Nghiên cứu thu nhận và làm sạch lactase từ lactobacillus acidophilus

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA - NGUYỄN THỊ VÂN LINH NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ LÀM SẠCH LACTASE TỪ LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm đồ uống Mã số: 605402 LUẬN VĂN THẠC SĨ TP HỒ CHÍ MINH, tháng 01 năm 2013 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA–ĐHQG-HCM Cán hướng dẫn khoa học : T.S TRẦN BÍCH LAM Cán chấm nhận xét : PGS.TS ĐỒNG THỊ THANH THU Cán chấm nhận xét : PGS.TS LÊ VĂN VIỆT MẪN Luận văn thạc sĩ bảo vệ Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM ngày 30 tháng 01 năm 2013 Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: GS TSKH LƯU DUẨN : Chủ tịch Hội đồng PGS.TS ĐỒNG THỊ THANH THU : Phản biện PGS.TS LÊ VĂN VIỆT MẪN : Phản biện TS TRẦN BÍCH LAM : Ủy viên TS LẠI QUỐC ĐẠT : Thư ký Xác nhận Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau luận văn sửa chữa CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC i ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: NGUYỄN THỊ VÂN LINH MSHV: 11110205 Ngày, tháng, năm sinh: 14/01/1988 Nơi sinh: TP.HCM Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm đồ uống Mã số : 605402 I TÊN ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ LÀM SẠCH LACTASE TỪ LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:  Xác định phương pháp kết tủa lactase thô  Tinh chế chế phẩm lactase  Khảo sát tính chất chế phẩm lactase tinh chế  Khảo sát khả thủy phân lactose sữa tươi chế phẩm lactase tinh chế III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 06/02/2012 IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 30/01/2013 V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN : TS TRẦN BÍCH LAM Tp HCM, ngày 24 tháng 01 năm 2013 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (Họ tên chữ ký) CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO (Họ tên chữ ký) TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC (Họ tên chữ ký) ii LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến T.S Trần Bích Lam Cơ tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, động viên lúc em gặp trở ngại khó khăn, tạo điều kiện tốt để em hoàn thành luận văn Em xin chân thành cảm ơn quý Thầy Cô Bộ môn công nghệ thực phẩm truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm quý báu suốt năm học trường Em xin thành cảm ơn Chị Phượng, bạn Phịng thí nghiệm Vi sinh tạo điều kiện, chia sẻ động viên thời gian thực luận văn Con xin cảm ơn nội, ba cô hai yêu thương chỗ dựa vững mặt sống Xin cảm ơn thành viên Lớp Cao học thực phẩm 2010, 2011, bạn sinh viên khóa 08 – Cơng nghệ thực phẩm, anh chị bạn bè thân quen chia sẻ, động viên giúp đỡ học tập sống TP Hồ Chí Minh, ngày 24 tháng 01 năm 2013 NGUYỄN THỊ VÂN LINH iii TÓM TẮT LUẬN VĂN Trong luận văn này, nghiên cứu việc thu nhận làm enzyme lactase tế bào Lactobacillus acidophilussinh tổng hợp, bước đầu thủy phân lactose sữa tươi Kết thu sau: 1- Khảo sát hiệu kết tủa lactase từ dịch bào thu sau xử lý siêu âm loại bỏ xác vi sinh vật tác nhân muối trung tính dung mơi hữu cơ, kết quả, isopropanol kết tủa hiệu với hiệu suất thu hồi 89,93%, độ tinh 4,46 lần Chế phẩm lactase thơ có hoạt tính riêng đạt 14,005 ± 0,384 U/mg protein 2- Chế phẩm lactase thơ sau tinh chế hệ thống sắc ký loại trừ kích thước – sắc ký thẩm thấu gel Kết quả, chế phẩm lactase tinh chất có hoạt tính riêng đạt 44,928 U/mg protein, hiệu suất thu hồi đạt 58,57% so với mẫu enzyme thô thu sau xử lý sóng siêu âm độ tinh đạt 14,31 lần Lactase tinh chế tiến hành chạy điện di SDS-PAGE xác định có trọng lượng phân tử 40kDa 3- Chế phẩm lactase tinh chế dùng để xác định tính chất Kết quả, lactase tinh chế có nhiệt độ tối ưu khoảng 40oC, pH tối ưu khoảng 7,5 Khi tiến hành khảo sát độ bền nhiệt chế phẩm kết nhiệt độ 35, 40oC sau ủ hoạt tính cịn lại đạt 50%, 50oC hoạt tính cịn lại có 10% Khi xác định số Km Vmax, kết giá trị Km Vmax 2,3 µmol/phút 0,73 mM 4- Khảo sát sơ khả thủy phân lactose sữa tươi, chế phẩm có khả thủy phân khoảng 68% lactose 10ml sữa với tỷ lệ chế phẩm 5ml (tương ứng hoạt tính tổng 2,995U) thời gian thủy phân iv LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu luận văn cơng trình nghiên cứu thực cá nhân thực hướng dẫn khoa học T.S Trần Bích Lam Các số liệu, kết luận nghiên cứu luận văn trung thực không trùng lặp với đề tài khác chưa công bố hình thức nào, thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm nghiên cứu Học viên thực hiên NGUYỄN THỊ VÂN LINH v MỤC LỤC MỤC LỤC vi DANH MỤC BẢNG ix DANH MỤC HÌNH x GIỚI THIỆU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .2 1.1 LACTASE .2 1.1.1 Đặc điểm 1.1.2 Cơ chế xúc tác 1.1.3 Nguồn thu nhận lactase 1.1.4 Cấu trúc enzyme lactase 10 1.2 LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS 11 1.3 PHƯƠNG PHÁP KẾT TỦA ENZYME .14 1.4 TINH SẠCH LACTASE BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ 17 1.5 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU .20 1.6 ỨNG DỤNG CỦA CHẾ PHẨM LACTASE 21 1.6.1 Ứng dụng công nghiệp sữa sản phẩm từ sữa 21 1.6.2 Ứng dụng công nghiệp tận dụng whey 23 CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 VẬT LIỆU VÀ HÓA CHẤT .25 2.1.1 Giống vi sinh vật 25 2.1.2 Môi trường nuôi cấy .25 2.1.3 Hóa chất 26 2.1.4 Thiết bị dụng cụ .26 2.2 QUY TRÌNH THU NHẬN VÀ LÀM SẠCH LACTASE 27 2.3 SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU .28 2.4 THUYẾT MINH QUY TRÌNH THU NHẬN VÀ LÀM SẠCH LACTASE .29 2.4.1 Chuẩn bị nguyên liệu 29 2.4.2 Phá vỡ tế bào L acidophilus giải phóng lactase 29 vi 2.4.3 Thu dịch bào 30 2.4.4 Kết tủa protein enzyme 30 2.4.5 Tinh chế protein lactase 30 2.5 BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM 31 2.5.1 Khảo sát phương pháp thu enzyme thô .31 2.5.2 Xác định phương pháp tinh chế: 33 2.5.3 Xác định tính chất chế phẩm lactase: .34 2.5.4 Khảo sát khả thủy phân lactose sữa tươi 36 2.6 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 37 2.6.1 Định lượng Protein hòa tan phương pháp Lowry 37 2.6.2 Xác định hoạt tính lactase chất ONPG .38 2.6.3 Phương pháp xác định hàm lượng lactose sữa 40 2.7 CÔNG THỨC TÍNH TỐN .41 2.7.1 Cơng thức xác định hoạt tính lactase enzyme tự .41 2.7.2 Công thức xác định hoạt tính riêng enzyme lactase .42 2.7.3 Hiệu suất thu hồi protein enzyme: 42 2.7.4 Độ tinh chế phẩm 42 2.7.5 Hàm lượng lactose 1ml sữa 42 2.7.6 Hiệu suất lactose thủy phân 42 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 43 3.1 NGUYÊN LIỆU BAN ĐẦU .43 3.2 KHẢO SÁT TÁC NHÂN KẾT TỦA PROTEIN ENZYME 43 3.2.1 Kết tủa NaCl .43 3.2.2 Kết tủa (NH4)2SO4 45 3.2.3 Kết tủa acetone .47 3.2.4 Kết tủa ethanol .50 3.2.5 Kết tủa Isopropanol 52 3.2.6 Kết luận chung 54 3.3 TINH SẠCH CHẾ PHẨM BẰNG SẮC KÝ 55 3.4 XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT CỦA CHẾ PHẨM 58 vii 3.4.1 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính enzyme .58 3.4.2 Khảo sát ảnh hưởng pH lên hoạt tính enzyme .60 3.4.3 Độ bền nhiệt chế phẩm 61 3.5 TÍNH CHẤT ĐỘNG HỌC CỦA CHẾ PHẨM 62 3.6 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG THỦY PHÂN LACTOSE TRONG SỮA TƯƠI .63 3.6.1 Khảo sát tỷ lệ lượng chế phẩm thể tích sữa .63 3.6.2 Khảo sát thời gian thủy phân lactose sữa tươi 64 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 65 4.1 KẾT LUẬN 65 4.2 KIẾN NGHỊ 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO 66 PHỤ LỤC PHẦN LÝ LỊCH TRÍCH NGANG viii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Cấu trúc số oligosaccharide tạo thành với xúc tác lactase chất lactose Bảng 1.2: Nguồn lactase từ vi sinh vật .5 Bảng 1.3: Đặc điểm lactase từ vi sinh vật Bảng 1.4: Tính chất hóa lý lactase từ nguồn vi sinh vật khác Bảng 1.5: Tính chất lactase Bảng 1.6: Tính chất sinh lý hóa lý Lactobacillus acidophilus 12 Bảng 2.1: Thành phần MT1 25 Bảng 2.2: Thành phần MT3 26 Bảng 2.3: Các bước xác định hoạt tính lactase 40 Bảng 3.1: Kết tinh lactase sodium chloride .44 Bảng 3.2: Kết tinh lactse muối ammonium sulfate 45 Bảng 3.3: Kết tinh enzyme lactase tác nhân acetone 48 Bảng 3.4: Kết tinh enzyme lactase tác nhân ethanol 50 Bảng 3.5: Kết tinh enzyme lactase tác nhân isopropanol 52 Bảng 3.6: Kết xác định hoạt tính phân đoạn thu sau tiến hành xử lý sắc ký thẩm thấu gel mẫu enzyme thô .56 Bảng 3.7: Kết tinh enzyme qua công đoạn kết tủa sắc ký thẩm thấu gel 56 Bảng 3.8: Tương quan nồng độ chất tốc độ phản ứng 62 ix Nghiên cứu thu nhận làm lactase từ Lactobacillus acidophilus 2013 men từ sữa sữa chưa, yogurt hay phơ mai pH nhân tố làm cho enzyme hoạt động 3.4.3 Độ bền nhiệt chế phẩm 100% 90% Hoạt tính cịn lại 80% 70% 60% 35 50% 40 40% 45 30% 50 20% 10% 0% 50 100 Thời gian (phút) 150 200 Hình 3.12: Độ bền hoạt tính lactase tinh theo thời gian nhiệt độ khác Khi khảo sát độ bền nhiệt chế phẩm lactase, ủ chế phẩm nhiệt độ 35oC, 40oC, 45oC 50oC sau xác định hoạt tính lactase khoảng thời gian 10, 30, 60, 90, 120, 150, 180 phút cho thấy nhiệt độ cao tốc độ giảm hoạt tính theo thời gian chế phẩm lớn Ở khoảng 35 – 40oC, sau giờ, hoạt tính cịn lại chế phẩm 50%, 50oC hoạt tính cịn 10% Chúng tỏ, chế phẩm tự thường có độ ổn định nhiệt khơng cao, khơng có tác nhân che chở, bảo vệ chế phẩm hoạt động hiệu quả, theo thời gian tác động môi trường phản ứng làm thay đổi cấu hình khơng gian enzyme, làm cho trung tâm hoạt động enzyme thay đổi, dẫn đến hoạt tính chế phẩm giảm Để làm tăng độ bền nhiệt chế phẩm dùng phương pháp cố định để tạo chất mang bảo vệ enzyme trình phản ứng (J.H German, 1997) 61 Nghiên cứu thu nhận làm lactase từ Lactobacillus acidophilus 2013 3.5 TÍNH CHẤT ĐỘNG HỌC CỦA CHẾ PHẨM Bảng 3.8: Tương quan nồng độ chất tốc độ phản ứng S (mM) V (mol/phút) 1/S (mM-1) 1/V (phút/mol) 0,6 1,22 1,67 0,82 1,2 1,68 0,83 0,60 1,8 1,9 0,56 0,53 2,4 2,03 0,42 0,49 3,0 2,12 0,33 0,47 3,6 2,21 0,28 0,45 4,2 2,35 0,24 0,43 4,8 2,37 0,21 0,42 5,4 2,44 0,19 0,41 