Nghiên cứu nhân giống các dòng keo lai năng suất cao BV376, BV586, BB055 bằng phương pháp nuôi cấy mô

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Văn Thu Huyền NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÁC DÒNG KEO LAI NĂNG SUẤT CAO BV376, BV586, BB055 BẰNG PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC Hà Nội – 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Văn Thu Huyền NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÁC DÒNG KEO LAI NĂNG SUẤT CAO BV376, BV586, BB055 BẰNG PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số : LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: Hƣớng dẫn 1: TS Lê Sơn Hƣớng dẫn 2: TS Đỗ Tiến Phát Hà Nội - 2021 Lời cam đoan Tôi xin cam đoan đề tài luận văn thạc sỹ: “Nghiên cứu nhân giống dòng Keo lai suất cao BV376, BV586, BB055 phương pháp nuôi cấy mô” thực với hƣớng dẫn TS Lê Sơn TS Đỗ Tiến Phát Các số liệu kết trình bày luận văn trực tiếp thu thập, đồng thời có kế thừa kết đề tài ―Nghiên cứu chọn tạo giống Keo lai sinh trưởng nhanh thị phân tử‖ đề tài ―Nghiên cứu chọn tạo giống Keo lai Keo tràm phục vụ trồng rừng gỗ lớn số vùng sinh thái chính‖ Viện Nghiên cứu Giống Cơng nghệ Sinh học Lâm nghiệp – Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam chủ trì thực Mọi kết nghiên cứu nhƣ ý tƣởng tác giả khác (nếu có) đƣợc trích dẫn cụ thể Đề tài luận văn chƣa đƣợc bảo vệ hội đồng bảo vệ luận văn thạc sĩ nhƣ chƣa đƣợc công bố phƣơng tiện Tôi xin chịu trách nhiệm lời cam đoan Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Tác giả Văn Thu Huyền Lời cảm ơn Sau hồn thành mơn học chƣơng trình đào tạo thạc sĩ, đƣợc đồng ý Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam, tơi tiến hành khóa luận ―Nghiên cứu nhân giống dòng Keo lai suất cao BV376, BV586, BB055 phương pháp nuôi cấy mơ’’ Khóa luận đƣợc thực Viện Nghiên cứu Giống Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp - Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam, Đức Thắng – Bắc Từ Liêm - Hà Nội Để hồn thành khố luận đƣợc quan tâm giúp đỡ tận tình nhiều mặt Ban lãnh đạo, cán công nhân viên Viện Nghiên cứu Giống Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp - Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam nhƣ nhƣ thầy trực tiếp giảng dạy lớp BIO-19A khóa 2019A, Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàm lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Qua xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới giúp đỡ đóng góp vơ q báu Tơi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn đến TS Đỗ Tiến Phát, TS Lê Sơn tận tình hƣớng dẫn, bảo giúp đỡ tơi hồn thành luận văn Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn đến tất bạn bè đồng nghiệp ngƣời thân giúp đỡ tơi có đƣợc luận văn Trong trình thực hiện, lực điều kiện nghiên cứu hạn chế nên khố luận khơng tránh khỏi thiếu sót Rất mong nhận đƣợc đóng góp ý kiến thầy bạn để khố luận đƣợc