ảnh hưởng đến tăng sinh khối nấm Linh chi TH04 môi trường lỏng .49 SVTH: Nguyễn Thị Vinh vii Lớp 50K – CNTP ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS Lê Văn Điệp MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Cách hàng ngàn năm, nấm Linh chi dùng để làm thuốc Các sách dược thảo nhiều triều đại Trung Quốc ghi nhận Linh chi sử dụng làm thuốc từ lâu đời Sách “Thần nơng thảo” nói: “Linh chi thuốc kết tinh quý mây mưa núi cao, tinh ngũ hành ngày đêm mà khoe năm sắc nên giữ sức khỏe cho bậc đế vương” Đến đời Minh sách “Bản thảo cương mục”, tác giả Lý Thời Trân phân nấm Linh chi thành “Lục bảo Linh chi” theo sáu màu sắc xanh, trắng, đỏ, vàng, đen, tím khái quát tác dụng trị liệu Linh chi theo màu Nói chung loại Linh chi có tính bình, khơng độc, có tác dụng chữa trị tốt bệnh tim mạch, phổi, gan… Đến khoa học kỹ thuật phát triển, nấm Linh chi nhà khoa học giới chứng minh tác dụng hữu ích việc điều trị bệnh: ung thư, cao huyết áp, tiểu đường, tim mạch, HIV, viêm gan, suy nhược thần kinh…[3,9] Chính thế, việc nghiên cứu, phát triển sử dụng nấm Linh chi dần trọng Hiện Việt Nam nguồn dược liệu Linh chi thị trường chủ yếu nhập từ nước ngồi chủ yếu từ Trung Quốc, Hàn Quốc số nuôi trồng nước với giống nhập ngoại phân lập khu vực rừng núi Lâm Đồng Tây Bắc Bộ nước ta Trong nguồn nấm Linh chi tự nhiên ngày cạn kiệt khai thác để phục vụ cho nhu cầu tăng cường sức khỏe chữa bệnh với nhu cầu xuất Mặt khác Việt Nam với khí hậu nhiệt đới gió mùa nguồn nguyên liệu cellulose dồi tạo điều kiện hích hợp cho nghề trồng nấm quanh năm Việc nuôi trồng thu hoạch nấm Linh chi tốn nhiều thời gian Chính thế, việc nghiên cứu để tìm phương pháp hữu hiệu nhằm nâng cao hiệu sản xuất nấm Linh chi việc cần thiết để phục vụ nhu cầu sử dụng cho người Vitamin phân tử hữu cần thiết cho hoạt động chuyển hóa bình thường thể người Mặc dù vitamin hoạt động với số lượng nhỏ không tạo SVTH: Nguyễn Thị Vinh Lớp 50K – CNTP ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS Lê Văn Điệp lượng chúng vơ cần thiết cho q trình hoạt động phát triển tổ chức Vitamin đóng vai trị chất xúc tác cho phản ứng hóa học xảy thể Nếu thiếu vitamin, phản ứng chậm lại q trình chuyển hóa bị rối loạn Do đó, việc phân tích số vitamin nấm điều quan trọng Xuất phát từ tình hình thực tế đồng ý thầy hướng dẫn, định thực đề tài “Nghiên cứu điều kiện sinh trưởng phát triển phân tích số vitamin nấm Linh chi TH04 mơi trường thạch, lỏng” Mục đích  Phân lập nấm Linh chi TH04 thu thập Hà Tĩnh  Khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ lan hệ sợi nầm Linh chi TH04 môi trường thạch  Khảo sát tăng sinh khối nấm Linh chi TH04 môi trường lỏng môi trường với thành phần dinh dưỡng khác  Phân tích số vitamin nấm Linh chi TH04 Yêu cầu  Phân lập nấm Linh chi TH04 thu thập Hà Tĩnh  Khảo sát yếu tố môi trường ảnh hưởng đến tốc độ lan hệ sợi nấm Linh chi TH04 môi trường thạch  