Trong thí nghiệm xác định tính chất động học enzyme, chúng tơi sử dụng ONPG làm chất phản ứng, nồng độ chất thay đổi từ 0,6 mM – 5,4 mM Hằng số động học Vmax Km tính tốn từ phương trình Lineweaver – Burk (đồ thị 6) giá trị Vmax Km 2,3 μmol/phút 0,73 mM Hình 3.13: Đồ thị xác định Km Vmax theo phương pháp Lineaweaver Burk Trong số nghiên cứu khác tính chất động học lactase, số Michaelis Km lactase nguồn gốc từ Kluyveromyces marxianus DSM5418 Peninciulium chrysogenum 4,7mM 1,8mM (S O’Connell cộng sự, 62 Nghiên cứu thu nhận làm lactase từ Lactobacillus acidophilus 2013 2006; Nagy cộng sự, 2001) So với giá trị Km từ nghiên cứu 0,73mM, điều cho thấy khả tiếp cận chất để thủy phân enzyme lactase từ L acidophilus cao so với enzyme nguồn gốc từ Kluyveromyces marxianus DSM5418 Peninciulium chrysogenum Vì enzyme lactase mà chúng tơi thu nhận có phân tử lượng nhỏ (40 kDa), cản trở tiếp xúc chất trung tâm hoạt động enzyme yếu tố không gian hạn chế 3.6 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG THỦY PHÂN LACTOSE TRONG SỮA TƯƠI 3.6.1 Khảo sát tỷ lệ lượng chế phẩm thể tích sữa Trong mẫu sữa 10ml bổ sung chế phẩm lactase tinh với thể tích lactase tinh thay đổi từ đến ml (tương ứng hoạt tính tổng thay đổi từ 0,599U đến 3,594U) Hiệu suất thủy phân lactose tính phần trăm lactose sữa thủy phân lượng lactose có sữa ban đầu Kết quả, thay đổi hàm lượng Hiệu suất thủy phân lactose (%) chế phẩm sử dụng thủy phân lactose sữa tươi trình bày hình 3.14 70 60 55.94 50 59.60 62.47 63.58 49.81 40 34.37 30 20 Thể tích lactase (ml) Hình 3.14: Biểu diễn hiệu suất thủy phân lactose sữa tươi theo lượng enzyme lactase sử dụng Với kết trình bày hình 3.14, hiệu suất thủy phân lactose sữa tăng tăng hàm lượng chế phẩm lactase tinh từ đến 6ml hiệu suất thủy phân cao 63,58% Tuy nhiên, mẫu sữa thủy phân 5ml chế phẩm lactase đạt hiệu suất thủy phân 62,47%, phân tích ANOVA kết cho thấy hiệu suất thủy phân sử dụng 5ml chế phẩm 6ml chế phẩm khác nghĩa Điều có 63 Nghiên cứu thu nhận làm lactase từ Lactobacillus acidophilus 2013 nghĩa rằng, ta tiếp tục tăng lượng chế phẩm thủy phân lactose, hiệu suất thủy phân lúc tăng không đáng kể Nguyên nhân enzyme lactase bị ức chế ngược thành phần galactose làm cho hoạt động enzyme khơng cịn tốt trước 3.6.2 Khảo sát thời gian thủy phân lactose sữa tươi Trong thí nghiệm này, thời gian thủy phân thay đổi từ đến giờ, nhằm mục đích xác định thời gian để trình thủy phân lactose hiệu Kết Hiệu suất thủy phân lactose (%) khảo sát thời gian thủy phân lactose trình bày hình 3.15 80 70 70.452 67.791 62.470 60 50 41.290 40 30 20 Thời gian thủy phân (giờ) Hình 3.15: Biểu diễn hiệu suất thủy phân lactose theo thời gian Khi thay đổi thời gian thủy phân từ đến giờ, kết cho thấy hiệu suất thủy phân tăng dần Tuy nhiên hiệu suất thủy phân 67,79% 70,45%, giá trị khác khơng có nghĩa phân tích ANOVA nhân tố với mức ý nghĩa 5% Điều chứng tỏ, sau thủy phân lactose khoảng giờ, tiếp tục tăng thời gian thủy phân hiệu suất thủy phân tăng khơng đáng kể Ngun nhân tượng nồng độ sản phẩm cao làm cho chiều phản ứng theo hướng làm giảm nồng độ sản phẩm, tức hoạt động enzyme lactase bị kìm hãm sản phẩm mà sinh (Panesar cộng sự, 2007) Ngồi ra, cịn kéo dài thời gian thủy phân, chất béo sữa cản trở tiếp xúc lactose lactase (Roy cộng sự, 