hồn thiện Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Học viên thực Văn Thu Huyền Danh mục ký hiệu chữ viết tắt Viết tắt Nghĩa đầy đủ BAP 6- Benzyl Amino Purine HSNC Hệ số nhân chồi B5 Môi trƣờng Gamborg Ca(OCl)2 Canxi Hypoclorit GA3 Gibberellic Acid HgCl2 Clorua thuỷ ngân IAA Indol 3- Acetic Acid IBA Indol Butiric Acid Kn Kinetin MS* Môi trƣờng MS cải tiến NAA Naphthy Acetic Acid NaClO Hypoclorit Natri PVP Poly Vinyl Pyrrolidone Tb Trung bình TLBCHH Tỷ lệ bật chồi hữu hiệu TLCHH Tỷ lệ chồi hữu hiệu WPM Môi trƣờng cho thân gỗ Danh mục bảng Bảng 3.1 Kết thí nghiệm khử trùng Keo lai 44 Bảng 3.2 Hiệu khử trùng giống nghiên cứu 47 Bảng 3.3 Kết thí nghiệm xác định mơi trƣờng ni cấy 49 Bảng 3.4 Kết thí nghiệm xác định ảnh hƣởng BAP Kn nồng độ khác đến khả nhân chồi Keo lai sau 25 ngày nuôi cấy 51 Bảng 3.5 Ảnh hƣởng tổ hợp BAP NAA tới khả tạo cụm chồi Keo lai sau 25 ngày nuôi cấy 53 Bảng 3.6 Kết thí nghiệm xác định chế độ chiếu sáng thích hợp cho ni cấy dịng Keo lai sau 25 ngày cấy chuyển 56 Bảng 3.7 Kết thí nghiệm xác định Phƣơng pháp cấy thích hợp 57 Bảng 3.8 Kết thí nghiệm kích thích tạo rễ cho dịng Keo lai dòng BV376, BV586 BB055 59 Bảng 3.9 Kết thí nghiệm huấn luyện Keo lai 62 Bảng 3.10 Kết thí nghiệm loại giá thể cho Keo lai 64 Danh mục hình vẽ, đồ thị Hình 1.1 Quá trình phân hoá phản phân hoá tế bào 18 Hình 3.1 Chồi bất định Keo lai sau 25 ngày khử trùng 48 Hình 3.2 Cụm chồi Keo lai dịng BB055 sau 25 ngày nuôi cấy môi trƣờng nhân chồi khác 50 Hình 3.3 Các cụm chồi Keo lai đƣợc nuôi cấy công thức môi trƣờng nhân chồi khác 52 Hình 3.4 Các chồi Keo lai dịng BV568 sau 25 ngày nuôi cấy công thức thí nghiệm khác 54 Hình 3.5 Cụm chồi Keo lai sau giai đoạn nuôi cấy: cụm chồi ban đầu, cụm chồi sau nuôi cấy lần cụm chồi mơi trƣờng tối ƣu .58 Hình 3.6 Các chồi Keo lai dịng BB055 rễ mơi trƣờng có bổ sung IBA NAA 60 Hình 3.7 Các chồi Keo lai dòng BV376 rễ sau 10 ngày 61 Hình 3.8 Bình rễ Keo lai 61 Hình 3.9 Cây Keo rễ đƣợc cấy vào bầu đất 63 Hình 3.10 Luống Keo lai vƣờn ƣơm 65 MỤC LỤC MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật nhân giống rừng 1.1.1 Trên giới 1.1.2 Nhân giống phƣơng pháp nuôi cấy mô cho giống rừng Việt Nam 1.2 Khái niệm sở khoa học phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.2.1 Khái niệm 1.2.2 Cơ sở khoa học phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào 1.2.2.1 Tính tồn tế bào thực vật 1.2.2.2 Sự phân hoá phản phân hoá tế bào 1.3 Các nhân tố ảnh hƣởng tới nhân giống nuôi cấy mô tế bào 1.3.1 Môi trƣờng nuôi cấy 1.3.1.1 Môi trƣờng hóa học 1.3.1.2 Môi trƣờng vật lý 1.3.2 Vật liệu nuôi cấy 1.3.3 Điều kiện vô trùng 1.3.4 Buồng nuôi cấy 1.4 Những vấn đề nhân giống in vitro 1.4.1 Sự nhiễm mẫu 1.4.2 Tính bất định mặt di truyền 1.4.3 Sản sinh chất độc từ mẫu nuôi cấy 1.4.4 Hiện tƣợng thủy tinh hóa 1.5 Các giai đoạn trình nhân giống 1.5.1 Giai đoạn chuẩn bị 1.5.2 Giai đoạn cấy khởi động 1.5.3 Giai