Sản xuất axit acetic từ tinh bột sắn bằng phương pháp lên men vi sinh vật

Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành di truyền - Vi sinh Phần I đặt vấn đề Một số vi khuẩn có khả năng trao đổi chất đặc biệt, thể hiện ở sự tổng hợp, chuyển hoá, phân huỷ các chất, đợc con ngời sử dụng để sản xuất thực phẩm, đồ uống và một số sản phẩm khác, dần dần hình thành công nghiệp vi sinh vật, trong đó các vi sinh vật đợc sử dụng trong những lĩnh vực khác nhau của kỹ thuật. ở đây vi sinh vật đợc xem là những tác nhân cơ bản, trực tiếp của sự chuyển hoá hoá học ở cơ chất này hay cơ chất khác để thu nhận đợc những sản phẩm quan trọng có giá trị thực tế bằng con đờng lên men chuyển hoá. Trong những năm gần đây, trong công nghệ vi sinh vật ngời ta đã chú ý đến việc sản xuất các axit hữu cơ bằng con đờng chuyển hoá các hợp chất gluxit dới tác dụng của các vi sinh vật. Những axit hữu cơ đợc chú ý là những axit dùng trong thực phẩm (nh axit xitric, axit lactic, axit malic, axit itaconic) và những axit có ý nghĩa trong công nghiệp nh axit gluconic (tạo nguyên liệu hoá học mới). (Phan Cự Nhân (chủ biên) 2004) Đặc biệt axit acetic là một trong những hoá chất công nghiệp quan trọng, với sản lợng chừng 3,0 triệu tấn/năm, đợc sản xuất và tiêu thụ trên thế giới. Đối với axit axetic là loại axit hữu cơ không gây độc hại. ở nồng độ 1,7- 2% có khả năng ức chế sự thối rữa do vi khuẩn. ở nồng độ 5 - 6% nó diệt đợc những vi khuẩn không sinh bào tử. Axit acetic đợc con ngời sản xuất và sử dụng rất nhiều trong các ngành công nghiệp hoá chất, công nghiệp thực phẩm nh sản xuất tinh dầu chuối, dứa . và trong công nghệ muối rau quả. Axit acetic còn đợc sử dụng nhiều trong y d- ợc, đợc dùng làm dung môi trong công nghiệp sơn . Hàng năm trên thế giới có một lợng axit acetic khổng lồ đợc sản xuất. Năm 1980 tổng sản lợng axit acetic thu đợc bằng phơng pháp vi sinh vật trên toàn thế giới( trừ Nga và Trung Quốc) là 160.000 tấn. Sản lợng axit acetic của Phạm Thị Hải Thu 1 Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành di truyền - Vi sinh Châu Âu (năm 2004) là 876.000 tấn/năm (876kt/a) và ở Nhật Bản sản xuất 589 kt/a. Tổng sản lợng axit acetic trên toàn thế giới đợc ớc tính khoảng hơn 2mt/a (http://www.google.com.vn). Trong sản xuất axit acetic bằng công nghệ sinh học ngời ta đi từ rợu và đi từ nguyên liệu phụ phẩm của sản xuất nông nghiệp. Đây là những nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm và tận dụng những sản phẩm d thừa sẵn có trong sản xuất nông nghiệp, công nghiệp thực phẩm, lại cho năng suất và hiệu quả cao. Sản xuất axit acetic bằng phơng pháp tổng hợp hoá học và chng cất gỗ rất tốn kém tiền của, công sức, trang thiết bị và nguồn nguyên liệu. Vì thế, nhờ có công nghệ sinh học hiện đại, công nghệ sản xuất axit acetic bằng phơng pháp vi sinh học ngày càng đợc quan tâm sử dụng phổ biến và đem lại giá trị kinh tế cao. Nên