2003) 64 Nghiên cứu thu nhận làm lactase từ Lactobacillus acidophilus 2013 CHƯƠNG 4: 4.1 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Từ kết thu q trình nghiên cứu, chúng tơi có số kết luận sau:  Để kết tủa lactase sử dụng dung mơi hữu hiệu so với muối trung tính Trong đó, isopropanol có hiệu kết tủa tốt với hiệu suất thu hồi 89,93% độ tinh 4,5 lần  Tinh chế phẩm lactase sắc ký lọc gel thu chế phẩm có hoạt tính riêng 44,928 U/mg, hiệu suất thu hồi đạt 58,57% độ tinh 14,31 lần  Kết chạy điện di SDS-PAGE mẫu enzyme tinh xác định lactase có phân tử lượng 40kDa  Khảo sát tính chất chế phẩm lactase tinh sạch, xác định nhiệt độ tối ưu 40oC, pH tối ưu 7,5 Hằng số Michaelis Km 0,73 mM tốc độ phản ứng cực đại Vmax đạt 2,3 μmol/phút  Khảo sát khả thủy phân lactose sữa tươi, kết sử dụng 5ml chế phẩm lactase tinh (hoạt tính riêng 44,928 U/mg, hoạt tính tổng 2,995U) thủy phân 10ml sữa tươi đạt hiệu suất thủy phân cao 67,79% 4.2 KIẾN NGHỊ Chúng kiến nghị số hướng nghiên cứu chế phẩm lactase tinh sạch:  Khảo sát tính chất enzyme sử dụng chất lactose  Khảo sát khả ứng dụng chế phẩm số sản phẩm chứa lactose khác whey…  Bởi độ bền nhiệt chế phẩm không cao, nên cần nghiên cứu phương pháp cố định để tạo chất mang bảo vệ enzyme trình phản ứng 65 Nghiên cứu thu nhận làm lactase từ Lactobacillus acidophilus 2013 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Ali Noori Abed, Extraction and purification of β-galactosidase from new born sheep brain, Iraqi Journal of Science 50 (2010) 437 – 443 [2] A A Amirul, S L Khoo, M N Nazalan, M S Razip, M N Azizan, Purification and properties of two forms of glucoamylase from Aspergillus niger, Folia Microbiologica 42 (1996) 165-174 [3] M Amutha et al., Medicinal Use of Camellia sinensis on Lactose Intolerance, Journal of Biological Sciences 10 (2010) 112-116 [4] S.K Akolkar, A Sajgure and S.S Lele, Lactase production from Lactobacillus acidphilus, World Journal of Microbiology & Biotechnology 21 (2005) 11191122 [5] W.H.M van Casteren, M Eimermann, L A.M van den Broek et al, Purification and characterisation of a β-galactosidase from Aspergillus aculeatus with activity towards (modified) exopolysaccharides from Lactococcus lactis subsp Cremoris B39 and B891, Elservier 329 (2000) 75-85 [6] Y.H Chang, J.K Kim, H.J Kim, W.Y Kim, Y.B Kim, Y.H Park, Selection of a potential probiotic Lactobacillus strain and subsequent in vivo studies Antonie van Leeuwenhock, 80 (2001) 193-199 [7] GekasV, López-Leiva M, Hydrolysis of lactose A literature review process, Biochemistry 20 (1985) 2-12 [8] A.N Genari et al., Configuration of a bioreactor for milk lactose hydrolysis, Journal Dairy Science 86 (2003) 2783-2789 [9] Z Grosova et al., Perpectives and applications of immobilized β-galactosidase in food industry – a review, Czech J Food Sci 26 (2008) 1-14 [10] R Hatti-Kaul, B Mattiasson, Isolation and purification of Protein, Marcel Dekker, Inc (2003) 676 pages 66 Nghiên cứu thu nhận làm lactase từ Lactobacillus acidophilus 2013 [11] R.E Huber, G Kurz, K Wallenfels, A quantitation of the factors which affect the hydrolase and trasgalactosylase activities of beta-galactosidase (E coli) on lactose, Biochemistry 15 (1976) 1994-2000 [12] C.A Hus, R.C Yu, C.C Chou, Production of beta galactosidase