đoạn nhân nhanh 1.5.4 Tạo hoàn chỉnh (ra rễ) 28 1.5.5 Đƣa môi trƣờng tự nhiên .29 1.6 Một số kết bật chọn giống Keo lai trồng rừng Keo lai nƣớc ta 30 1.7 Nghiên cứu nhân giống in vitro loài keo 31 1.7.1 Trên giới 31 1.7.2 Ở Việt Nam 34 CHƢƠNG NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36 2.1 VẬT LIỆU nghiên cứu .36 2.2 Nội dung nghiên cứu 36 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 37 2.3.1 Địa điểm, điều kiện bố trí thí nghiệm 37 2.3.2 Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm .37 2.3.3 Xử lý số liệu 41 2.3.3.1 Tính tốn tiêu theo dõi 41 2.3.3.2 Kiểm tra ảnh hƣởng nhân tố đến kết thí nghiệm .42 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44 3.1 Xác định Phƣơng pháp khử trùng mẫu thích hợp cho dòng Keo lai nghiên cứu 44 3.2 Xác định môi trƣờng nuôi cấy cho Keo lai 48 3.3 Xác định môi trƣờng nhân nhanh số lƣợng chồi Keo lai 50 3.4 Xác định môi trƣờng nâng cao chất lƣợng chồi cho Keo lai 52 3.5 Tối ƣu hóa phƣơng pháp nuôi cấy chế độ chiếu sáng 55 3.5.1 Xác định chế độ chiếu sáng thích hợp 55 3.5.2 Xác định phƣơng pháp cấy thích hợp cho dịng Keo lai 56 3.6 Xác định môi trƣờng rễ cho Keo lai 58 3.7 Xác định thời gian huấn luyện thích hợp .62 3.8 Xác định loại giá thể phù hợp cho Keo lai nuôi cấy mô 63 3.9 Xây dựng quy trình nhân giống cho dịng Keo lai nghiên cứu 65 3.9.1 Mục tiêu quy trình 66 3.9.2 Phạm vi áp dụng 66 3.9.3 Điều kiện cần thiết để áp dụng quy trình 66 3.9.3.1 Điều kiện khí hậu 66 3.9.3.2 Nguồn giống 66 3.9.3.3 Điều kiện nhân lực .66 3.9.3.4 Cơ sở vật chất .66 3.9.4 Nội dung quy trình 67 3.9.4.1 Khử trùng mẫu 67 3.9.4.2 Nhân tạo mẫu .67 3.9.4.3 Nhân nhanh 68 3.9.4.4 Nâng cao chất lƣợng chồi 68 3.9.4.5 Cho rễ .68 3.9.4.6 Huấn luyện .68 3.9.4.7 Ra cấy vào bầu đất: 69 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 70 4.1 Kết luận 70 4.2 Kiến nghị 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO 72 PHỤ LỤC 78 75 31.Nguyễn Quang Thạch, 2000, Giáo trình sinh lý thực vật, Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội 32.Bhat K M and Hwanok Ma (2004), Teak growers unite, in ITTO tropical forest update 33 Đoàn Thị Mai, Nguyễn Thị Mỹ Hƣơng, Vũ Thị Ngọc, Trần Thanh Hƣơng, Văn Thu Huyền, 2009a, Nuôi cấy số giống Keo lai chọn tạo, Tạp chí khoa học Lâm nghiệp số 2/2009, trang 905 – 910 34 Đồn Thị Mai, Lê Sơn, Ngơ Thị Minh Duyên, Lƣơng Thị Hoan, 2009b, Nhân giống sinh dƣỡng xây dựng mơ hình trồng số dịng keo tràm (Acacia auriculiformis) tuyển chọn, Báo cáo Hội nghị KHCN lâm nghiệp khu vực phía Bắc 35 Lê Đình Khả, 2003, Nghiên cứu chọn tạo giống nhân giống cho số loài trồng rừng chủ yếu Việt Nam, NXB Nông nghiệp, Hà Nội 36 Nguyễn Hoàng Nghĩa, 2011, Báo cáo tổng kết đề tài ―Nghiên cứu chọn dòng keo bạch đàn chống chịu bệnh có suất cao‖, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam 37 Beck S.L and Dunlop R W., 2001, Micropropagation of the Acacia species – A review, In Vitro Cell Dev Biol.