Bước đầu nghiên cứu sản xuất axit axetic bằng phương pháp lên men vi sinh vật trên tinh bột khoai

Phần I Đặt vấn đề Từ thời thợng cổ ngời ta đà biết sản xuất dấm khoảng hai kỷ gần ngời ta biết sản xuất axit axetic dạng đậm đặc axit axetic (axit etanoic) có khoảng 3% dấm, loại axit quan trọng loại axit hữu cơ, axit axetic có nhiều ứng dụng loại axit rẻ tiền nhất, đợc dùng nhiều công nghiệp hoá chất, công nghiệp thực phẩm, sản xuất tinh dầu, thuỷ tinh không vỡ, dung môi để pha sơn axit axetic đợc sản xuất phơng pháp nh: Chng cất gỗ, tổng hợp hoá học phơng pháp lên men công nghệ sinh học phơng pháp sản xuất lên men chiếm u Theo Nguyễn Lân Dũng (1981) vi khuẩn axetic thờng gặp là: Acetobacter.aceti, Acetobacter.xylium, Acetobacter.schutzenbachii, Acetobacter.orleanense, Acetobacter.xyboxydans, Acetobacter.pasteurianum Nguồn tiêu thụ chủ yếu axit axetic là: Làm dấm ăn (dấm ăn chứa tới 4,5% axit axetic) làm đông đặc nhựa mủ cao su, làm chất dẻo tơ sợi xenlulo acetat - làm phim ảnh không nhạy lửa, làm chất nhựa kết dính polivinyl acetat, làm phẩm màu, dợc phẩm, nớc hoa tổng hợp, acetat nhôm dùng làm chất cầm mầu (mordant) nghề nhuộm, điều chế axeton, thuỷ hoài sâm, axit tricloaxetic (CCl 3-COOH) làm thuốc trừ cỏ dại, este axetic (CH3COOR) dùng làm dung môi, vinyl axetat (CH=CHCOOH-CH2) để tổng hợp polime vinyl axetat §Ỉc biƯt hiƯn ngêi ta sư dơng axit axetic để điều trị bệnh ung th gan cách tiêm axit axetic qua da, axit axetic có tác dụng gây hoại tử khối u, vào máu hạn chế đợc phạm vi lan tràn, gây hoại tử tế bào lành (http.www.vinaseek.com) Cũng theo Nguyễn Lân Dũng (2000) hàng năm nhân loại tiêu thụ lợng dấm tơng đơng 160.000 axit axetic tinh khiết (hay 3,2 tØ lÝt dÊm chøa kho¶ng 5% axit axetic) [4] Do nhu cầu sử dụng axit axetic ngày nhiều mà sản xuất theo phơng pháp hoá học tốn kém, mà sản lợng lại thấp, giá thành lại cao Cho nên axit axetic đợc sản xuất phơng pháp lên men công nghệ vi sinh vật, phơng pháp tận dụng đợc nguyên liệu rẻ tiền nh: rỉ đờng, sắn, khoai, phế thải nông nghiệp Trong giới hạn đề tài sử dụng nguyên liệu khoai lang để sản xuất axit axetic Theo Lê Ngọc Tú (2000) khoai lang nông nghiệp quen thuộc nhiều nớc Châu nớc ta, có giá trị kinh tế cao, nớc ta sau lúa ngô khoai lang nguồn quan träng cung cÊp tinh bét cho ngêi vµ gia súc [16] Vòng đời sinh trởng ngắn, kỹ thuật canh tác đơn giản, đầu t Mục tiêu: Từ lí tiến hành nghiên cứu đề tài: Bớc đầu nghiên cứu sản xuất axit axetic phơng pháp lên men vi sinh vật tinh bột khoai nhằm - Phân lập nuôi cấy chủng vi khuẩn axetic - Tìm hiểu hoạt tính vi khuẩn axetic - Xác định số lợng khuẩn lạc - Sản xt axit axetic tõ nguyªn liƯu bét khoai - RÌn luyện cho thân số kỷ thực hành, thí nghiệm, làm quen với phơng pháp nghiên cứu khoa học Phần II Tổng quan tài liệu I.Khái niệm lên men Lên men theo nghĩa hẹp trình phân giải hydrat cacbon để thu lợng, hyđrô đợc tách từ chất, cuối đợc chuyển đến chất nhận hợp chất hữu Oxy phân tử không tham gia vào trình lên men Vì Paxtơ (pasteur) nói: Lên men sống không không khí, lên men đảm bảo tồn sống mà khí trái đất cha có oxy (Warburg O.1959) Rõ ràng lên men khác với trình hô hấp, hô hấp hiếu khí oxy hoá không hoàn toàn [8] Lên men theo nghĩa rộng trình trao đổi chất qua mà chất hữu mà trớc tiên đờng bị biến đổi dới tác dụng enzim vi sinh vật [16] Bản chất trình lên men trình cung cấp lợng hợp chất trung gian cho tÕ bµo vi sinh vËt Nhng tÕ bào sống sử dụng dạng hoá táng trữ mạch cacbon đợc giải phóng phản ứng enzim chuyển hoá electron từ mức lợng sang mức lợng khác Nh lên men trình oxy hoá - khử có enzim xúc tác hay nói cách khác trình CH3CHO hydrat ho¸ CH3CH(OH)2 Aldehit dehidrogenaza CH3COOH + 2H2 hydrat axetaldehit axit axetic H2 đợc NADP nhận qua xitocrôm chuỗi hô hấp đợc chuyển cho O2 chất nhận Từ trớc đến ngời ta xếp trình thuộc lên men hiếu khí nhng thực chất trình chuyển hoá: vi sinh vật sử dụng chất etanol chuyển thành axit axetic NADP H2 xét trình có lẽ đợc chuyển hoá qua chuỗi hô hấp để thu lợng Quá trình đợc coi trình oxy hoá không hoàn toàn chất bị phân giải không hoàn toàn, O chất nhận H2 [13] Ngoài oxy hoá rợu etylic, vi khuẩn axetic có khả oxy hoá nhiều chất khác Chẳng hạn, oxy hoá butanol thành axit butylic, oxy hoá propanol thành axit propionic, glyxerin thµnh dioxyaxeton, manit thµnh fructoza, socbit thµnh socboza, eritrit thành eritruloza, gluroza thành axit gluconic dÉn xt cđa nã, axit lactic thµnh axit pyruvic VÝ dô: CH2OH CH2OH C OH C H OH OH C H OH C H CH2OH CH2OH Eritrit Eritruloza Đặc biệt đáng ý trình oxi hoá socbit thành socboga, nhữn giai đoạn quan trọng oxi hoá - khư sinh häc [ 16] II B¶n chÊt cđa trình lên men axetic Ngời ta gọi trình chuyển hoá rợu thành axit axetic trình lên men axetic trình lên men dấm, nhng thực trình oxi hoá trình lên men vì: NAD CH3CH2OH NADH2 (1) CH3 _ (0) CHO (2) CH3COOH (1) alconđehyđrogenaza (2) Oxydaza Vi khuẩn gây trình lên men axetic (vi khn axetic) thc vỊ mét gièng riªng - giống Acetobacter họ Pseudomonadaceae Đó trực khuẩn hình que, kích thớc khoảng 0,5 x 8,0 mm, đầu có tiên mao, di động (có loài tiên mao không di động), không sinh bào tử, hiếu khí bắt buộc (phát triển thành váng môi trờng dịch thể) Vi khuẩn axetic sinh tế bào dài tế bào có hình dạng kỳ lạ (tế bào dị hình) Năm 1862, L.Pasteur ngời khám phá chế trình lên men axetic, trình oxy hoá hiếu khí rợu etylic thành axit axetic theo phơng trình chung sau: CH3CH2OH + O = CH3COOH + H2O 2 Thùc chất trình gồm phản ứng với enzim vi khuẩn axetic xúc tác nh đà nªu ë trªn III Vi sinh vËt lªn men Axetic Ngày ngời ta biết đến 20 loài vi khuẩn có khả lên men axetic chúng đợc gọi tên chung vi khuẩn axetic Những vi khuẩn phân bố rộng rÃi khắp nơi, tìm thấy không khí, đất, nớc, với hạt bụi, bề mặt thực vật, Vì dịch nớc quả, bia, rợu thấp, dịch ®êng ®Ĩ hë tiÕp xóc víi kh«ng khÝ dƠ bị đục nhẹ, bề mặt tạo thành lớp màng mỏng trắng xám vàng xám Đó vi khuẩn axetic phát triển Vi khuẩn axetic phân bố rộng rÃi khắp nơi chúng có khả đồng hoá nhiều nguồn thức ăn cacbon khác (etanol, glyxerin, glucoza, Fructoza, manit, lactoza, mantoza, saccaroza ), kh«ng cã khả sử dụng tinh bột Đa số loài vi khuẩn axetic đòi hỏi phải cung cấp thức ăn đạm hữu (peptit, axit amin), có vài loài có khả đồng hoá đạm vô [6] Trớc L.Pasteur cho trình lên men dấm loại vi sinh vật gây đợc gọi Mycoderma aceti Sau ngời ta đà biết ®ã lµ vi khn thc nhãm Acetobacter cđa Bacterium Vi khuÈn axetic thuéc chi Acetobacter hä Acetobacteriaceae, hä nµy chi Acetobacter có chi Gluconobacter Hai chi ®Ịu cã thĨ sinh trëng ë pH = 4,5, ®Ịu oxy hoá etanol thành axetic pH = 4,5 nhng Acetobacter cã tiªn mao kiĨu chu mao (peritrichons) Gluconobacter có tiên mao kiểu cực mao (polas) Ngoài khác với Acetobacter, chi Gluconobacter chu trình ATC (axit tricacboxylic) đầy đủ hiều khí không oxy hoá đợc axetat [4] Vi khuẩn axetic oxy hoá đợc rợu etylic thành axit axetic mà oxy hoá đợc rợu propionic thành axit propionic, rợu butylic thành axit butyric nhng chúng không oxy hoá đợc rợu metylic rợu bậc cao Trong môi trờng đủ rợu etylic 5,13% sản phẩm chủ yếu axit axetic, nồng độ rợu thấp vi khuẩn axetic oxy hoá triệt đệ thành CO2 H2O Vi khuÈn axetic rÊt hiÕu khÝ, tèc ®é sinh trëng rÊt nhanh tõ mét tÕ bµo sau 12 giê cã thể phát triển thành 17 triệu tế bào trình sinh trởng, phát triển chúng tạo thành axit axetic nồng độ axit thấp lại kích thích sinh trởng chúng Vì vậy, sản xuất dấm dùng rợu không cần trùng đợc bổ sung axetic để axit hoá môi trờng [13] Vi khuẩn axetic có dạng hình que, tạo thành hình dạng kéo dài, phân nhánh, phình to lên chúng không hình thành bào tử, thờng xếp thành chuỗi dài Một số loài di động, số loài không di động chịu axit cao, số phát triển pH = 3,2, thực trao đổi chất pH thấp điều phân biệt chúng với vi khuẩn khác, vi khuẩn axetic bọn đa hình tế bào từ hình elip tới hình que thẳng cong 0,5 - 0,8 x 0,9 - 4,2 m, chúng bọn hiếu khí bắt buộc, số tạo thành sắc tố, số tạo thành xenluloza Ngời tìm cách phân loại vi khuẩn axetic Hansen (1894) Ngày vi khuẩn axetic đợc phân loại vào hai giống là: Acetobacter Gluconobacter Các loài Acetobacter có đặc điểm: Có mặt cactalaza, oxy hoá etanol qua axit axetic tới CO H2O, oxy hoá lactat thành cacbonat, oxi hoá glixerol thành DHP sản sinh axit glucomic từ glucoza Các vi khuẩn chi Acetobacter thờng đợc chia thành nhóm: Oxi hoá mạnh, oxi hoá, oxi hoá trung bình, oxi hoá yếu [2] Từ trớc đến đà có nhiều tác giả đề cập đến vấn đề phân loại vi khuẩn giống Acetobacter (Rothenbach - 1898, Beizeneinck - 1890, Hoyer - 1899, Hansen - 1911) Nhng đáng ý bảng phân loại J.Franteur (1950) Những loài Acetobacter quan trọng là: Acetobacter aceti Acetobacter pasteurianum Acetobacter orleanense Acetobacter xylium Acetobacter schutzenbachii Acetobacter suboxydans Acetobacter cuvrum Các vi khuẩn axetic đợc gộp chung giống Acetobacter, vi khuẩn khác kích thớc tế bào, tính chịu đựng cồn, khả tạo axit axetic môi trờng nhiều đặc tính khác Ví dụ: A.aceti tích tụ m«i trêng tíi 6% axit axetic, A.orleanense 9,5%, A.schutzenbachii 11,5%, A.xylium 4,5% khả chịu cồn khác Ví dụ: A.aceti A.schutzenbachii nuôi môi trờng có nồng ®é cån tíi - 11%, nhng A.xylium chØ cã - 7% Nhiệt độ tối thích hợp cho sinh trởng loài vi khuẩn axetic nằm khoảng 20 -35 0C Một số loài có khả sinh tổng hợp vitamin B1, B2, B12 nhng nhiều loài cần có vitamin làm chất sinh trởng có môi trờng trớc hết cần axit pantotenic [12] Các vi khuẩn axetic thờng gặp có hình sợi dài kết thành màng bề mặt chất, khả tạo nhầy tế bào nh: A.pasteurianum tạo thành màng có bề mặt khô, nhăn nheo A.xylium có hình hạt, thô dày số loài vi khuẩn axetic lại không tạo màng dày đặc mà tạo thành mảnh nhỏ bề mặt dịch tạo thành vòng thành thùng nuôi cấy Những vi khuẩn axetic có đặc điểm đẽ thay đổi hình dạng tế bào Trong điều kiện sinh trởng không thuận lợi tế bào chúng có hình dạng không bình thờng nh: Dạng sợi to dài, phồng trơng lên, có hình thù quái gỡ khác Theo Nguyễn Thành Đạt vi khuẩn axetic thông qua đờng oxi hoá không hoàn toàn để phân giải đờng rợu, tạo loại axit đợc sinh vật thải Phần lớn vi khuẩn axetic cần môi trờng phức tạp để sinh sống, chúng oxi hoá rợu sơ cấp thành axit béo tơng đơng CH3CH2OH CH3COOH IV Lên men axetic sản xuất dấm ăn Thuật ngữ dấm để dung dịch chua thu đợc từ trình lên men axetic, để không khí nhiệt độ ổn định thông thờng không vợt từ 20 - 30 0C tất loại dung dịch có cồn số dung dịch có đờng, có tinh bột sau đà qua trình lên men rợu, tác nhân trình axit hoá Mycoderma aceti Acetobacter Dấm ăn từ xa đến đợc dùng làm chất điều vị, theo truyền thuyết phát minh chuyên gia sản xuất rợu ngời Trung Quốc tên Đỗ Khang [11] Tuỳ theo nguồn gốc dấm ngời ta phân biệt loại dấm nh: Dấm làm từ rợu vang, dấm làm từ bia mạch nha, dấm làm từ cồn dấm làm từ hạt, mật, khoai tây đà thuỷ phân, lactoserum Quá trình biến rợu thành dấm đà đợc ngời sử dụng từ lâu kỹ thuật lên men oxi hoá phổ biến gia đình Dấm dung dịch chứa khoảng - 6% axit axetic Để hở cốc rợu nhạt (rợu trắng, rợu vang ) pha loÃng nớc sôi để nguội để độ rợu khoảng 6% Nếu dùng bia không cần pha loÃng, cho thêm chuối để bổ sung thêm gluxit vitamin cho axit axetic, phủ miệng bình rộng vải khoảng mơi ngày ta có dấm ăn Trong lên men axetic chất dinh dỡng chủ yếu etanol với nồng độ dới 10% môi trờng Ngoài có thêm đờng, nguồn nitơ vô hữu cơ, nh chất khoáng khác Trong công nghiệp sản xuất ngời ta dùng hai phơng pháp lên men là: Phơng pháp lên men nhanh phơng pháp lên men chậm Ngoài hai phơng pháp ngời ta ý đến phơng pháp lên men chìm kiểu đại, phơng pháp ngày có ý nghĩa lớn Lên men dấm trình axetyl hoá etanol thành axit axetic điều kiƯn hiÕu khÝ díi t¸c dơng cđa enzim oxi ho¸ vi khuẩn Để chuyển hoá thành axit axetic rợu phải thâm nhập vào bên tế bào vi khuẩn oxi phải vào để oxi hoá axit axetic tạo thành thoát khỏi tế bào môi trờng Sự oxi hoá rợu thành dấm trình khử dần hyđro rợu mà phản ứng cuối đợc viết nh sau: CH3COOH + H2O + 0,48.106J CH3CH2OH + O2 Vi khuẩn axetic bị ức chế hoạt ®éng nång ®é axit axetic qu¸ cao cịng nh nồng độ rợu lớn Sự thông khí tốt nhiệt độ 30 - 40 0C điều kiện thích hợp cho chúng Ngoài oxi hoá rợu thành dấm, số loài vi khuẩn axetic có khả tổng hợp vitamin B1, B2 loài A.suboxydans, A.xylium có khả oxi hoá rợu sobit thành đờng socboza, từ socboza ta thu đợc vitamin C Vitamin có vai trò chống bệnh hoại huyết Hàng ngày trung bình ngời cần dùng đến 100 mg vitaminC V Bét khoai lang, nguyªn liƯu dïng cho lªn men axetic Theo Lê Ngọc Tú (2000) thành phần hoá học khoai lang nh sau: Loại củ Khoai lang tơi Khoai lang kh« Níc (%) Gluxit (%) Protein (%) ChÊt bÐo Xenluloja (%) (%) Tro (%) 68,1 27,9 1,6 0,5 0,9 13,1 80,5 0,8 0,2 0,5 Qua bảng cho thấy khoai lang khô có hàm lợng gluxit cao (80,5%) nguồn nguyên liệu quan trọng cho lên men axetic Việt Nam khoai lang nông nghiệp đợc trồng rộng rÃi, phổ biến nhiều vùng cho suất cao cung cấp lơng thực cho ngời gia súc Hiện đợc sử dụng để ăn (luộc, lấy bột làm bánh, làm thức ăn cho gia súc), dùng làm nguyên liệu để sản xuất sinh khối nhng dùng bột khoai để sản xuất axit axetic cha đâu làm Do chọn bột khoai làm nguyên liệu để lên men axetic, với mục đích tận dụng loại nguyên liệu dễ kiếm, rẻ tiền để tạo axit axetic có giá trị đợc dùng nhiều kinh tế Phần III Đối tợng - Địa điểm - Thời gian phơng pháp nghiên cứu I Đối tợng nghiên cứu Vi khuẩn lên men axetic II Địa điểm nghiên cứu Phòng thí nghiệm Di truyền - Vi sinh Trờng Đại học Vinh III Thêi gian nghiªn cøu Tõ 22/9/2005 - 3/2006 IV Phơng pháp nghiên cứu Thu nhận vi khuẩn axetic - Cho vào bình tam giác 100 ml (khử trùng) gồm: 50 ml bia + 0,5 ml rợu làm chất giàu lợng axit hoá môi trờng axit axetic 1N tõ 0,1 0,2 ml - §Ëy nót nuôi tủ ấm 300C - Sau - ngày bề mặt bình xuất váng màu trắng nhạt vi khuẩn axetic tạo thành - Lấy váng dấm làm tiêu bản, quan sát 1.1 Nuôi phân lập Thành phần môi trờng cho vi khuÈn axetic gåm: S÷a bét: 10g Pepton: 10g Agar: 20g Níc: 1000 ml V« trïng ë atm vßng 30 - Dïng que trang thủ tinh phân phối dịch pha loÃng mặt thạch Sau đặt vào tủ ấm nuôi nhiệt độ 25 - 300C 1.2 Xác định số lợng vi sinh vật Dùng môi trờng đặc trng cho vi khuẩn axetic với thành phần nh Khử trùng atm, 30 phút Tất ống nghiệm đĩa petri đợc khử trùng Các thao tác đợc tiến hành buồng cấy đà đợc vô trùng tia tử ngoại [10] Vi sinh vật đợc nuôi cấy môi trờng thạch đĩa đợc định lợng theo phơng pháp CFU Xác định số lợng vi khuẩn axetic phơng pháp pha loÃng 10-5, cấy 0,1 ml dung dịch huyền phù lên đĩa thạch Nuôi - ngày 25 - 30 0C Đếm số lợng khuẩn lạc hình thành đĩa thạch theo công thøc sau: N X(CFU/ml) = R n1vf1 + nivfi Trong đó: N: Tổng số khuẩn lạc đếm đợc ni: Số đĩa khuẩn lạc đếm độ pha loÃng v: Thể tích mẫu lấy vào đĩa fi: Độ pha loÃng có số khuẩn lạc đợc chọn R: Tỷ lệ khẳng định Xác định hoạt tính vi khuẩn axetic Dung dịch khoai đợc pha nồng độ 5%, 10%, 15%, 20%, sau cho vào bình tam giác Đậy nút bông, gói báo, khử trùng 1atm 30 phút Lấy để nguội cho vào bình tam giác 5g men đà đợc nghiền nhỏ, lắc Cho 1- giọt axit axetic (để kích thích sinh trởng ) + váng dấm Nuôi nhiệt độ 20 0c, 300c từ 3- ngày cho thêm nớc để lên men tiếp Hàng ngày theo dâi sù thÝch luü axit axetic b»ng sù thay đổi pH dịch lên men, đến pH không đổi tiến hành định lợng Phơng pháp định tính (lặp lại lần) - Phản ứng tạo sắt axetat: Cho vào ống nghiệm (khử trùng): 3ml dung dịch lên men + 1ml NH4OH NaOH 20% + vài giọt FeCl3 5% (2 giọt) Lắc đun nóng đèn cồn Nếu dịch lên men có axit axetic tạo thành sắt axetat màu đỏ thẫm CH3COOH + Na = CH3COONa + H2O 3CH3COONa + FeCl3 = Fe(CH3COO)3 + 3NaCl Màu đỏ Định lợng axit axetic (lặp lại lần) 10ml dung dịch lên men + 1- giät phenolphtalein 0,1% råi chuÈn ®é b»ng dung dịch NaOH 0,1N, xuất màu hồng nhạt bền Tính số mg axit axetic tõng c«ng thøc X= A 0,006 V V0 10 + AH2: Có màu trắng tinh không bắt màu với thuốc nhuộm Iốt, loài A.Schutzenbachii có khả tích luỹ môi trờng đến 11,5% axit axetic thờng đợc dùng chuyển hoá rợu thành dấm Nh vậy: Là đà tiến hành phân lập đợc chủng là: A.aceti A.Schutzenbachii chủng có khả tích luỹ axit axetic cao từ - 12% Chơng II Sinh trởng phát triển vi khuẩn Axetic I Đặc điểm Theo Blachman, Grozinxki (1981) sinh trởng tăng số lợng, kích thớc, thể tích với phân hoá hình thành quan 13 đánh giá sinh trởng tăng số lợng khuẩn lạc sau thời gian nuôi cấy (sinh trởng tơng đối) NghÜa lµ: P(%)  Wt  W0 100% W0 Trong ®ã: W0: Sè ®o lÇn ®Çu Wt: Sè ®o lÇn cuối t: Khoảng cách hai lần đo Và tốc ®é sinh trëng: v Wt  W0 100% W0 t II Phơng pháp tiến hành - Lấy váng dấm bình nuôi vi khuẩn axetic - Pha loÃng 10-5 - Cấy 0,1 ml dịch thể lên đĩa môi trờng có thạch - Dùng que trang thuỷ tinh trang khắp mặt thạch - ủ tủ ấm 300C Sau 48 thấy khuẩn lạc xuất - Xác định số khuẩn lạc (phơng pháp CFU) III Kết Với phơng pháp tiến hành nh thu đợc kết bảng Bảng 2: Sinh trởng cña vi khuÈn MÉu pha lo·ng Thêi gian (giê) 10-5 48 Số khuẩn lạc đĩa 69 105 75 Tổng khuẩn lạc X 249 Từ kết bảng ta thấy: Số khuẩn lạc là: N (CFU / ml )  Trong ®ã: X V v V: ThĨ tÝch pha loÃng v: Thể tích để nuôi cấy 14 (khuẩn lạc) CFU/ml P (%) v (%/ngày) 83 8,3 x 10-3 436,40 22,96 ë b¶ng 2: Cho ta thÊy víi mÉu pha loÃng 10 -5 sau 48 thu đợc số khuẩn lạc lớn 8,3 x 10-3 CFU/ml Nh sinh trởng vi khuẩn đạt đợc P(%) = 436,40% sau 48 Tốc độ sinh trởng tơng đối nhanh phù hợp với kết nghiên cứu Lơng Đức Phẩm số tác giả khác Chơng III ảnh hởng nồng độ chất I Đặc điểm Nếu nồng độ chất cao tức lợng đờng dịch men cao dẫn đến tăng áp suất thẩm thấu làm cân trạng thái sinh lý nấm men Vì nồng độ dịch men dẫn đến lợng đờng không đủ cho trình lên men, nồng độ dịch men cao dẫn đến lợng đờng d nhiều làm ức chế trình lên men II Phơng pháp tiến hành Dung dịch khoai đợc pha nồng độ 5%, 10%, 15% 20%, cho vào bình tam giác khử trùng atm 30 phút Để nguội cho 5g men vào, lắc Thí nghiệm điều kiƯn 30 0C Hµng ngµy theo dâi sù tÝch l axit axetic qua thay đổi pH dung dịch lên men III Kết Với phơng pháp nghiên cứu nh thu đợc kết bảng nh sau: 15 Bảng 3: ảnh hởng nồng độ chất Cơ chất 5% 10% 15% 20% Các tham sè 0T Lỵng axit axetic (mg/100ml) VNaOH 0,1N 10,00 15,00 10,00 10,00 20,00 15,00 40,00 30,00 25,00 55,00 50,00 40,00 11,66 699,60 15,00 900,00 31,66 1899,60 48,33 2899,80 NhËn xÐt: Nhìn vào bảng ta thấy Lợng axit tăng nồng độ chất tăng nồng độ chất tăng dẫn đến nồng độ đờng tăng, tạo điều kiện thuận lợi cho trình lên men nên lợng axit axetic tạo nhiều: Kết thu đợc là: * Về độ chua: - 5% đạt 11,66 0T - 10% đạt 15,00 0T - 15% đạt 31,66 0T - 20% đạt 48,33 0T * Về hàm lợng axetic: - 5% thu đợc 699,60 (mg/100 ml) - 10% thu đợc 900,00 (mg/100 ml) - 15% thu đợc 1899,60 (mg/100 ml) 16 - 20% thu đợc 2899,80 (mg/100 ml) Nh với nồng độ chất 20 % lợng axit axetic thu đợc nhiều nhất: 2899,80 (mg/100 ml) Qua đồ thị ta thấy rõ điều (hình 1) Axit axetic (mg/100ml) 3500 2899,80 3000 2500 1899,60 2000 1500 1000 699,60 900,00 500 10 15 20 C% Hình ảnh hởng nồng độ chất Nhìn hình ta thấy nồng độ chất 20% thu đợc kết tốt nồng độ chất khác Nghĩa là: + Hơn nồng độ chất 5% là: 2200,20 (mg/100 ml) + Hơn nồng độ chất 10% là: 1999,80 (mg/100 ml) + Hơn nồng độ chất 15% là: 1000,20 (mg/100ml) Chơng IV ảnh hởng nhiệt độ I Đặc điểm Nhiệt độ có ảnh hởng sâu sắc đến phản ứng enzim Thông thờng điều kiện tiêu chuẩn, tăng nhiệt độ lên thêm 10 0C phản ứng tăng gấp lần Trong điều kiện thí nghiệm, tìm hiểu ảnh hởng nhiệt độ đến lên men axetic II Phơng pháp tiến hành 17 Từ kết bảng thấy dung dịch có nồng độ chất 20% đạt