việc sản xuất axit acetic bằng phơng pháp vi sinh học trở nên cần thiết và có ý nghĩa thực tiễn rất lớn. Từ đó chúng tôi đã chọn đề tài "Sản xuất axit acetic từ tinh bột sắn bằng phơng pháp lên men vi sinh vật". Mục tiêu: Sản xuất axit acetic bằng phơng pháp lên men là vấn đề mà công nghệ sinh học (CNSH) và công nghệ vi sinh (CNVS) đang tập trung khai thác, song do thời gian và cơ sở vật chất, khả năng còn hạn chế nên trong đề tài này nhằm giải quyết những vấn đề sau: 1- Tìm hiểu và phân lập vi khuẩn acetic từ môi trờng tự nhiên. Từ đó tìm ra chủng vi khuẩn acetic có hoạt tính mạnh nhất. 2- Nghiên cứu một số chỉ tiêu liên quan đến khả năng tổng hợp axit acetic từ nguồn cơ chất - bột sắn của chủng vi khuẩn acetic có hoạt tính mạnh nhất. 3- Sản xuất axit acetic trong điều kiện tối u hoá. 4- Làm quen và hoàn thiện dần phơng pháp nghiên cứu khoa học và khả năng thực hành thí nghiệm. Đề tài này đợc làm tại phòng thí nghiệm vi sinh vật khoa sinh học Đại học Vinh ngày 22/08/2005 đến 30/04/2006. Phạm Thị Hải Thu 2 Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành di truyền - Vi sinh Với sự giúp đỡ tận tình quý báu của thầy giáo Nguyễn Dơng Tuệ, cán bộ phòng thí nghiệm Di truyền - vi sinh - phơng pháp, các thầy, cô trong tổ Di truyền - vi sinh - phơng pháp, các thầy cô giáo trong khoa sinh và các bạn bè đồng nghiệp. Do bớc đầu làm quen với công tác nghiên cứu nên không tránh khỏi những khiếm khuyết. Rất mong nhận đợc sự góp ý của các thầy cô và bạn bè đồng nghiệp. Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu của thầy giáo Nguyễn D- ơng Tuệ, cảm ơn cán bộ phòng thí nghiệm Di truyền - vi sinh, các thầy cô giáo trong khoa đã hết sức giúp đỡ, tạo điều kiện để em hoàn thành đề tài này, cảm ơn sự quan tâm, giúp đỡ, động viên của các bạn bè đồng nghiệp trong suốt thời gian qua. Vinh, ngày 20 tháng 04 năm 2006. Sinh viên thực hiện Phạm Thị Hải Thu Phạm Thị Hải Thu 3 Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành di truyền - Vi sinh Phần II Tổng quan tài liệu I - Sơ lợc về vi khuẩn lên men acetic Ngày nay ngời ta đã biết tới hơn 20 loài vi khuẩn có khả năng lên men acetic, chúng đợc gọi bằng tên chung là vi khuẩn acetic. Những vi khuẩn này dễ tìm thấy trong không khí, đất và nớc. Vì vậy, các dịch nớc hoa quả, bia, rợu có nồng độ thấp, dịch đờng, rau, da . để hở tiếp xúc với không khí dễ bị vẩn đục nhẹ, trên bề mặt tạo thành một lớp màng mỏng mịn màu trắng hoặc vàng xám. Đó là do vi khuẩn acetic phát triển. Trớc đây, Lui Pasteur cho rằng quá trình lên men giấm do một loại vi sinh vật gây ra và đợc gọi là Mycoderma aceti. Sau này ngời ta đã biết đó là nhiều loài vi khuẩn thuộc nhóm Acetobacter hoặc Bacterium. Vi khuẩn acetic là: Những trực khuẩn hình que. Kích thớc 0,5 x 80 m à . Không sinh bào tử. Hiếu khí bắt buộc (chúng phát triển thành váng trên các môi trờng dịch thể). Vi khuẩn acetic là những vi khuẩn