—Plant, 37:531–538 38 Darus H Ahmad (1994), Multiplication of Acacia mangium by stem cutting and tissue culture techniques, Advances in tropical acacia research, pp 32-34 Gerard C Douglas and John Mcnamara, 1999, Shoot regeneration from seedling explants of Acacia mangium Willd In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant, 36: 412–415 39 40 De-Yu Xie and Yan Hong, 2001, In vitro regeneration of Acacia mangium via organogenesis, Plant Cell Tissue and Organ Culture, 66(3):167173 76 41 Nanda R.M., Rout G.R., 2003, In vitro somatic embryogenesis and plant regeneration in Acacia arabica, Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 73, 131-135 42 Nanda R M., Das P., Rout G R., 2004, In vitro clonal propagation of Acacia mangium Willd and its evaluation of genetic stability through RAPD markers Ann For Sci 61 (2004) 381–386 43 Mittal A., Agarwal R and Gupta S.C., 1989, In vitro development of plantlets from axillary buds of Acacia auriculiformis — a leguminous tree, Plant Cell Tiss Organ Cult 19, 65–70 44 Trindate H F., Pais J G., Aloni M S., 1990, The role of Cytokinin and auxin in rapid multiplication of shoots of Eucalyptus globolus grown in vitro, Aust For 53(4), pp 221-223 45 Shukor N.A.A., Griffin A., Jainol J.E., Awang K., Basharuddin J., Ismail H., Yusoff A.M., 2000, Shoot proliferation of three potential tropical plantation tree species, Proceedings of Forests and Society (2000): The Role of Research, Posters IUFRO World Congress, Malaysia, p 74 46 Nguyễn Ngọc Tân cộng sự, 1995, Nhân giống Keo lai nuôi cấy mô phân sinh, In Kết nghiên cứu khoa học công nghệ giai đoạn 1990-1995, NXB Nông nghiệp, Hà Nội 47 Nguyễn Ngọc Tân, Trần Hồ Quang, Ngô Thị Minh Duyên, 1997, Nhân giống Keo lai nuôi cấy mô phân sinh, In Kết nghiên cứu khoa học chọn giống rừng, Tập 2, Chủ biên Lê Đình Khả, NXB Nông nghiệp, Hà Nội 48 Lê Sơn cộng tác viên, 2013, Hồn thiện quy trình nhân nhanh nuôi cấy mô cho giống Keo lai công nhận, Báo cáo dự án SXTN cấp nhà nƣớc, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam 49 Cấn Thị Lan cộng sự, 2017, Nghiên cứu nhân nhanh số giống Keo Bạch dàn công nghệ tế bào thực vật, Báo cáo tổng kết đề tài cấp nhà nƣớc, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam 77 50 Cấn Thị Lan cộng sự, 2020, Hồn thiện cơng nghệ vi nhân giống quy mơ công nghiệp sản xuất giống Keo tràm Clt18, Clt57, Clt98, Báo cáo tổng kết dự án sxtn cấp nhà nƣớc, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam PHỤ LỤC Bảng Môi trƣờng MS (Murashige & Skoog, 1962) Thành phần hóa chất KNO3 NH4NO3 MgSO4.7H2O KH2PO4 CaCl2 H3BO3 MnSO4.H2O ZnSO4 Na2MO4 CuSO4.7H2O CoCl2 Na2EDTA FeSO4.7H2O Glycin Myo-inositol Nicotinic acid Thiamin HCl Prydoxin HCl Bảng Thành phần môi trƣờng MS cải tiến cho Keo lai (kí hiệu MS1) Thành phần hóa chất KNO3 NH4NO3 KH2PO4 CaCl2 MgSO4 Na2EDTA FeSO4.7H2O MnSO4.4H2O H3BO3 ZnSO4.7 H2O KI