by Bifidobacteria as influenced by various culture conditions, I J Food Microbiol, 104 (2005) 197-206 [13] Q Husain, β-Galactosidase and their potential applications: a review, Critical Reviews in Biotechnology, 30 (2010) 41-62 [14] R.H Jacobson, X.J Zhang, R.F DuBose, B.W Matthews, Threedimensional structure of β-galactosidase from E.coli, Nature 369 (1994) 761-766 [15] N Krieger, M A Taipa, E H M Melo, J L Lima-Filho, M R Aires-Barros, J M s Cabral, Purification of a Penicillium citrinum lipase by chromatographic processes, Bioprocess and Biosystems Engineering 20 (1999) 59-65 [16] Magnus M Kristjánsson, Henrik H Nielsen, Purification and characterization of two chymotrypsin-like proteases from the pyloric caeca of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss), Comparative Biochemistry and Physiology 101 (1992) 247-253 [17] J.A Kurmann, and J.L Rasic, The Health Potential of Products Containing Bifidobacteria, in Therapeutic Properties of Fermented Milks (1991) 117-157, Elsevier Applied Science Publishers, London, UK [18] O H Lowry et al., J Biol Chem 193 (1951) 265-275 [19] H Lazan, Papaya beta-galactosidase/galactanase isoforms in differential cell wall hydrolysis and fruit softening during ripening, Plant Physiology Biochemistry, 42 (2004) 847-853 [20] R R Mahoney, Galactosyl-oligosaccharides formation during lactose hydrolysis, Food Chemistry 63 (1998) 147-154 67 Nghiên cứu thu nhận làm lactase từ Lactobacillus acidophilus 2013 [21] B.W Matthews, The struture of E coli beta-galactosidase, Comptes Rendus Biologies, 328 (2005) 549-556 [22] J Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1972) 352-355 [23] B.K Mital, and S.K Garg, Acidophilus Milk Products: Manufacture and Therapeutics, Food Reviews International (1992) 347-389 [24] Z Mlichova et al., Current trends of β-galactosidase application in food technology, Journal of Food and Nutrition Research 45 (2006) 47-52 [25] N H M Rubel Mozumder, M Akhtaruzzaman, Lactas Enzyme from Lactobacillus Bacteria: A simple Technique to Isolate and Characterize from Yogurt, LAP LAMBERT Academic Publishing (2012) [26] N H M R Mozumder, M Akhtaruzzaman, M A Bakr and Fatema-TujZohra, Study on Isolation and Partial Purification of Lactase (β-Galactosidase) Enzyme from Lactobacillus Bacteria Isolated from Yogurt, Journal of Scientific Research (2012) 239-249 [27] Nagy et al , β-Galactosidase of Penicillium chrysogenum: production, purification, and characterization of the enzyme, Protein Expres Pur 21 (2001) 24-29 [28] J Natarajan, C Christobell, D.J Mukesk Kumar, M.D Balakumaran, M Ravi Kumar and P.T Kalaichelvan, Isolation and Characterization of βGalactosidase Producing Bacillus sp From Dairy Effluent, World Applied Sciences Journal 17 (2012) 1466-1474 [29] Thu-Ha Nguyen, Barbara Splechtna, Marlene Steinbock, Wolfgang, Kneifel, Hans Peter Lettner, Klaus D Kulbe, Dietmar Haltrich, Purification and Characterization of Two Novel β-Galactosidase from Lactobacillus reuteri, J Agri Food Chem 54 (2006) 4989-4998 68 Nghiên cứu thu nhận làm lactase từ Lactobacillus acidophilus 2013 [30] T A Nickerson et al., Colorimetric Estimation of Lactose and Its Hydrolytic Products, Journal of Dairy Science 59 (1975) 386-390 [31] S O’Connell, G Walsh, Purification and Properties of a β-galactosidase with potential application as a digestive supplement, Applied Biochemistry and Biotechnology 141 (2007) 1-13 [32] N Onishi, A Yamashiro, K Yokozeki, Production of galactooligosaccharide from lactose by Stengmatomyces elviae CBS8119, Appl Environ Microbiol., 61 (1995) 4022-4025 [33] P.S Panesar et al., Lactose hydrolysis in whole milk using immobilized Kluyveromyces marxianus cells, American Journal of Food Technology (2007) 288-294 [34] P.S Panesar, Production of β-galactosidase from Whey Using Kluyveromyces marxianus, Research Journal of Microbiology (2008) 24-29 [35] P.S Panesar, Enzymes in Food Processing-Fundamentals & Potential Applications, Ik International Pvt Ltd India (2010) 57-58 [36] P.S Panesar et al., Potential Applications of Immobilized lactase in Food Processing Industries, Enzyme Research 2010 (2010) 16 pages [37] R Panesar, Hydrolysis of milk lactose in a packed bed reactor system using immobilized yeast cells, J ChemTechnol Biotechnol 86 (2011) 42-46 [38] M M Patil, Mallesha, K V Ramana and A S Bawa, Characterization of partially purified β-galactosidase from Bacillus Sp MTCC-864, Recent Research in Science and Technology (2011) 84-87 [39] J.E Prenosil, E Stuker, J.R Bourne, Formation of oligosaccharides during enzymatic lactose hydrolysis, State of art Biotechnol Bioeng 30 (1987) 10191025 69 Nghiên cứu thu nhận làm lactase từ Lactobacillus acidophilus 2013 [40] M Damodara Rao, A Purnima, D.V Ramesh, C Ayyanna, Purification of αamylase from Bacillus licheniformis by chromatofocusing and gel filtration chromatograph, World Journal of Microbiology and Biotechnology 18 (2002) 457-550 [41] I Rasouli, P R Kulkarni, Partial purification and characterization of βgalactosidase from Aspergillus niger UV-5, J Sci I R Iran (1995) 14-21 [42] J.A Reinheimer, C.G Vinderola, Lactic acid starter and probiotic bacteria: a comparative “in vitro” study of probiotic characteristics and biological barrier resistance, Food Research International 23 (2003) 895-904 [43] I Roy and M.N Gupta, Lactose hydrolysis by LactozymTM immobilized on cellulose beads in batch and fluidized bed modes, Indian Institute of Technology 39 (2003) 325-332 [44] Trần Văn Giang, Nghiên cứu biểu β-galactosidase E.coli BL21, Tạp chí khoa học, Đại học Huế 55 (2009) 89-95 [45] T Vasiljevic, P Jelen, Production of β-galactosidase for lactose hydrolysis in milk and dairy products using thermophilic lactic acid bacteria, Innovative Food Sci & Emerg Technol (2001) 75-85 [46] J H Woychik et al, Use of Lactase in the Manufacture of Dairy products, Enzyme in Food and Beverage Processing (1997) 67-79 [47] Chi-san Wu, Handbook of Size Exclusion Chromatography and Related Techniques – Second Edition, Revised and Expanded, Marcell Dekker, Inc 2004 [48] Q.Z.K Zhou, X.D Chen., Effects of temperature and pH on the catalytic activity of the immobilized β-galactosidase form Klyveromyces lactic, Biochemical Enginnerring Journal (2001) 33-40 70 PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: HĨA CHẤT Các hóa chất phân tích  Ortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG) (Merck): dạng bột trắng (độ tinh khiết > 98.0 %), sử dụng để xác định hoạt tính-galactosidase  Ortho-nitrophenyl (ONP) (Merck): dạng bột màu vàng (độ tinh khiết > 98.0 %), sử dụng để dựng đường chuẩn xác định hoạt tính-galactosidase  Albumin huyết bị (Merck): dạng bột trắng (độ tinh khiết > 96.0 %), sử dụng để dựng đường chuẩn xác định hàm lượng protein hòa tan  Methylamine-HCl (Merck): dạng bột rắn màu trắng (độ tinh khiết > 98.0 %), sử dụng để xác định hàm lượng lactose sữa  Thuốc thử Folin (Merck): dung dịch màu vàng, sử dụng để xác định hàm lượng protein hịa tan  Hóa chất phân tích loại Pha hóa chất dùng phân tích  ONPG 3mM: Cân 0,905g hòa tan 1000ml đệm  ZAPT: Hòa tan 25g zinc acetate 12,5g acid phosphotungstic nước, thêm 20ml acid glacial acetic định mức lên 100ml  Đệm Glycine-NaOH: Hỗn hợp 150ml dung dịch glycine gồm 2,4768g glycine 1,9359g NaCl hòa với 850ml NaOH (0,385M) điều chỉnh pH 12,7  Dung dịch Na2SO31% (w/v): 1g Na2SO3 hòa thành 100ml nước cất  Dung dịch Methylamine-HCl 5%(w/v): 5g Methylamine-HCl hòa tan thành 100ml nước cất, lưu trữ 4oC  Dung dịch CaCl2 0,075M: 8,325g hòa tan thành 1000ml nước cất  Dung dịch NaCl 0,85%: 8,5g hòa tan thành 1000ml nước cất PHỤ LỤC 2: ĐƯỜNG CHUẨN Đường chuẩn protein Nồng độ 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,052 0,187 0,294 0,394 0,462 0,562 0,640 0,723 protein (mg/ml) OD 0.8 y = 1.8661x + 0.0874 R² = 0.9924 0.7 0.6 OD 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 Nồng độ protein (mg/ml) 0.30 0.35 0.40 Đường chuẩn nồng độ protein OD Đường chuẩn nồng độ ONP OD [ONP] μmol/ml OD 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,14 0,16 0,18 0,085 0,159 0,237 0,324 0,4 0,471 0,553 0,629 0,706 0.8 y = 3.9129x + 0.0043 R² = 0.9998 0.7 0.6 0.5 OD 0.4 0.3 0.2 0.1 Nồng độ ONP (µmol/ml) 0 0.04 0.08 0.12 0.16 0.2 Đường chuẩn nồng độ ONP OD Đường chuẩn nồng độ lactose OD [Lactose] (mg/ml) OD 0,75 1,25 1,5 1,75 0,174 0,240 0,298 0,367 0,421 0.45 y = 0.2427x - 0.0028 R² = 0.9993 0.40 0.35 0.30 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00 0.00 Hàm lượng lactose (mg/ml) 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 Đường chuẩn nồng độ hàm lượng lactose OD 1.75 PHẦN LÝ LỊCH TRÍCH NGANG THƠNG TIN CÁ NHÂN Họ tên: NGUYỄN THỊ VÂN LINH Ngày, tháng, năm sinh: 14/01/2988 Nơi sinh: TP HCM Địa liên lạc: 3.4 lô C, Ấp 2, đường Lương Định Của, F An Phú, Q.2, TP HCM QUÁ TRÌNH ĐÀO TẠO: 09/2006 – 04/2011: Theo học chương trình đại học chuyên ngành Công nghệ thực phẩm trường Đại học Bách Khoa TP.HCM 08/2011 – nay: Theo học chương trình đào tạo sau đại học – thạc sĩ chuyên ngành công nghệ thực phẩm đồ uống trường Đại học Bách Khoa TP.HCM Q TRÌNH CƠNG TÁC: 05/2011 – nay: Công tác trường Đại học Nguyễn Tất Thành TP HCM, ngày 24 tháng 01 năm 2013 Nguyễn Thị Vân Linh ... phân 28 Nghiên cứu thu nhận làm lactase từ Lactobacillus acidophilus 2013 2.4 THUYẾT MINH QUY TRÌNH THU NHẬN VÀ LÀM SẠCH LACTASE 2.4.1 Chuẩn bị nguyên liệu Lên men thu nhận tế bào L acidophilus. .. (GPC) Agilent 1100series, máy khuấy từ 26 Nghiên cứu thu nhận làm lactase từ Lactobacillus acidophilus 2013 2.2 QUY TRÌNH THU NHẬN VÀ LÀM SẠCH LACTASE Giống L acidophilus Hoạt hóa mơi trường MT1... bị dụng cụ .26 2.2 QUY TRÌNH THU NHẬN VÀ LÀM SẠCH LACTASE 27 2.3 SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU .28 2.4 THUYẾT MINH QUY TRÌNH THU NHẬN VÀ LÀM SẠCH LACTASE .29 2.4.1 Chuẩn