Gram âm. Chúng thờng xếp thành chuỗi dài hoặc đứng một mình hoặc thành cặp. Các vi khuẩn này có loài không chuyển động và có loài chuyển động với tiên mao ở cực hoặc vòng quanh cơ thể. Vi khuẩn acetic có đặc điểm là dễ thay đổi hình dáng tế bào. Trong những điều kiện sinh trởng không thuận lợi các tế bào của chúng có hình dạng không bình thờng: những tế bào kéo dài, phân nhánh, phình trơng lên hoặc những tế bào có hình dạng kì lạ (tế bào dị hình). Vì vậy ngời ta thờng gọi vi Phạm Thị Hải Thu 4 Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành di truyền - Vi sinh khuẩn acetic là bọn đa hình tế bào từ hình elip, tới hình que thẳng hoặc hơi cong, tới những hình thù quái gở. Nhiệt độ tối thích đối với sinh trởng của các vi khuẩn acetic nằm trong khoảng 20 - 35 0 C. Vi khuẩn acetic có tính chịu axit cao, các vi khuẩn này trao đổi chất thực hiện ở pH môi trờng thấp, một số loài vẫn phát triển tốt ở pH bằng 3,2. Điều này phân biệt chúng với các vi khuẩn khác. Các vi khuẩn acetic thờng gặp có hình sợi dài, kết thành màng trên bề mặt cơ chất do khả năng tạo nhầy với vỏ tế bào. A.pasteurianum tạo thành màng có bề mặt khô nhăn nheo. A. xylium có hình hạt thô dày. Một số loại vi khuẩn acetic lại không tạo màng dày đặc, mà chỉ tạo thành các màng mỏng trên bề mặt dịch, hoặc tạo thành các vòng ở thành bình nuôi cấy. Một số loài bao nhầy tạo thành sắc tố, một số loài bao nhầy tạo thành xelluloza nh ở vi khuẩn Acetobacter xylium bao nhầy đợc cấu tạo bởi xelluloza. Ngời ta dùng loại bao nhầy này để ăn, khi nuôi cấy A.xylium trên nớc dừa. Loại sản phẩm có hơng vị cùi vải, cùi nhãn này có tên là "Natodecoco". Hiện nay ngời ta mô tả đợc tới 20 loài vi khuẩn acetic thuộc giống Acetobacter, trong đó các loài quan trọng là: A.aceti, A.pasteurianum, A.orleanens, A.xylium, A.schutzenbachii. Những tế bào vi khuẩn này khác nhau về kích thớc tế bào, tính chịu đựng cồn, khả năng tạo axit acetic trong môi trờng và nhiều đặc tính khác. A.aceti tích tụ trong môi trờng tới 60% axit acetic A.orleanens tích tụ trong môi trờng tới 9,5% A.schutzenbachii tích tụ trong môi trờng tới 11,5% A.xylium tích tụ trong môi trờng tới 4,5% Khả năng chịu cồn của các loài vi khuẩn này cũng khác nhau: A.aceti, A.schutzenbachii nuôi ở môi trờng có nồng độ cồn tới 9 - 11%, nhng A.xylium chỉ ở 5 - 7%. Phạm Thị Hải Thu 5 Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành di truyền - Vi sinh Một số loài có khả năng sinh tổng hợp vitamin B 1 , B 2 , B 12 . Nhng nhiều loài cần có vitamin làm chất sinh trởng có trong môi trờng mà trớc hết là axit pantotenic. Những vi khuẩn acetic không những oxy hoá đợc rợu etylic thành axit acetic mà còn oxy hoá đợc rợu propionic thành axit propionic, rợu butylic thành axit butylic, nhng chúng không oxy hoá đợc rợu metylic và những rợu bậc cao. Trong môi trờng đủ rợu etylic (5 - 13%) thì sản phẩm chủ yếu là axit acetic nếu nồng độ rợu thấp hơn các vi khuẩn oxy hoá triệt để rợu thành CO 2 và H 2 O. (Lơng Đức Phẩm 2000). Các loại Acetobacter chứa 5 đặc điểm: - Có mặt Catalaza. - Oxy hoá etanol qua axit axetic tới CO 2 và H 2 O. - Oxy hoá lactat thành cacbonat. - Oxy hoá glyxerol thành đihyđroxyaxeton photphat và sản sinh axit gluconic từ glucoza. Các vi khuẩn trong chi Acetobacter đợc chia thành 4 nhóm: - Oxy hoá mạnh - Oxy hoá - Oxy hoá trung bình - Oxy hoá yếu Trong quá trình lên men acetic làm sao hạn chế đợc sự có mặt của A.pasteurianum và A.perooxidans. Vì 2 loài này tích lũy axit acetic tạm thời. (Nguyễn Dơng Tuệ 2000) Vi khuẩn acetic rất hiếu khí. Tốc độ sinh trởng của chúng rất nhanh, từ một tế bào sau 12 giờ có thể phát triển thành 17 triệu tế bào. Trong quá trình sinh trởng và phát triển chúng tạo thành axit acetic và nồng độ axit thấp lại kích thích sự sinh trởng của chúng. Vì vậy, trong sản xuất giấm có thể dùng rợu không cần thanh trùng đợc bổ sung một ít axit acetic để kích thích sự sinh trởng và phát triển của vi khuẩn acetic.(Lơng Đức Phẩm- 2000) II - Vai trò của axit acetic và tình hình sản xuất axit acetic Phạm Thị Hải Thu 6 Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành di truyền - Vi sinh 1 - ứng dụng của axit acetic. Axit acetic có nhiều ứng dụng trong đời sống con ngời. Axit acetic là nguyên liệu để tổng hợp nhiều sản phẩm quan trọng khác nh: Các este, metylaxetat, etylaxetat, propylaxetat, butylaxetat,các loại axetyl. Các loại este glyxerin, các chất này đợc dùng làm dung môi hay là những nguyên liệu ban đầu cho quá trình sản xuất một số chất khác nh làm dung môi trong công nghệ sơn. Alđehyd acetic đợc dùng với một số lợng rất lớn trong sản xuất axetat xellulôza và từ hợp chất này tổng hợp nên lụa nhân tạo, sơn nhân tạo ,tổng hợp hợp chất dẻo, tơ sợi và phim không cháy, các chất tạo hình thuỷ tinh không vỡ. Axit acetic đợc dùng để điều chế một số muối axetats kim loại, dùng làm chất mầu trong công nghiệp nhuộm (nh nhôm axetat, sắt axetat, crôm axetat), làm nguyên liệu sản xuất bột sơn (nh đồng axetat, chì axetat). (Lê Xuân Trọng, Võ Văn Tòng 1999). Axit acetic đợc dùng để tổng hợp indigo ( chất chàm) và nhiều chất khác của công nghệ hoá học tinh vi. Axit acetic đợc dùng để tổng hợp các chất diệt cỏ (nh 2, 4 diclo phenoxy acetic), các chất này đợc dùng rộng rãi trong nông nghiệp, dùng trong sơ chế mủ cao su. Axit acetic còn đợc dùng để điều chế một số este làm chất thơm( nh acetat isoamyl). Đặc biệt axit axetic làm thuốc chữa bệnh, đợc sử dụng trong công nghiệp dợc sản xuất aspirin, antiphibrin, fenaxetin và nhiều chất khác . Gần đây, ngời ta bắt đầu dùng axit acetic để hoà tan chitozan, vật thay thế trong việc hồ vải. ở Việt Nam axit acetic đợc dùng chủ yếu để chế biến mủ cao su thành cao su bán thành phẩm. Trong công nghiệp thực phẩm: một nguyên liệu không thể thiếu đó là giấm (axit acetic loãng) chỉ đợc sản xuất bằng con đờng lên men. Axit acetic còn đợc dùng trong chế biến đồ hộp, hoặc dùng với rau tơi trong các bữa ăn Phạm Thị Hải Thu 7 Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành di truyền - Vi sinh Axit acetic cùng với axit propyonic để điều chế chất bảo quản ngô tơi làm thức ăn cho gia súc. (Nguyễn Thành Đạt 1999) Nh vậy axit acetic có giá trị ứng dụng rất lớn, axit acetic đợc sử dụng nhiều trong công nghiệp hoá chất ,công nghiệp thực phẩm, trong y dợc và trong công nghiệp sơn 2 - Tình hình sản xuất axit acetic Từ thời thợng cổ ngời ta đã biết chế tạo axit acetic ở dạng giấm. Tuy nhiên khoảng 200 năm gần đây ngời ta mới biết điều chế đợc axit acetic đậm đặc. Axit acetic có khoảng 3% trong giấm. Thời xa ngời ta để chua rợu vang để tạo thành giấm. Giấm đợc tạo thành từ một dung dịch rợu vang để tĩnh ,ngời ta cho sự biến đổi này là một quá trình lên men cho nên gọi là quá trình lên men acetic. Về thực chất đây là quá trình oxy hoá đợc thực hiện bởi nhóm vi khuẩn acetic. (Nguyễn Lân Dũng 2000). Những năm 50 của thế kỷ XX axit acetic chủ yếu đợc sản xuất bằng ph- ơng pháp tổng hợp hoá học và chng khô gỗ.Sau những năm 60 cùng với sự tăng nhịp độ phát triển công nghiệp dầu mỏ trên thế giới, việc tận dụng các sản phẩm dầu mỏ trong công nghiệp sản xuất axit acetic làm tăng đáng kể lợng axit này. ở Mỹ và Tây Đức sản lợng axit acetic năm 1973 tăng ba lần so với năm 1960, ở Nhật Bản tăng 7 lần. Nhiều nớc đã tìm đến giải pháp thu nhận axit acetic bằng phơng pháp vi sinh với sản lợng đáng kể. Tính riêng năm 1980 tổng sản lợng axit acetic thu đợc bằng phơng pháp vi sinh trên thế giới( trừ Nga và Trung Quốc) là 160.000 tấn. Riêng ở Việt Nam nhu cầu về giấm và axit acetic rất lớn. Nhu cầu tổng cộng về axit acetic lên trên 3.000 tấn/năm. Việc cung cấp axit acetic hiện nay hoàn toàn bằng con đờng nhập khẩu. Trớc tình hình đó, việc tìm kiếm những biện pháp khả thi sản xuất giấm năng suất cao và axit acetic đang đợc quan tâm. (Đinh Thị Kim Nhung 1996) Phạm Thị Hải Thu 8 Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành di truyền - Vi sinh Ngày nay có nhiều hình thức sản xuất axit acetic với quy mô vừa, nhỏ, quy mô gia đình và quy mô công nghiệp. Hàng năm nhân loại tiêu thụ một lợng giấm tơng đơng với 160.000 tấn axit acetic tinh khiết (hay 3,2 tỷ lít giấm chứa 5% axit acetic). Còn có một khối lợng lớn axit acetic đậm đặc đợc sản xuất ở quy mô công nghiệp để sử dụng trong các ngành công nghiệp (sản xuất các loại este, các loại axetyl, axetaldehyl, axetat, xenlulôza, tổng hợp indigo, tổng hợp chất diệt cỏ, tổng hợp aspirin và nhiều dợc phẩm khác, chế biến mủ cao su thành cao su bán thành phẩm). (Nguyễn Lân Dũng 2000). Từ giấm bằng phơng pháp chng cất ngời ta thu đợc axit axetic, mỗi năm trên thế giới sản xuất đợc khoảng 3 triệu tấn (riêng bằng phơng pháp vi sinh vật : 250.000 tấn). (Nguyễn Thành Đạt 2000). Sản lợng sản xuất axit acetic của Châu Âu (năm 2004) là 876.000 tấn/năm (876kt/a) và Nhật Bản sản xuất 589kt/a. Tổng sản lợng toàn thế giới đ- ợc ớc tính khoảng hơn 2mt/a.(www://google.com.vn) III - Quá trình lên men acetic 1 - Bản chất của quá trình lên men acetic Lên men acetic hay lên men giấm thực chất là quá trình oxy hoá hiếu khí rợu etylic thành axit acetic dới tác của vi khuẩn lên men (vi khuẩn acetic) gồm một số loài thuộc chi Acetobacter. Phơng trình tổng quát của quá trình lên men: CH 3 CH 2 OH + 2 1 O 2 CH 3 COOH + H 2 O + 117kcal Thực chất quá trình này rất phức tạp gồm 2 giai đoạn với enzym của vi khuẩn acetic tham gia xúc tác. Giai đoạn 1:Rợu etylic đợc chuyển thành axetaldehyl Giai đoạn 2: Axetaldehyl đợc hydrat hoá thành axit axetic Phạm Thị Hải Thu 9 Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành di truyền - Vi sinh Phản ứng: CH 3 CH 2 OH + 2 1 O 2 CH 3 CHO + H 2 O CH 3 CHO + H 2 O CH 3 CH(OH) 2 CH 3 CH(OH) 2 + 2 1 O 2 CH 3 COOH + H 2 O Rợu etylic nhờ xúc tác của enzym oxy hoá khử bị oxy hoá thành axetaldehyl. Hợp chất này đợc tiếp tục biến đổi thành axit acetic nhờ ảnh hởng của hệ alhydrogenaza oxy hoá. Trong 2 giai đoạn oxy hoá này các electron đợc giải phóng đều đợc chuyển đến các coenzym của các enzym tơng ứng, khử NADP + thành NADPH và H + . Có ý kiến cho rằng sự có mặt của NADPH đã ngăn cản sự oxy hoá tiếp tục axit acetic đến CO 2 và H 2 O. (Nguyễn Thành Đạt -2000) Nh vậy điện tử NADP nhận và qua xitocrom của chuỗi hô hấp đợc chuyển đến O 2 là chất nhận điện tử cuối cùng. Từ trớc đến nay chúng ta xếp quá trình lên men acetic thuộc lên men hiếu khí nhng thực chất đây là một quá trình chuyển hoá.Vi sinh vật sử dụng cơ chất etanol và chuyển thành axit acetic. NADPH 2 xuất hiện trong quá trình này đợc chuyển hoá qua chuỗi hô hấp để thu nhận năng lợng, song cơ chất bị phân huỷ không hoàn toàn, trong đó oxy là chất nhận điện tử. Do đó quá trình này còn đ- ợc gọi là sự oxy hoá không hoàn toàn. Loại chuyển hoá này có thể trải qua nhiều bớc vì thế axit acetic là sản phẩm chuyển hoá. (Nguyễn Dơng Tuệ -2000) 2 - Vai trò của vi khuẩn acetic và lên men acetic. Lên men acetic thực chất là quá trình oxy hoá rợu thành axit acetic nhờ một nhóm vi khuẩn gọi là vi khuẩn acetic (thuộc chi Acetobacter). Nhờ có các enzym của vi khuẩn acetic xúc tác cho các phản ứng chuyển hoá. Hiện nay trên thế giới có 4 phơng pháp lên men acetic. Phơng pháp1: Lên men chậm Phơng pháp này đợc gọi là phơng pháp chum hở, phơng pháp Orleans hay phơng pháp Pháp. Quá trình này đợc thực hiện ở Pháp bằng cách lên men Phạm Thị Hải Thu 10 . xuất axit acetic từ tinh bột sắn bằng phơng pháp lên men vi sinh vật& quot;. Mục tiêu: Sản xuất axit acetic bằng phơng pháp lên men là vấn đề mà công nghệ sinh. giải pháp thu nhận axit acetic bằng phơng pháp vi sinh với sản lợng đáng kể. Tính riêng năm 1980 tổng sản lợng axit acetic thu đợc bằng phơng pháp vi sinh