Na2MoO4.2 H2O CoCl2.6H2O CuSO4 Glycin Myo-Inositol Nicotinic acid Pyridoxine HCl (vitamin B6) Thiamine HCl (vitamin B1) Biotin Axit ascorbic (Vitamic C) PVP Casein Bảng Thành phần môi trƣờng MS cải tiến cho Keo lai (Kí hiệu MS2) Thành phần hóa chất KNO3 NH4NO3 KH2PO4 CaCl2 MgSO4 Na2EDTA FeSO4.7H2O MnSO4.4H2O H3BO3 ZnSO4.7 H2O KI Na2MoO4.2 H2O CoCl2.6H2O CuSO4 Glycin Myo-Inositol Nicotinic acid Pyridoxine HCl (vitamin B6) Thiamine HCl (vitamin B1) Biotin Axit ascorbic (Vitamic C) PVP Casein Bảng Môi trƣờng MS* (là mơi trƣờng MS giảm ½ Nitơ tổng số) Bảng Xử lý số liệu vào khử trùng mẫu ANOVA Tỷ lệ sống (%) Between groups Within groups Total ANOVA Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) Between groups Within groups Total ANOVA Tỷ lệ nảy chồi hữu hiệu (%) Between groups Within groups Total Bảng So sánh hiệu khử trùng giống ANOVA Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) Between groups Within groups Total ANOVA Tỷ lệ nảy chồi hữu hiệu (%) Between groups Within groups Total Bảng Kết phân tích ANOVA this nghiệm xác định môi trƣờng nuôi cấy ANOVA Hệ số nhân chồi Between groups Within groups Total ANOVA chiều dài chồi Between groups Within groups Total Bảng Kết phân tích ANOVA thí nghiệm xác định mơi trƣờng nhân nhanh ANOVA Hệ số nhân chồi Between groups Within groups Total ANOVA chiều dài chồi Between groups Within groups Total Bảng Kết phân tích ANOVA thí nghiệm xác định môi trƣờng nâng cao chất lƣợng chồi ANOVA Hệ số nhân chồi Between groups Within groups Total ANOVA chiều dài chồi Between groups Within groups Total Bảng 10 Kết phân tích ANOVA thí nghiệm xác định độ chiếu sáng thích hợp ANOVA Hệ số nhân chồi Between groups Within groups Total ANOVA chiều dài chồi Between groups Within groups Total ANOVA tỷ lệ chồi hữu hiệu Between groups Within groups Total Bảng 11 Kết phân tích ANOVA thí nghiệm xác định độ chiếu sáng thích hợp ANOVA Tỷ lệ rễ Between groups Within groups Total ANOVA chiều dài rễ Between groups Within groups Total ANOVA số rễ trung bình Between groups Within groups Total Bảng 12 Kết phân tích ANOVA thí nghiệm xác định thời gian huấn luyện ANOVA Tỷ lệ sống Between groups Within groups Total ANOVA chiều cao trung bình Between groups Within groups Total ... HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Văn Thu Huyền NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÁC DÒNG KEO LAI NĂNG SUẤT CAO BV376, BV586, BB055 BẰNG PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số :... đoan đề tài luận văn thạc sỹ: ? ?Nghiên cứu nhân giống dòng Keo lai suất cao BV376, BV586, BB055 phương pháp nuôi cấy mô? ?? thực với hƣớng dẫn TS Lê Sơn TS Đỗ Tiến Phát Các số liệu kết trình bày luận... nghệ Việt Nam, tiến hành khóa luận ? ?Nghiên cứu nhân giống dịng Keo lai suất cao BV376, BV586, BB055 phương pháp ni cấy mơ’’ Khóa luận đƣợc thực Viện Nghiên cứu Giống Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp