CÁC PHƯƠNG PHÁP về xây DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG nấm LINH CHI

CÁC PHƯƠNG PHÁP về xây DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG nấm LINH CHI CÓ TÀI LIỆU THAM KHẢO CỤ THỂ CÁC PHƯƠNG PHÁP về xây DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG nấm LINH CHI CÓ TÀI LIỆU THAM KHẢO CỤ THỂ CÁC PHƯƠNG PHÁP về xây DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG nấm LINH CHI CÓ TÀI LIỆU THAM KHẢO CỤ THỂ

1 \ CÁC PHƯƠNG PHÁP VỀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG NẤM LINH CHI \ MỤC LỤC CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .3 2.3.1 Phương pháp đánh giá tính dược liệu nấm linh chi Cổ co a Xác định hàm lượng polysaccharides thô b Xác định hàm lượng protein phương pháp Lowry c Phương pháp định tính alkaloid d Phương pháp định tính hợp chất saponin e Định tính triterpenoid (phản ứng LiebermannBurchard) 2.3.2 Xác định hoạt tính kháng khuẩn 2.3.3 Xác định khả kháng oxy hóa của nấm linh chi Cổ co a Thử hoạt tính chống oxy hóa bằng phương pháp reducing power 2.3.4 Phương pháp xây dựng quy trình nhân giống nấm linh chi Cổ co.10 a Phương pháp phân lập thể nấm .10 b Phương pháp nhân giống cấp I khảo sát sự ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng giống cấp I 12 c Phương pháp nhân giống cấp II khảo sát sự ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến quá trình nhân giống cấp II .13 2.3.5 Phương pháp đo sự phát triển chiều dài hệ sợi tính tốc độ lan sợi theo thời gian 14 2.3.6 Phương pháp xử lý số liệu 14 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 Phương pháp đánh giá tính dược liệu nấm linh chi Cổ co a Xác định hàm lượng polysaccharides thô Hàm lượng polysaccharides được xác định theo phương pháp của Sun và cộng sự (2006) Lấy 1g mẫu bột nấm linh chi Cổ cò chiết soxhlet giờ với dung môi ethanol 80 % để loại bỏ tạp chất màu, protein tự bất hoạt enzyme Phần cặn được cho vào bình tam giác 250ml và thêm vào 30ml nước cất sau đó chiết sạch bằng sóng siêu âm ở 60 oC 30 phút Dịch chiết được thêm 40ml ethanol 95%, ủ qua đêm ở 4oC để kết tủa polysaccharides Định tính polysaccharides bằng phương pháp soi màu: Tiến hành hòa tan kết tủa polysaccharides với 3ml nước cất, 1ml phenol và 7ml acid H2SO4 ủ bể ủ nhiệt 4oC 30 phút rồi làm lạnh về nhiệt độ phòng và tiến hành soi màu máy quang phổ ở bước sóng 485 nm Mẫu đối chứng có thành phần mẫu phân tích không có polysaccharides Hàm lượng polysaccharides được xác định dựa đường chuẩn D-glucose b Xác định hàm lượng protein phương pháp Lowry - Nguyên tắc: Phương pháp này dựa sở phức chất đồng protein khử hỗn hợp photphomolipden – photphovonphramat (thuốc thử Folin – ciocalteu) tạo phức chất màu xanh da trời có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 660nm Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ protein một phạm vi nhất định Dựa vào mức độ hấp thụ quang học của protein chuẩn, ta có thể xác định được hàm lượng protein mẫu nghiên cứu - Hoá chất cần dùng: + Dung dịch A: 0,4g NaOH (0,1M) và 2g Na2CO3 (2%) pha 100ml nước cất + Dung dịch B: 0,05g CuSO4.5H2O (0,5%) pha dung dịch Natri Xitrat (1%) hoặc dung dịch Natri, Kali Tactơrat 1% + Dung dịch C: Hỗn hợp của hai dung dịch A và B theo tỉ lệ 49:1 (pha trước dùng) + Th́c thử folin, trước dùng pha lỗng hai lần cho độ axit bằng 1N và albumin huyết bò 1mg/ml - Cách tiến hành Lấy chính xác 0,5ml dịch chứa protein với hàm lượng thích hợp cho vào ống nghiệm, thêm vào đó 2ml dung dịch C, lắc đều để yên 10 phút Sau đó thêm vào hỗn hợp ống nghiệm 0,25ml folin pha loãng lần, lắc đều và để yên 30 phút, màu vàng của hỗn hợp chuyển sang màu xanh da trời và đạt đến cường độ màu cực đại Đem so màu của hỗn hợp máy đo quang ở bước sóng 660nm Xác định được trị số mật độ quang học (OD) của dung dịch nghiên cứu Đo máy lần lặp lại và lấy trị số trung bình Mẫu đối chứng ta lấy 0,5ml đệm cho vào ống nghiệm, thêm vào đó 2ml dung dịch C và bước tiếp theo được tiến hành mẫu thí nghiệm - Xây dựng đường đồ thị chuẩn Hàm lượng protein tan dung dịch được xác định theo phương pháp Lowry, dùng albumin huyết bò (BSA) làm chất chuẩn 6 Cân 0,01g (10mg – albumin huyết bò) hoà tan 10ml nước, ta được dung dịch gớc có nờng đợ là 1mg/ml Sau đó pha lỗng dung dịch gốc bằng nước cất với các nồng độ 20, 40, 60, 80, 100, 120 µg/ml để tiến hành xây dựng đồ thị chuẩn Mẫu thí nghiệm: lấy chính xác 0,5ml dung dịch BSA ở nờng đợ pha lỗng cho vào ống nghiệm, thêm vào ống 2ml dung dịch C để ở nhiệt độ phòng 10 phút, sau đó cho 0,25ml thuốc thử folin (1N) đem so màu với bước sóng 660nm Mẫu đối chứng: lấy 0,5 ml nước cất cho vào ống nghiệm, thêm vào đó 2ml dung dịch C và các bước tiếp theo được tiến hành mẫu thí nghiệm Kết ta thu được có phương trình hồi quy y = ax + b Vẽ đồ thị đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc của OD với hàm lượng protein Dựa vào đồ thị đường chuẩn có thể xác định được hàm lượng protein mẫu nghiên cứu c Phương pháp định tính alkaloid - Phần 1: Quả thể nấm linh chi Cổ cò được sấy khô sau đó nghiền thành bột Cân (10 – 20 g) bột nấm ngâm dung dịch H 2SO4 bình tam giác, đun nhẹ hổn hợp giờ Sau đó tiến hành lọc thu dịch chiết rồi tiến hành thử với thuốc thử Mayer Quan sát hiện tượng nếu có kết tủa màu vàng bỏ Mayer vào chứng tỏ dịch chiết nấm linh chi Cổ cò có alkaloid Tuy nhiên nếu không có kết tủa chưa khẳng định được nấm linh chi Cổ cò không có alkaloid - Phần 2: Bột xay nhuyễn (10 – 20 g) ngâm dung dịch prollius là hỗn hợp gồm: chloroform: ethanol 95%: NHOH đậm đặc (theo tỷ lệ là 8:8:1) Ngâm nguội 24 giờ, ở nhiệt độ phòng, lắc trộn Lọc và đuổi dung môi đến cạn, thu được cặn Hòa tan cặn dung dịch HCl 1%, đun ấm cho dễ tan Lọc và lấy dịch lọc để thử nghiệm với loại thuốc thử Mayer, Dragendorff - Thuốc thử Mayer: Hòa tan 1,36g HgCl 60 ml nước cất và 5g KI 10 ml nước cất Thu hỗn hợp dung dịch này lại và thêm nước cất cho đủ 100ml Nhỏ vài giọt thuốc thử Mayer vào dung dịch acid loãng có chứa alkaloid, nếu có chứa alkaloid thì xuất hiện tủa màu trắng hoặc vàng nhạt - Thuốc thử Dragendorff: Hỗn hợp hòa tan 8g Nitrat bismuth Bi(NO3)3 25ml HNO3 30% (D = 1,18) Hỗn hợp hòa tan 28g KI 1ml HCl 6N 5ml nước cất Trộn hỗn hợp ta được dung dịch màu cam - đỏ được chứa bình sậm màu để che sáng, cất tủ lạnh Nhỏ thuốc thử Dragendorff vào dung dịch acid loãng có chứa alkaloid có alkaloid xuất tủa màu cam - nâu [16] d Phương pháp định tính hợp chất saponin Chiết g dược liệu với cồn 70% (1:20) cách ngâm 24 lọc giấy lọc Cô quay dịch đến cặn khô Dùng cặn để làm phản ứng định tính saponin - Thử nghiệm tính tạo bọt Tạo bọt mợt đặc tính quan trọng saponin, dựa vào tính chất phương pháp xác để định tính sự diện saponin Hòa tan một lượng cặn rắn tương ứng với g dược liệu vào 5ml nước nóng, lọc vào một ống nghiệm để nguội, thêm nước cho đủ 10 ml, đậy miệng ống nghiệm lắc mạnh theo chiều dọc ống nghiệm phút Để yên ống nghiệm tiến hành quan sát lớp bọt bề mặt chất lỏng: Bọt bền 15 phút: + Bọt bền 30 phút: ++ Bọt bền 60 phút: +++ - Thử ngiệm phương pháp Fontan – Kaudel Lấy một lượng cặn rắn tương ứng với 1g bột dược liệu, đun cách thủy hòa tan với 10 ml nước Chia vào ống nghiệm Ống 1: thêm ml HCl 0.1 N (pH = 1) Ống 2: thêm ml NaOH 0.1 N (pH= 13) Bịt ống nghiệm lắc mạnh theo chiều dọc ống phút để yên, quan sát cột bọt ống nghiệm Nếu cột bọt ống nghiệm ngang bền thì sơ bợ kết luận có saponin triterpenoid Nếu ống pH = 13 có cợt bọt cao nhiều so với ống pH = 1, sơ bợ xác định có saponin steroid [12] e Định tính triterpenoid (phản ứng LiebermannBurchard) Chiết -10 g bột dược liệu diethylether lắc bình tam giác, 10 – 20 phút, chiết dịch ether bốc hết không để lại vết mờ mặt kính, gợp dịch chiết, lọc lại dung môi cong lại khoảng 50 ml dịch chiết ether Lấy ml dịch chiết ether cho vào bình tam giác,rồi cho bốc tới cắn Sau hòa tan cắn với 0,5 ml anhydrid acetic, thêm vào dung dịch 0,5ml chloroform Chuyển dung dịch vào ống nghiệm khô, dùng pipet thêm cẩn thận – ml H2SO4 đậm đặc lên thành ống nghiệm để nghiêng cho acid chảy xuống đáy ống nghiệm Nơi tiếp xúc lớp dung dịch có màu đỏ nâu hay đỏ đến tím, lớp phía dung dịch chuyển thành màu xanh lục hay tím ta kết luận có triterpenoid 2.3.2 Xác định hoạt tính kháng khuẩn Sử dụng chủng chuẩn vi khuẩn E.coli, tiến hành thử khả kháng khuẩn của dịch chiết theo phương pháp khuếch tán đĩa thạch Sử dụng dịch chiết từ thể khơng pha lỗng và dịch chiết pha lỗng 20 lần, đới chứng khơng sử dụng dịch chiết Nồng độ chất chiết tạo vòng vô khuẩn ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn 2.3.3 Xác định khả kháng oxy hóa của nấm linh chi Cổ co a Thử hoạt tính chống oxy hóa bằng phương pháp reducing power Lần lượt cho vào mỗi ống nghiệm: Dịch chiết : - 2ml; 2ml dung dịch etanol 96%; 2ml dung dịch đệm photphate (0,2M, pH=6,6), 2ml Kali ferricyanide 1% sau: 10 Bảng 2.1 Cách bố trí thí nghiệm thử hoạt tính chớng oxy hóa phương pháp reducing power Ống Ống Ống Ống Ống 0,5 1,5 Nước cất (ml) 2,5 1,5 0,5 Etanol 96% 2 2 2 2 2 2 2 Dịch chiết nấm linh chi Cổ co Đệm photphate (0,2M, pH=6,6) (ml) Kali ferricyanide 1% (ml) Lắc sau ủ 300C 30 phút Thêm vào hỗn hợp ml Trichloacetic acid 10%, đem li tâm tốc độ 3000 vòng/phút 10 phút Cuối lấy ml dung dịch ly tâm pha với ml dung dịch etanol 96% 0,5 ml Ferric chloric 0,1% Đo độ hấp thụ dung dịch với thiết bị UV-Vis bước sóng 700nm [5]  Tính toán kết quả AAI = Trong đó: AAI: số chống oxy hóa; Rsample : Mật đợ quang mẫu 11 Rcontrol: Mật độ quang mẫu kiểm chứng b Phương pháp xác định khả ức chế peroxy hóa lipid (thử nghiệm MDA) [11] Chuẩn bị dịch chiết cao cồn nấm linh chi Cổ cò cách chiết hồi lưu soxhlet bột nguyên liệu với cồn 96% theo tỷ lệ 1:15 (dược liệu:dung môi), dịch chiết được cô quay chân không thu được cao cồn Xác đinh khả ức chế peroxy hóa lypid dịch chiết nấm linh chi Cổ cò qua việc xác định hàm lượng malonyl dialdehyd (MDA), sản phẩm trình peroxy hóa lipid màng tế bào Lượng MDA sinh có khả phản ứng với acid thiobarbituric (NH.CO.CH2.CO.NH.CS) để tạo thành phức hợp trimethin có màu hồng có đỉnh hấp thu cực đại bước sóng 532 nm Lấy 0,1 ml mẫu dịch chiết nồng độ thử nghiệm khác cho phản ứng với ml dịch đồng thể gan thêm dung dịch đệm phosphat 50 mM vừa đủ ml Ủ hỗn hợp phản ứng 37oC 15 phút dừng phản ứng ml acid tricloacetic 10% Sau ly tâm 12000 vòng/phút phút lấy dịch cho phản ứng với ml acid thiobarbituric 0,8% theo tỉ lệ (2:1) ủ điều kiện 15 phút nhiệt độ 100oC Làm lạnh tiến hành đo mật đợ quang bước sóng 532 nm [13] Vitamin C được sự dụng làm chất đối chứng  Phương pháp toán kết quả Công thức tính % hoạt tính chống oxy hóa (HTCO): 12 HTCO% = [(ODC– ODT) / ODc] x 100 ODC: Mật độ quang chứng dung môi (DMSO hay MeOH) ODT: Mật độ quang mẫu thử Các số liệu kết thử nghiệm được biểu thị trị số trung bình lần khác 2.3.4 Phương pháp xây dựng quy trình nhân giống nấm linh chi Cổ co a Phương pháp phân lập thể nấm Chọn tai nấm điển hình và ở giai đoạn trưởng thành, để dễ đánh giá chất lượng giống Tai nấm được gọt sạch chất bẩn bám ở chân nấm Sau đó lau cồn, tách đôi lấy phần thịt nấm để được mô thịt Mô thịt nấm tách ở vị trí kín đáo, ít tiếp xúc với các nguồn bệnh nhất Cho mô thịt lên môi trường thạch nghiêng hoặc thạch petri, nuôi ủ ở nhiệt độ phòng, kiểm tra tạp nhiễm Từ phân lập ta thu được giống gốc Môi trường phân lập gồm: - Môi trường Bán tổng hợp: Khoai tây : 200g Glucose : 20g KH2PO4 : 3g MgSO4 : 1,5g H2O : lít Agar : 20g 13 Khoai tây được rửa sạch sau đó gọt vỏ rồi tiến hành thái nhỏ, đun sôi từ 20 – 30 phút tiến hành lọc loại bỏ bã khoai tây thu dịch Sau đó cân lượng hóa chất đúng theo tỷ lệ và bổ sung nước cất cho đủ lượng cần dùng, đun sôi cho tan hết thạch agar, rót vào các ống nghiệm, đậy nút bông, rồi hấp khử trùng 1atm, 121oC thời gian là 20 phút - Môi trường PDA: Khoa tây : 200g Glucose : 20g Pepton : 2g Cao nấm men : 2g Nước : lít Agar : 20g Khoai tây được rửa sạch sau đó gọt vỏ rồi tiến hành thái nhỏ, đun sôi từ 20 – 30 phút tiến hành lọc loại bỏ bã khoai tây thu dịch Sau đó cân lượng hóa chất đúng theo tỷ lệ và bổ sung nước cất cho đủ lượng cần dùng, đun sôi cho tan hết thạch agar, rót vào các ống nghiệm, đậy nút bông, rồi hấp khử trùng 1atm, 121oC thời gian là 20 phút - Môi trường Hansen Khoai tây : 200g Glucose : 20g Pepton : 2g MgSO4 : 2g K2SO4 : 2g Nước : lít 14 Agar : 20g Khoai tây được rửa sạch sau đó gọt vỏ rồi tiến hành thái nhỏ, đun sôi từ 20 – 30 phút tiến hành lọc loại bỏ bã khoai tây thu dịch Sau đó cân lượng hóa chất đúng theo tỷ lệ và bổ sung nước cất cho đủ lượng cần dùng, đun sôi cho tan hết thạch agar, rót vào các ống nghiệm, đậy nút bông, rồi hấp khử trùng 1atm, 121oC thời gian là 20 phút b Phương pháp nhân giống cấp I khảo sát sự ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng giống cấp I Dùng que cấy vô trùng chuyển mẫu giống từ ống giống gốc sang môi trường cấp I Mỗi ống giống gốc nhân được 10 - 15 đĩa giống cấp I Giống cấp I được nhân loại môi trường khác sau đó tiến hành khảo sát tốc độ lan tơ để khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm theo chu kỳ ngày tiến hành quan sát đo tốc độ lan tơ Môi trường khảo sát gồm: - Môi trường thạch - khoai tây (PDA): khoai tây 200g, glucose 20g, pepton 2g, cao nấm men 2g, agar 20g, nước cất lít - Môi trường thạch - khoai tây, cám gạo (PDA-C): khoai tây 200g, glucose 20g, pepton 2g, cao nấm men 2g, cám gạo 20g, agar 20g, nước cất lít - Môi trường thạch - khoai tây, rơm (PDA-R): khoai tây 200g, glucose 20g, pepton 2g, cao nấm men 2g, agar 20g, nước cất lít - Môi trường Hansen (HS): Khoai tây 20g, glucose 50g, pepton 10g, K2HPO4 3g, MgSO4 7H2O 2,5g, cao nấm men 1g, agar 20g, nước cất lít 15 - Môi trường Bán tổng hợp (BTH): khoai tây 200g, glucose 20g, KH2PO4 3g, MgSO4 1,5g, agar 20g, nước cất 1lít Tất các môi trường được khử trùng bằng nồi hấp ở 1210C, 25 phút, atm c Phương pháp nhân giống cấp II khảo sát sự ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến quá trình nhân giống cấp II  Khảo sát ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến quá trình nhân giống cấp II Dùng que cấy vô trùng chấn 1/4 - 1/3 phần giống ống giống cấp I và chuyển phần đó sang môi trường cấp II Hơ miệng chai và hơ nhanh nút của chai lửa đèn cồn và đậy nút lại [20] Trong nghiên cứu này giống cấp II được nhân môi trường Sau đó tiến quan sát và đo tốt độ lan tơ theo chu kỳ ngày đề đánh giá khả phát triển của nấm môi trường khảo sát - Môi trường dạng hạt với chất là thóc (MT1) MT1: Thóc bổ sung CaCO3 1,5%, cám gạo 5%, bột ngô 5% - Môi trường dạng que với chất là que sắn (MT2) MT2: Que sắn bổ sung CaCO3 1,5%, cám gạo 5%, bột ngô 5% - Môi trường dạng que với chất là lõi ngô (MT3) MT3: Lõi ngô bổ sung CaCO3 1,5%, cám gạo 5%, bột ngô 5% Các môi trường sử dụng cho giống cấp II sau được xử lý và được phân bố vào các chai có thể tích 250ml (chai có kích thước dài 13cm, đường kính 5cm) Tất môi trường được hấp ở 121 0C, 1atm 25 phút Giống nấm linh chi Cổ cò được bảo quản thạch nghiêng ở 100C Mỗi tháng cấy chuyển một lần và giữ hoạt tính ổn định của giống [4], [16]  Đánh giá cảm quan hệ sợi nấm 16 Đánh giá cảm quan hệ sợi nấm theo phương pháp cho điểm quan sát, so sánh công thức đối chứng rồi cho điểm theo tiêu chí đánh giá bảng sau: 17 Bảng 2.2 Chỉ tiêu đánh giá cảm quan mật độ hệ sợi Rất dày Dày Hơi dày Bình Mỏng Rất mỏng thường  Đánh giá tỷ lệ nhiễm quá trình nhân giống cấp II - Xác định tỷ lệ nhiễm Tỷ lệ nhiễm được xác định qua công thức: Tổng số chai nhiễm Tổng số chai được nuôi cấy 2.3.5 Phương pháp đo sự phát triển chiều dài hệ sợi tính tốc độ lan sợi theo thời gian Cứ 2-3 ngày đo hệ sợi lần bằng thước có độ chia 1mm 2.3.6 Phương pháp xử lý số liệu Các kết phân tích được tính toán và xử lí bằng toán thống kê sinh học chương trình MS- Excel-2013 và SPSS với độ tin cậy 95% Danh mục tài liệu tham khảo Tiếng Việt [1] Đỗ Huy Bình (2004), "Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam – tập II", Nhà xuất bản Khoa học Kỹ thuật Hà Nội 2004 [2] Trương Thị Mỹ Chi, Nguyễn Thị Thu Hương "Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa in vitro in vivo mợt số loài nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) nấm vân chi 18 (Trametes Versicolor))", Trung tâm Sâm Dược liệu Tp HCM – Viện Dược liệu, tr 135-141 [3] Nguyễn Thượng Dong (2005), "Nghiên cứu một số tác dụng sinh học ba loài nấm linh chi Ganoderma applanatum (Pers.) Pat.; G lobatum (Schw.) Atk vaf G lucidum (Leyss ex Fr) Karst" [4] Nguyễn Lân Dũng (2004), "Công nghệ nuôi trồng nấm , tập I , II", NXB nông nghiệp [5] Cao Ngọc Điệp, Võ Văn Phước (2011), "Phân lập nhận diện vi khuẩn phân giải cellulose", Tạp chí khoa học, tâp 18a, tr 177-184 [6] Nguyễn Hữu Đống, Đinh Xuân Linh, Nguyễn Thị Sơn (2000), "Nấm ăn – sở khoa học công nghệ nuôi trồng", Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội [7] Lê Trung Hiếu, Trương Thị Như Tâm, Nguyễn Thị Ái Huyền, Lê Thùy Trang (2014), "Bước đầu nghiên cứu đánh giá khả kháng oxy hố mợt số đối tượng làm nguồn dược liệu", Tạp chí khoa học cơng nghệ, trường đại học khoa học Huế, tr 20-30 [8] Trần Hùng (2004), "Phương pháp nghiên cứu dược liệu", Đại học Y Dược Tp.Hờ Chí Minh [9] ThS Ngun Minh Khang (2010), "Cơng nghệ ni trồng nấm", Đại học Bình Dương, Bình Dương [10] Nguyễn Phương Đại Nguyên (2015), "Đa dạng thành phần loài chi Ganoderma vườn quốc gia Kon Ka Kinh tỉnh Gia Lai, Việt Nam", Hội nghị khoa học 19 tồn q́c sinh thái tài ngun sinh vật lần thứ 6, tr 738-742 [11] Nguyễn Thị Ngọc Hằng Nguyễn Thị Thu Hương (2010), Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa theo hướng bảo vệ gan nấm linh chi đỏ (Ganoderma lucidum), Trung tâm Dược liệu Tp HCM- Viện Dược liệu, tr 129 - 134 [12] Nguyễn Như Quỳnh (2006), "Tìm hiểu một loại nấm linh chi thu hái Thủ Đức – Tp Hồ Chí Minh" [13] Viện Dược liệu – Bợ Y Tế (2006), "Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý thuốc từ Dược thảo", NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội, tr 279-292 [14] Lê Xuân Thám (2010), "Nấm cơng nghệ chuyển hóa mơi trường – Nấm linh chi Ganoderma lucidum Donk", Nhà xuất bản Khoa học Và Kỹ Thuật, Hà Nội [15] Lê Xuân Thám (1996), "Nghiên cứu đặc điểm sinh học đặc điểm hấp thu khoảng nấm Linh chi Ganoderma lucidum (Leyss.ẽ Fr)Kát phân tích hạt nhân đánh dấu đồng vị kỹ thuật liên hợp", ĐH Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội [16] Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn (2009), "Giáo trình modun nhân giống nấm, Hà Nội" [17] Nguyễn Phúc Thuận (2001), "Giáo trình sinh hóa, phần 1", Nhà xuất bản Đại học Q́c Gia Tp Hờ Chí Minh 20 [18] ThS Tạ Bích Thuận (2007), Đánh giá mợt số tính chất sinh y học nấm Linh Chi Ganoderma lucium, Đại học Khoa học Tự nhiên (ĐHQG Hà Nội) [19] Cồ Thị Thùy Vân (2015), "Nghiên cứu quy trình phân lập, nhân giống dạng dịch thể để nuôi trồng nấm đầu khỉ (hericium erinaceus (Bull.: FR) PERS.) tách chiết mợt số polysaccharide có hoạt tính sinh học" [20] Nguyễn Lân Dũng (2004), Cơng nghệ nuôi trồng nấm , tập I , II NXB nông nghiệp Tiếng Anh [21] Adams M., Plitzko I., Zimmermann S., Brun R., Kaiser M., Hamburger "Antiplasmodial M., Lanostanes Christen from the M (2010), Ganoderma lucidum Mushroom", pp 897-900 [22] Afyon A., Yaiz D., Helfer S., Konuk M (2005), "A study of wood decaying macrofungi of the western Black Sea Region", Turkey, pp 319-322 [23] Agarwal K., Verma S., Chakarborthy G S (2012), "In vitro antioxidant activity of different extract of Ganoderma lucidum " 3(1) 24] Boh B., Zhang J., Zhi-Bin L., Berovic M (2007), "Ganoderma lucidum and its pharmaceutically active compounds" 13, pp 265-301 [25] Carlos A.Z.C., Fabisan C.N.A., Jorge R-C., Melva L-L., Maria X.R-B., Marisa C.R.R (2011), "Optimizing a culture medium for biomass and phenolic compounds 21 production using Ganoderma lucidum", an Journal of Microbiology 44(1), pp 215-223 [26] Claudia I.M., James o., Navindra P.S., David H., Koeffler p., Takashi K (2006), "Ganoderma lucidum causes apoptosis in leukemia, lymphoma and multiple myeloma cells", Leukemia Research, pp 841-848 [27] Chee W.L, Angelo V., Sheot H.C (2011), "Feed- forward neural analysis for network the assisted spectroscopic by discriminant discriminantion of cracked spores Ganoderma lucidum", A prospective biotechnology production tool, AMB Express [28] Cheng P-G., Sabaratnam V., Abdullah N., Abdulla M.A., Kuppusamy U.R., Phan C-W (2013), "Polysaccharides-Rich Extract of Ganoderma lucidum (M.A Curtis:Fr.) P Karst Accelerates Wound Healing in Streptozotocin-Induced Diabetic Rats", Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine [29] Cheng P-G., Sabaratnam V., Abdullah N., Abdulla M.A., Kuppusamy R.U., Phan C.W (2013), "Polysaccharides-Rich Extract of Ganoderma lucidum (M.A Curtis:Fr.) P Karst Accelerates Wound Healing in treptozotocin-Induced Diabetic Rats" [30] Du M., Hu X.S., Zhao GH., Wang C (2008), "Biological properties of different protein extracts from selenium-enriched Ganoderma lucidum" 59(2), pp 134-147 22 [31] Helenoa S.A., Martinsa A.,Queiroz R.P.J.M., Barrosa L (2012), "ruiting body, spores and in vitro produced mycelium of Ganoderma lucidum from Northeast Portugal: A comparative study of the antioxidant potential of phenolic and polysaccharidic extracts", Food Research International 46, pp 135-140 [32] Helenoa A.S., Vaz A J., Almeida M.G., Tavares.C (2006), "Ganoderma lucidum methanolic extract: chemical characterization in phenolic compounds and study of growth inhibitory activity in human tumour cell lines" 49, pp 159-170 [33] Hexiang Wang (2010), "Ganodermin, an antifungal protein from fruiting bodies of the medicinal mushroom Ganoderma lucidum", Peptides 27, pp 27-30 [34] H., Hirokazu M., Iwata N., Kamiuchi S., Suzuki F, Iizuka Hibino Y., Okazaki M., Shimizu Y (2013), "Antidepressant-like effects of a water-soluble extract from the culture medium of Ganoderma lucidum mycelia in rats", BioMed central [35] Jayasinghe C., Hur H., Lee G.W., Lee TS., Lee UY., Imtiaj A (2008), "Favorable Culture Conditions for Mycelial Growth of Korean Wild Strains in Ganoderma lucidum" 36(1), pp 28-33 [36] Jia J, Hua Y.S., Wu Y., Wang Q-Z., Li N-N., Guo Q-C., Dong X-C., Zhang X (2009), "Evaluation of in vivo antioxidant activities of Ganoderma lucidum 23 polysaccharides in STZ-diabetic rats", Food Chemistry, pp 32-36 [37] Jiang J, Valachovicova T, Harvey K, Sliva D., Slivova V (2004), "Ganoderma lucidum Suppresses Growth of Breast Cancer Cells Through the Inhibition of Akt/NF-κB Signaling", pp 209-216 [38] Jiang J., Valachovicova T., Harvey Slivova V (2004), "Ganoderma K., Sliva D., lucidum inhibits proliferation and induces apoptosis in human prostate cancer cells PC-3", pp 1093-1099 [39] Ko H-H., Wang "Antiinflammatory J-P., triterpenoids Hung and C-F (2007), steroids from Ganoderma lucidum and G tsugae", Article in press 69, pp 234-239 [40] Lin H-J., Lin L-H., Haung C-F., Wu C-Y., Ou K-L., Chang Y-S (2014), "An Immunomodulatory Protein (Ling Zhi-8) from a Ganoderma lucidum Induced Acceleration of Wound Healing in Rat Liver Tissues after Monopolar Electrosurgery" [41] Lin J-M., Chen M-F., Ujiie T., Takada A., Lin C-C (1995), "Radical scavenger and antihepatotoxic activity of Ganoderma formosanum", Journal of Ethnopharmacology, pp 33-41 [42] Liu G-Q., Han W-J., Lin Q-L., Wang X-L (2012), "Improving the Fermentation Production of the Individual Key Triterpene Ganoderic Acid Me by the 24 Medicinal Fungus Ganoderma lucidum in Submerged Culture, Molecules" 17, pp 12575-12586 [43] Ma B., Zhou Y.,Ma J., Ruan Y., Wen C-N., Ren W (2011), "Triterpenoids from the spores of Ganoderma lucidum", NCBI 3(11), pp 495 - 498 [44] Paterson R., Russell M (2006), "Ganoderma – A therapeutic fungal biofactory", Phytochemistry", pp 1985-2001 [45] Saltarelli R., Lotti M., Zambonelli A., Buffalini M., Casadei L., Vallorani L., Stocchi V., Ceccaroli P (2009), "Biochemical characterisation and antioxidant activity of mycelium of Ganoderma lucidum from Central Italy", Food Chemistry, pp 143-151 [46] Sandrina A H., Anabela M., Maria J.R.P.Q., Celestino S-B., Isabel C.F.R F., Lillian B (2012), "Fruiting body, spores and in vitro produced mycelium of Ganoderma lucidum from Northeast Portugal: A comparative study of the antioxidant potential of phenolic and polysaccharidic extracts", Food Research International, pp 135-140 [47] Sandrina A.H., Ana P.E., Ana C., Jasmina G., Anabela M, Marina S., Maria R.P.Q., Isabel C.F.R.F (2013), "Antimicrobial and demelanizing activity of Ganoderma lucidum extract, p-hydroxybenzoic and cinnamic acids and their synthetic acetylated glucuronide methyl esters", Food and Chemical Toxicology, pp 95-100 25 [48] Wong KL., Chan P., Chang LP., Liu CF., Chao HH (2004), "Antioxidant activity of Ganoderma lucidum in acute ethanol-induced heart toxicity" 18(12) [49] Xu Z., Zhong Z., Chen L., Wang Y., Chen X (2011), "Ganoderma lucidum polysaccharides: immunomodulation and potential anti-tumor activities" 39(1), pp 15 - 27 [50] Yegenoglu H., Oke F., Aslim B (2011), "Comparison of Antioxidant Capacities of Ganoderma lucidum (Curtis) P Karst and Funalia trogii (Berk.) Bondartsev & Singer by Using Different In Vitro Methods", Journal Of Medicinal Food, pp 512-16 [51] Zaidman.Z-B., Nevo E., Mahajna J., Solomon P.W (2007), "Androgen receptor-dependent and -independent mechanisms mediate Ganoderma lucidum activities in LNCaP prostate Chemistry, pp 959-967 cancer cells", Foof ... nấm linh chi Cổ co a Thử hoạt tính chống oxy hóa bằng phương pháp reducing power 2.3.4 Phương pháp xây dựng quy trình nhân giống nấm linh chi Cổ co.10 a Phương. .. biểu thị trị số trung bình lần khác 2.3.4 Phương pháp xây dựng quy trình nhân giống nấm linh chi Cổ co a Phương pháp phân lập thể nấm Chọn tai nấm điển hình và ở giai đoạn trưởng... 14 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 Phương pháp đánh giá tính dược liệu nấm linh chi Cổ co a Xác định hàm lượng polysaccharides