Khảo sát yếu tố nhiệt độ ảnh hưởng đến tốc độ lan hệ sợi nấm Linh chi TH04 môi trường thạch  Khảo sát yếu tố pH ảnh hưởng đến tốc độ lan hệ sợi nấm Linh chi TH04 môi trường thạch  Khảo sát yếu tố môi trường ảnh hưởng đến tăng sinh khối nấm Linh chi TH04 môi trường lỏng  Khảo sát hàm lượng khoáng ảnh hưởng đến tăng sinh khối nấm Linh chi TH04 môi trường lỏng  Khảo sát hàm lượng glucose ảnh hưởng đến tăng sinh khối nấm Linh chi TH04 mơi trường lỏng  Phân tích số thành phần nấm Linh chi TH04: vitamin C, E SVTH: Nguyễn Thị Vinh Lớp 50K – CNTP ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS Lê Văn Điệp PHẦN TỔNG QUAN 1.1 Nấm Linh chi 1.1.1 Khái quát chung Nấm Linh chi có tên khoa học Ganoderma lucidum, người miền Bắc gọi nấm lim Trong thư tịch cổ nấm Linh chi gọi với tên khác Tiên thảo, Nấm trường thọ, Vạn niên nhung… Nấm Linh chi thường phân bố vùng nhiệt đới cận nhiệt đới, chúng thường phát triển giá thể gỗ mục nguyên liệu có chất xơ Hình thái thể nấm Linh chi mơ tả sau: Tai nấm hóa gỗ, hình quạt thận Mặt mũ có vân đồng tâm bóng lống, màu vàng cam màu đỏ đậm nâu đen Mặt phẳng, có nhiều lỗ nhỏ li ti, quan sinh bào tử Cuống nấm đặc cứng, sậm màu bóng lống Giá trị dược liệu Linh chi ghi chép thư tịch cổ Trung Quốc, cách 4000 năm Trong sách “Thần nông thảo” cách khoảng 2000 năm thời nhà Châu sau nhà dược học tiếng Trung Quốc Lý thời Trân phân thành “Lục Bảo Linh Chi” thời nhà Minh với khái quát công dụng dược lý khác nhau, ứng theo màu Theo Lý Thời Trân nấm Linh Chi có màu khác nhau: + Xích chi (Linh chi đỏ gọi Hồng chi) + Hắc chi (Linh chi đen gọi Huyền chi) + Thanh chi (Linh chi xanh gọi Long chi) + Bạch chi (Linh chi trắng gọi Ngọc chi) + Hồng chi (Linh chi vàng cịn gọi Kim chi) + Tử chi (Linh chi tím) Cấu trúc độc đáo Linh chi thành phần khống vi lượng đủ loại, số khống tố germanium, vanadium, crom…Chúng sử dụng nhân tố quan trọng cho nhiều loại phản ứng chống ung thư, lão hóa, xơ vữa, đơng máu nội mạch, giúp điều chỉnh dẫn truyền thần kinh, bảo vệ cấu trúc nhân tế bào với hàm lượng thấp Ở nước Châu Á, đặc biệt Trung Quốc, Nhật bản, Hàn Quốc, Đài Loan…Việc nghiên cứu phát triển sử dụng Linh chi cơng nghiệp hóa với quy mô lớn phân loại, nuôi trồng chủ động, chế biến bào chế dược phẩm SVTH: Nguyễn Thị Vinh Lớp 50K – CNTP ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS Lê Văn Điệp 3.4.2 Ảnh hƣởng hàm lƣợng khoáng 3.4.2.1 Hàm lượng MgSO4 Bảng 3.5: Khối lượng sinh khối nấm Linh chi TH04 nghiệm thức khác (g/50ml) Nghiệm thức Trung bình SD NT1 0,46 0,02 NT2 0,55 0,02 NT3 0,59 0,02 NT4 0,54 0,01 0.7 0.6 0.5 0.4 Sinh khối nấm (g/50ml) 0.3 0.2 0.1 0.0 Nghiệm thức Biểu đồ 3.5: Hàm lượng MgSO4 ảnh hưởng đến tăng sinh khối nấm Linh chi TH04 môi trường lỏng SVTH: Nguyễn Thị Vinh 46 Lớp 50K – CNTP ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS Lê Văn Điệp Hình 3.7: Sinh khối nấm linh chi TH04 sau ngày nuôi cấy Nhận xét: Dựa vào biểu đồ ta thấy, sử dụng MgSO4 mức 0,05g/50ml sinh khối phát triển chậm Khi tăng dần hàm lượng MgSO4 lên đến 0,15g/50ml lượng sinh khối tăng theo đạt sinh khối cao 0,59g/50ml Cịn tăng hàm lượng MgSO4 lên 0,2g/50ml lượng sinh khối lại giảm đáng kể 0,54g/50ml Điều chứng tỏ, tăng Mg2+ vượt mức chịu đựng tế bào, ức chế hoạt động số enzym cần thiết cho trình tổng hợp tế bào giảm phản ứng tổng hợp tế bào sợi nấm Vậy hàm lượng MgSO4 thích hợp cho q trình phát triển sợi nấm Linh chi TH04 0,15g/50ml 3.4.2.2 Hàm lượng KH2PO4 Bảng 3.6: Khối lượng sinh khối nấm Linh chi TH04 nghiệm thức khác (g/50ml) Nghiệm thức Trung bình SD NT1 0,48 0,03 NT2 0,54 0,03 NT3 0,62 0,03 NT4 0,49 0,03 SVTH: Nguyễn Thị Vinh 47 Lớp 50K – CNTP ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS Lê Văn Điệp 0.7 0.6 0.5 0.4 Sinh khối nấm (g/50ml) 0.3 0.2 0.1 0.0 Nghiệm thức Biểu đồ 3.6: Hàm lượng KH2PO4 ảnh hưởng đến tăng sinh khối nấm Linh chi TH04 mơi trường lỏng Hình 3.8: Sinh khối nấm Linh chi sau ngày nuôi cấy Nhận xét: Dựa vào biểu đồ ta thấy, tăng hàm lượng KH2PO4 lên dần lượng sinh khối tăng Mặt khác, hàm lượng KH2PO4 sử dụng vượt mức chịu đựng tế bào nấm Linh chi TH04 lượng sinh khối thu giảm Lượng sinh khối thu cao 0,62g/50ml hàm lượng KH2PO4 0,15g/50ml Khi hàm SVTH: Nguyễn Thị Vinh 48 Lớp 50K – CNTP ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS Lê Văn Điệp lượng KH2PO4 0,05g/50ml lượng sinh khối thu thấp 0,48g/50ml hàm lượng KH2PO4 tăng đến 0,2g/50ml sinh khối giảm xuống 0,49g/50ml Vậy Hàm lượng KH2PO4 thích hợp cho phát triển Linh chi sinh khối 0,15g/50ml 3.4.3 Ảnh hƣởng hàm lƣợng glucose Bảng 3.7 Khối lượng sinh khối nấm Linh chi TH04 nghiệm thức khác (g/50ml) Nghiệm thức Trung bình SD NT1 0,44 0,03 NT2 0,48 0,02 NT3 0,58 0,01 NT4 0,50 0,03 NT5 0,46 0,03 0.7 0.6 0.5 0.4 Sinh khối nấm (g/50ml) 0.3 0.2 0.1 0.0 Nghiệm thức Biểu đồ 3.7: Hàm lượng glucose ảnh hưởng đến tăng sinh khối nấm Linh chi TH04 môi trường lỏng SVTH: Nguyễn Thị Vinh 49 Lớp 50K – CNTP ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS Lê Văn Điệp Hình 3.9 Sinh khối nấm Linh chi sau ngày nuôi cấy Nhận xét: Dựa vào bảng đồ thị ta thấy, tăng dần hàm lượng glucose từ 0,5g/50ml lên 1g/50ml lượng sinh khối thu tăng Sau tăng tiếp hàm lượng glucose vào mơi trường từ 1,5g/50ml đến 2g/50ml sinh khối nấm thu giảm dần Sinh khối nấm giảm dần nông độ glucose cao môi trường ức chế enzim ngoại bào phân hủy chất Lượng sinh khối thu cao 0,58g/50ml hàm lượng glucose 1g/50ml thấp 0,44g/50ml hàm lượng glucose 0,5g/50ml Vậy hàm lượng glucose thích hợp cho q trình phát triển sợi nấm 1g/50ml 3.5 Phân tích vitamin E nấm Linh chi TH04 3.5.1 Xây dựng đƣờng chuẩn vitamin E Dãy chuẩn vitamin E khảo sát có nồng độ sau: ppm; 10 ppm; 20 ppm; 40 ppm Phân tích chuẩn nói xác định phương trình hồi quy tuyến tính dựa vào diện tích pic SVTH: Nguyễn Thị Vinh 50 Lớp 50K – CNTP ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS Lê Văn Điệp Bảng 3.8: Diện tích pic vitamin E tương ứng với nồng độ chuẩn Nồng độ Diện tích pic chuẩn trung bình 130,69500 10 420,45960 20 955,86340 40 1924,53967 m b R2 49,99 - 66,92 0,9996 Sử dụng chương trình Microsoft Excel để xây dựng đường chuẩn, ta có phương trình đường chuẩn xác định hàm lượng vitamin E sau: Phương trình hồi qui đường chuẩn theo diện tích pic có dạng: y = mx +b x nồng độ, y diện tích pic m = 49,99 b = - 66,92 Hệ số hồi quy tuyến tính R2 = 0,9996 Hình 3.10: Đường chuẩn biểu thị mối quan hệ diện tích pic thu nồng độ chuẩn vitamin E SVTH: Nguyễn Thị Vinh 51 Lớp 50K – CNTP ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS Lê Văn Điệp 3.5.2 Xác định hàm lƣợng vitamin E nấm Linh chi TH04 Từ giá trị diện tích pic đo được, ta áp vào đường chuẩn vitamin E thu hàm lượng vitamin E có dịch chiết thơng qua đừơng chuẩn (Co) Sau ta tính hàm lượng vitamin E (mg/kg) có mẫu nấm theo cơng thức sau: C=(Co/m).Vdm.f Trong : - C : Hàm lượng vitamin E có mẫu, tính theo mg/kg - Co: Hàm lượng vitamin E có dịch chiết (Co) thông qua đường chuẩn, mg/l - f : Hệ số pha lỗng (nếu có) - m : Khối lượng mẫu thử (g) - Vdm: Thể tích bình định mức mẫu(ml) Bảng 3.9: Kết phân tích hàm lượng vitamin E nấm Linh chi TH04 Mẫu Co(mg/l) TH04 5,87313 SVTH: Nguyễn Thị Vinh Khối lƣợng mẫu (g) 15 52 Diện tích pic C(mg/kg) 245,96680 3,91542 Lớp 50K – CNTP ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS Lê Văn Điệp Hình 3.11: Sắc đồ chuẩn vitamin E có nồng độ 10ppm Hình 3.12: Sắc đồ chuẩn vitamin E có nồng độ chuẩn 40ppm SVTH: Nguyễn Thị Vinh 53 Lớp 50K – CNTP ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS Lê Văn Điệp Hình 3.13: Sắc đồ vitamin E nấm Linh chi TH04 3.6 Phân tích vitamin C nấm Linh chi TH04 3.6.1 Xây dựng đƣờng chuẩn vitamin C Dãy chuẩn vitamin C khảo sát có nồng độ sau: 5ppm, 10ppm, 20ppm, 50ppm Phân tích chuẩn nói xác định phương trình hồi quy tuyến tính dựa vào diện tích pic Bảng 3.10: Diện tích pic vitamin C tương ứng với nồng độ chuẩn Nồng độ Diện tích pic chuẩn trung bình 78,06114 10 160,62611 20 346,78271 50 898,86700 SVTH: Nguyễn Thị Vinh M b R2 18,325 - 18,319 0,9999 54 Lớp 50K – CNTP ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS Lê Văn Điệp Sử dụng chương trình Microsoft Excel để xây dựng đường chuẩn, ta có phương trình đường chuẩn xác định hàm lượng vitamin C sau: Phương trình hồi qui đường chuẩn theo diện tích pic có dạng: y = mx +b x nồng độ, y diện tích pic m = 18,325 b = - 18,319 Hệ số hồi quy tuyến tính R2 =0,9999 1000 y = 18.325x - 18.319 R2 = 0.9999 900 800 700 area 600 Series1 500 Linear (Series1) 400 300 200 100 0 10 20 30 40 50 60 amount:(ppm) Hình 3.14: Đường chuẩn biểu thị mối quan hệ diện tích pic thu nồng độ chuẩn vitamin C 3.6.2 Xác định hàm lƣợng vitamin C nấm Linh chi TH04 Phương pháp tính hàm lượng vitamin C mẫu tương tự với vitamin E Bảng 3.11: Kết phân tích hàm lượng vitamin C nấm Linh chi TH04 Mẫu Co (mg/l) TH04 18,15728 SVTH: Nguyễn Thị Vinh Khối lƣợng Diện tích mẫu (g) peak 10 317,84619 55 C(mg/kg) 45,39313 Lớp 50K – CNTP ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS Lê Văn Điệp Hình 3.15: Sắc đồ chuẩn vitamin C có nồng độ 5ppm Hình 3.16: Sắc đồ chuẩn vitamin C có nồng độ 50ppm SVTH: Nguyễn Thị Vinh 56 Lớp 50K – CNTP ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP SVTH: Nguyễn Thị Vinh GVHD: TS Lê Văn Điệp 57 Lớp 50K – CNTP ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS Lê Văn Điệp KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận - Đã phân lâp, khiết giữ giống chủng nấm Linh chi TH04 - Đã quan sát hệ sợi nấm Linh chi TH04 kính hiển vi - Đã nghiên cứu điều kiện thuận lợi cho phát triển hệ sợi nấm Linh chi TH04 môi trường thạch: + Môi trường: PGA + 10% nước chiết giá + Nhiệt độ: 30 ± 2ºC + pH: 6,5 - Đã nghiên cứu số điều kiện thuận lợi cho tăng sinh khối nấm Linh chi TH04 môi trường lỏng: + Môi trường: ME + Hàm lượng MgSO4: 0,15g/50ml + Hàm lượng KH2PO4: 0,15g/50ml + Hàm lượng glucose: 1g/50ml - Xác định hàm lượng vitamin E nấm Linh chi TH04: 3,91542 mg/kg - Xác định hàm lượng vitamin C nấm Linh chi TH04: 45,39313 mg/kg Kiến nghị Vì thời gian thực đề tài có hạn nên tơi chưa nghiên cứu đầy đủ nấm TH04 - Nghiên cứu thêm yếu tố ảnh hưởng đến tăng sinh khối nấm môi trường lỏng: Nhiệt độ; pH; nguồn dinh dưỡng cacbon, nitơ… - Phân tích thành phần khác nấm: Các hoạt chất nấm; vitamin A, D, B… - Định tính nấm có chứa enzym như: amylaza, proteaza, chitinaza… SVTH: Nguyễn Thị Vinh 58 Lớp 50K – CNTP ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS Lê Văn Điệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Lê Xuân Thám, 1996, Nghiên cứu đặc điểm sinh học đặc điểm hấp thu khoáng nấm Linh chi Ganoderma lucidum (Leyss.ẽ Fr).Karst Luận án phó tiến sỹ khoa học sinh học, Đại học Khoa Học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội, Việt Nam Đinh Xuân Linh, et al (2010) Kỹ thuật trồng, chế biết nấm ăn, nấm dược liệu Nhà xuất nông nghiệp Lê Xuân Thám, 1996 Nấm Linh chi-dược liệu quí Việt Nam Nhà xuất mũi cà mau Nguyễn Bá Hai, 2009 Bài giảng kỹ thuật trồng nấm Dự án hợp tác Việt Nam - Hà Lan Trường đại học nông lâm Huế Nguyễn Thị Chính Vũ Thành Cơng, 1999 Nghiên cứu công nghệ sản xuất sinh khối số hoạt tính sinh học nấm Linh chi Ganoderma lucidum Tạp chí sinh học, tập 21, số 3: 132-136 Nguyễn Thị Chính, 2005 Phát triển cơng nghệ sản xuất nấm dược liệu phục vụ tăng cường sức khỏe Đề tài hợp tác nghiên cứu khoa học, Đại học Khoa Học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội Nguyễn Lân Dũng, 2001 Công nghệ nuôi trồng nấm, tập Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội Nguyến Hữu Đống, 2003 Nuôi trồng chế biến nấm ăn nấm làm thuốc chữa bệnh Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội Nguyễn Hữu Đống Đinh Xuân Linh, 2000 Nấm ăn nấm dược liệu – công nghệ nuôi trồng Nhà xuất Hà Nội 10 Nguyễn Hữu Đống, 2003 Nuôi trồng chế biến nấm ăn nấm làm thuốc chữa bệnh Nhà xuất Nông nghiệp, Hà nội 11 Lê Duy Thắng, 2001 Kỹ thuật nuôi trồng nấm ăn, tập Nhà xuất Nông nghiệp 12 Nguyễn Phước Thuận, 2001 Giáo trình sinh hóa học, phần Nhà xuất Đại học Quốc Gia TPHCM 13 Lê Duy Thắng, 2001 Kỹ thuật nuôi trồng nấm ăn, tập Nhà xuất Nông nghiệp SVTH: Nguyễn Thị Vinh 59 Lớp 50K – CNTP ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS Lê Văn Điệp 14 Nguyễn Đức Lượng, 2003 Vi sinh học công nghiệp, tập Nhà xuất Đại học Quốc Gia TP.HCM 15 Trịnh Tam Kiệt, 2011 Nấm lớn Việt Nam, tập Nhà xuất khoa học tự nhiên Công nghệ Hà Nội 16 Trịnh Tam Kiệt, 2012 Nấm lớn Việt Nam, tập Nhà xuất khoa học tự nhiên Công nghệ Hà Nội Tiếng Anh 17 Zhaoji - Ding, 1980 The Ganodermataceae in chine Berlin Shiffigart 18 Boh, B., M Beroviè, J S Zhang and L Z Bi, 2007 Ganoderma lucidum and its pharmaceutically active compounds Biotechnology Annual Review 13:265-301 19 Fujita, R., J Liu, K Shimizu, F Konishi, K Noda, S Kumamoto, 2005 Antiandrogenic activities of Ganoderma lucidum Journal of Ethnopharmacology 20 Wang, F., J K Liu, 2008 Highly oxygenated lanostane type triterpenoids from the fungus Ganoderma applanatum Chemistry and Pharmacology Bulletin 56(7): 1035-1037 21 Wang, F., J K Liu, 2008 Highly oxygenated lanostane type triterpenoids from the fungus Ganoderma applanatum Chemistry and Pharmacology Bulletin 56(7): 1035-1037 22 Niedermeyer, U Lindequist, R Mentel, D Gördes, E Schmidt, K Thurow, M Lalk, 2005 Antiviral terpenoid constituents of Ganoderma pfeifferi Journal of Natural Products 68: 1728-1731 23 Elissetche, J P., A Ferraz, J Freer, J Rodríguez, 2007 Enzymes produced by Ganoderma australe growing on wood and in submerged cultures World Jozurnal of Micrbiology and Biotechnology 23: 429-434 24 Hsu, C., K Lin, Z Wang, W Lin, M Yin, 2008 Preventive effect of Ganoderma amboinense on acetaminophen-induced acute liver injury Phytomedicine 15: 946-950 25 Chen, D H., W K D Chen, 2003 Determination of ganoderic acids in triterpenoid constituents of Ganoderma tsugae Journal of Food and Drug Analysis 11(3): 195-201 SVTH: Nguyễn Thị Vinh 60 Lớp 50K – CNTP ... Vật liệu nghiên cứu 27 2.2.1 Nghiên cứu điều kiện sinh trưởng phát triển nấm Linh chi TH04 27 2.2.2 Phân tích số vitamin nấm Linh chi TH04 28 2.3 Phương pháp nghiên cứu ... Xuất phát từ tình hình thực tế đồng ý thầy hướng dẫn, định thực đề tài ? ?Nghiên cứu điều kiện sinh trưởng phát triển phân tích số vitamin nấm Linh chi TH04 môi trường thạch, lỏng? ?? Mục đích  Phân. .. khác  Phân tích số vitamin nấm Linh chi TH04 Yêu cầu  Phân lập nấm Linh chi TH04 thu thập Hà Tĩnh  Khảo sát yếu tố môi trường ảnh hưởng đến tốc độ lan hệ sợi nấm Linh chi TH04 môi trường thạch