kết cao Từ sử dụng nồng độ để tìm hiểu ảnh hởng nhiệt độ, thí nghiệm đợc tiến hành điều kiện nhiệt độ 200C 300C III Kết Với phơng pháp tiến hành nh thu đợc kÕt qu¶ ë b¶ng sau: B¶ng ¶nh hëng cđa nhiệt độ Thời gian (Ngày) Nồng độ chất (%) Nhiệt độ (0C) Lần phân tích VNaOH 0,1N Lần LÇn LÇn LÇn LÇn LÇn 15,00 20,00 15,00 55,00 50,00 40,00 20 20 30 Các tham số 0T Lợng axit axetic (mg/100ml) 16,66 999,60 48,33 2899,80 NhËn xÐt: Qua b¶ng ta thÊy: ë nồng độ chất 20% phản ứng tạo axit axetic 20 0C 300C có thay đổi sau ngày * Về độ chua - 200C đạt 16,66 0T - 300C đạt 48,33 0T * Về hàm lợng axetic - 200C thu đợc hàm lợng axetic: 999,60 mg/100ml - 300C thu đợc hàm lợng axetic: 2899,80 mg/100ml Kết ta thấy rõ đồ thị sau (hình 2) 3500 Axit axetic (mg/100ml) 2899,80 3000 2500 2000 1500 1000 999,60 500 20 30 Hình ảnh hởng nhiệt độ 18 C Qua hình ta thấy, rõ ràng 300C hàm lợng axetic thu đợc nhiều 200C, nghĩa cao 1900,20 (mg/100ml) axetic Chơng V ảnh hởng thời gian Để biết đợc khả lên men tạo axit axetic, tìm hiểu tích luü axit axetic thêi gian lªn men b»ng theo biến đổi pH dịch lên men Với điều kiện nhiệt độ môi trờng không đổi (300C) nồng độ chất 20% thu đợc kết nh sau (bảng 5) Bảng Biến đổi pH thời gian lên men Thời gian Số ngày pH dich lªn men 18/2 21/2 24/2 27/2 2/3 12 5/3 15 8/3 18 4,5 11/3 21 4,5 14/3 24 17/3 27 NhËn xÐt: Tõ b¶ng cho thÊy: - Ban đầu pH = - Sau ngày pH giảm xuống còn: - Sau ngày pH giữ nguyên: Sau ngày pH giảm xuống trì tiếp ngày sau - Sau 18 ngày pH lại tăng lên tăng lên ngày sau 19 Nh vậy: Sau ngày pH giảm mạnh (pH = 3) sau ngµy pH cịng b»ng Chøng tá sau ngµy axit axetic đợc tích luỹ nhiều lợng đợc trì ngày, sau tăng lên dần Điều cho thấy với điều kiện thí nghiệm sau - 15 ngày có axit axetic nhiều Nếu tiếp tục cho lên men axit axetic cso thể bị oxi hoá dẫn đến hàm lợng giảm Kết có thấy rõ đồ thị sau (Hình 3) pH 7 4 3 3 12 15 4,5 4,5 18 21 5 24 27 1 t(ngày) Hình 3: Biến đổi pH thời gian lên men Qua hình ta thấy rõ: Sự xuống đồ thị, tức giảm pH, có nghĩa tích luỹ axit axetic tăng dần nhng đến thời điểm cân thời điểm phải thu nhận axit axetic (9 - 15 ngày) Chơng VI ảnh hởng mật độ vi sinh vật I Đặc điểm 20 ... đơn giản, đầu t Mục tiêu: Từ lí tiến hành nghiên cứu đề tài: Bớc đầu nghiên cứu sản xuất axit axetic phơng pháp lên men vi sinh vật tinh bột khoai nhằm - Phân lập nuôi cấy chủng vi khuẩn axetic. .. công nghiệp sản xuất ngời ta dùng hai phơng pháp lên men là: Phơng pháp lên men nhanh phơng pháp lên men chậm Ngoài hai phơng pháp ngời ta ý đến phơng pháp lên men chìm kiểu đại, phơng pháp ngày... cho gia súc), dùng làm nguyên liệu để sản xuất sinh khối nhng dùng bột khoai để sản xuất axit axetic cha đâu làm Do chọn bột khoai làm nguyên liệu để lên men axetic, với mục đích tận dụng loại nguyên