Nhân giống bạch đàn urô (eucalyptus urophylla bleck) PN46 PN và PN47 bằng phương pháp nuôi cấy vintro

Bộ giáo dục & đào tạo nông nghiệp ptnt Tr-ờng đại học lâm nghgiệp .o0o phạm đức huy nhân giống hai dòng bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla Bleck) PN46 PN47 ph-ơng pháp nuôi cấy in vitro Chuyên ngành: lâm học Mã số : 60 62 60 Luận văn thạc sĩ khoa học lâm nghiệp ng-ời h-ớng dẫn khoa học PGS-TS D-ơng mộng hùng Hà tây 2006 Luận văn đ-ợc hoàn thành tại: Khoa đào tạo Sau đại học Tr-ờng đại học Lâm nghiệp Ng-ời h-ớng dẫn khoa học: PGS.TS D-ơng Mộng Hùng Phản biện 1: Phản biện 2: Luận văn đ-ợc bảo vệ Hội đồng chấm luận văn cấp nhà n-ớc Họp tại: Tr-ờng Đại học Lâm nghiệp Việt Nam Xuân Mai, Ch-ơng Mỹ, Hà Tây Vào hồi: ngày tháng .năm 2006 Có thể tìm luận văn tại: Trung tâm thông tin t- liệu th- viện - Tr-ờng ĐHLN Th- viện Khoa đào tạo Sau đại học Hà tây 2006 Mở đầu Trong năm gần đây, kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật không ngừng phát triển thu đ-ợc thành tựu đáng kể Kỹ thuật đời mở h-ớng nghiên cứu thực vật nhanh chóng có vị trí quan trọng lĩnh vực công nghệ sinh học sản xuất cải thiện giống trồng -u điểm bật ph-ơng pháp nhân nhanh đồng di truyền số l-ợng lớn cá thể thời gian ngắn, đ-ợc trẻ hoá gần nh- từ hạt [15] Một số loài thuộc chi Bạch đàn (Eucalyptus) đ-ợc nhập nội vào Việt Nam từ sớm trồng rộng rãi hầu hết vùng sinh thái nhằm đáp ứng nhu cầu nguyên liệu giấy, bột giấy, gỗ trụ mỏ, gỗ xây dựng, gỗ xẻ củi Trong hội thảo quốc gia loài -u tiên cho trồng rừng Việt Nam năm 2001, loài bạch đàn đối t-ợng -u tiên số Danh mục loài -u tiên cho trồng rừng toàn quốc [25] Hiện nay, nguồn giống cung cấp cho trồng rừng bạch đàn n-ớc ta chủ yếu vô tính (sản xuất ph-ơng pháp giâm hom nhân giống in vitro) Việt Nam, nhân giống in vitro dòng bạch đàn Urô n-ớc ta đ-ợc sản xuất công nghiệp từ năm 1994 nh-ng đến thu đ-ợc thành công đáng kể Mỗi năm, công nghệ cung cấp khoảng 10 triệu giống bạch đàn loại phục vụ ch-ơng trình trồng rừng toàn quốc [25] Rừng trồng dòng vô tính bạch đàn từ mẹ -u trội đ-ợc chọn lọc tạo b-ớc đột phá suất chất l-ợng rừng trồng năm gần Tuy nhiên, nh-ợc điểm lớn gây trồng nhập nội chúng có nguy tổn thất nặng nề địa xảy dịch sâu bệnh môi tr-ờng gây trồng sức đề kháng chúng địa Thêm vào đó, thực tế mà nhiều ng-ời thống rằng, điểm yếu nhất, rõ nhất, nghiêm trọng trồng rừng từ đ-ợc nhân giống ph-ơng pháp in vitro làm giảm đáng kể biến dị di truyền giảm đa dạng di truyền Hiệu làm ngăn chặn trình chọn lọc tiếp, không đ-ợc tăng thu tiếp theo, tăng khả lây lan, tàn phá nhanh rộng sâu bệnh hại [16] Để hạn chế lây lan dịch bệnh xảy biện pháp kỹ thuật trồng nhiều loài, nhiều dòng khác diện tích lớn n-ớc ta có khoảng 12 dòng bạch đàn đ-ợc Bộ NN&PTNT công nhận cho phép trồng rừng sản xuất, có 3-4 dòng đ-ợc nhân giống ph-ơng pháp in vitro Vì vậy, dòng đ-ợc Bộ NN&PTNT công nhận cần đ-ợc nghiên cứu nhân giống ph-ơng pháp in vitro để cung cấp cho trồng rừng khảo nghiệm trồng rừng sản xuất Năm 2003 Bộ NN&PTNT công nhận hai dòng bạch đàn urô PN46 PN47 (tên đầy đủ Dòng bạch đàn Phù Ninh số 46 Dòng bạch đàn Phù Ninh số 47) giống tiến kỹ thuật khuyến khích trồng rừng vùng có điều kiện sinh thái t-ơng tự vùng Trung tâm Bắc Bộ (Phụ lục 1.1) Hiện nay, nhu cầu giống hai dòng nhằm phục vụ trồng rừng khảo nghiệm sản xuất lớn Thêm vào đó, việc nhân giống kỹ thuật nuôi in vitro dòng ch-a đ-ợc nghiên cứu Thời gian vừa qua, Viện nghiên cứu nguyên liệu giấy thử nghiệm áp dụng quy trình nhân giống invitro hai dòng PN14 U6 vào nhân giống hai dòng nh-ng không thành công Điều đặc điểm sinh lý, sinh hoá hai dòng có điểm khác so với dòng đ-ợc nhân giống quy trình Nên việc áp nghiên cứu nhân giống dòng bạch đàn kỹ thuật nuôi cấy in vitro để tiến tới hoàn thiện công nghệ phục vụ cho sản xuất cần thiết Từ đặc điểm, nhu cầu thực tiễn nhu cầu khoa học nêu trên, tiến hành đề tài Nhân giống hai dòng bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla S.T Blake) PN46 PN47 ph-ơng pháp nuôi cấy in vitro Ch-ơng tổng quan vấn đề nghiên cứu 1.1 Khái niệm nhân giống in vitro Nuôi cấy mô tế bào thực vật gọi nuôi cấy thực vật in vitro (trong ống nghiệm) để phân biệt với trình nuôi cấy điều kiện tự nhiên gọi nuôi cấy in vivo (ngoài ống nghiệm) Thuật ngữ nuôi cấy mô tế bào thực vật hay nuôi cấy in vitro (Plant Tissue Culture) phạm trù khái niệm tất loại nuôi cấy mô tế bào điều kiện vô trùng Bao gồm [16]: Nuôi cấy cây: nuôi cấy thực vật Nuôi cấy phận đ-ợc tách khỏi thực vật: nuôi cấy quan Nuôi cấy phôi thành thục hay ch-a thành đ-ợc tách khỏi thực vật: nuôi cấy phôi Nuôi cấy mô bắt nguồn từ quan thực vật: nuôi cấy mô hay nuôi cấy mô sẹo Nuôi cấy tế bào đơn lẻ hay cụm tế bào nhỏ môi tr-ờng lỏng Nuôi cấy tế bào thực vật sau tách bỏ phần vỏ, gọi nuôi cấy tế bào trần (protoplast) 1.2 Các giai đoạn nhân giống in vitro Nhân giống in vitro gồm nhiều giai đoạn nhau, trình chia thành giai đoạn sau đây: 1.2.1 Giai đoạn chuẩn bị Giai đoạn chuẩn bị giai đoạn quan trọng, định thành công thí nghiệm nhân giống in vitro Giai đoạn gồm nhiều nội dung khác nh- pha môi tr-ờng nuôi cấy, chuẩn bị hoá chất khử trùng mẫu, chuẩn bị khử trùng thiết bị giai đoạn này, chuẩn bị môi tr-ờng dinh d-ỡng có vai trò vô quan trọng mô nuôi cấy có sinh tr-ởng, phát triển đ-ợc hay không phụ thuộc vào thành phần, nồng độ chất có môi tr-ờng nuôi khả hấp thụ chất dinh d-ỡng có môi tr-ờng mô nuôi cấy Nhu cầu dinh d-ỡng mô nuôi cấy khác tuỳ thuộc vào loài, giống, chí mô lấy từ quan khác cá thể có nhu cầu dinh d-ỡng khác [23] Cho đến nay, ng-ời ta tìm nhiều loại môi tr-ờng dinh d-ỡng thích hợp cho nhiều loài khác nh-: môi tr-ờng White (1934), môi tr-òng MS (Murashige and Skoog, 1962), môi tr-ờng Litvay (1985),vv, môi trường MS môi trường nuôi cấy thích hợp cho nhiều loài thực vật nói chung Các loại môi tr-ờng khác có thành phần nồng độ chất khác nhau, nhiên môi tr-ờng gồm thành phần bản: Nguồn cacbon: Nguồn cacbon th-ờng sử dụng đ-ờng Glucose sucrose Ngoài ra, môi tr-ờng số loại thực vật sử dụng mantose lactose [12] Nguồn muối khoáng: Căn vào hàm l-ợng chứa cây, nguyên tố khoáng đ-ợc chia thành hai nhóm Nhóm nguyên tố chiếm l-ợng lớn từ 10-1 đến 10-4 chất khô gọi nguyên tố đa l-ợng gồm: C, H, O, Nvv Nhóm nguyên tố chiếm lượng nhỏ, từ 10-5 đến 10-7 chất khô gọi nguyên tố vi l-ợng, nguyên tố Mn, Bo, Cuvv [22] Vitamin: Nói chung mô nuôi cấy có khả tổng hợp đầy đủ vitamin cần thiết, nhiên với số l-ợng không đầy đủ Để mô nuôi cấy sinh tr-ởng phát triển tốt, ng-ời ta th-ờng đ-a thêm vào môi tr-ờng số vitamin nhóm B nh-: thiamine (B1), pyridoxine (B6), niconin (B3), riboflavin (B2) vitamin C [17] [24] Chất điều hoà sinh tr-ởng: Các chất điều hoà sinh tr-ởng chiếm hàm l-ợng nhỏ môi tr-ờng nuôi cấy nh-ng có vai trò quan trọng định thành công trình nhân giống Trong môi tr-ờng nhân giống in vitro sử dụng chất nhóm chất kích thích sinh tr-ởng bao gồm: auxin, cytokinin gibberelin Auxin đ-ợc sử dụng để điều chỉnh phát sinh rễ Cytokinin sử dụng để điều chỉnh phát sinh chồi Tỷ lệ cân đối auxin/cytokinin tạo hoàn chỉnh [24] Trong nhân giống in vitro, ng-ời ta th-ờng sử dụng auxin IAA, NAA IBA, cytokinin BAP, BA kinetin 1.2.2 Lấy mẫu, khử trùng mẫu cấy mẫu vào môi tr-ờng tạo chồi Mẫu sau lấy đ-ợc rửa n-ớc sạnh (có thể rửa xà phòng chất tẩy rửa khác) Sau rửa n-ớc cất vô trùng, cuối khử trùng chất diệt khuẩn buồng cấy vô trùng Mẫu cấy th-ờng lấy từ phận phát triển mạnh nh- mô phân sinh đỉnh chồi rễ phận non phận có khả tái sinh, sinh tr-ởng phát triển mạnh Khả tái sinh mẫu cấy phụ thuộc vào loại cây, giai đoạn phát triển khác cá thể nh- tuổi mẹ, tuổi cành Ngoài khả tái sinh mẫu cấy phụ thuộc vào thời điểm lấy mẫu, mùa lấy mẫu vị trí mẫu Khử trùng mẫu nuôi b-ớc cấy khởi đầu quan trọng nuôi nhân giống in vitro Đặc biệt số tr-ờng hợp mẫu cấy loài quý hiếm, số l-ợng mẫu có hạn giai đoạn khử trùng vô quan trọng tỷ lệ mẫu sống cao tạo đ-ợc số l-ợng chồi đủ lớn cho thử nghiệm Có nhiều chất khác đ-ợc sử dụng để khử trùng mẫu nh-ng chia chúng làm loại: Nhóm chất khử trùng bề mặt nh- HgCl2, HgCr2, loại nuối hypoclorit, n-ớc ôxi già (H2O2)vv Đặc điểm nhóm chất khử trùng chúng có khả tiêu diệt vi sinh vật nằm bề mặt mẫu vật mà không diệt đ-ợc vi sinh vật bên mô nuôi cấy [21] Nhóm chất khử trùng có khả thấm sâu vào bên mô nuôi cấy tiêu diệt vi sinh vật tồn mô (các chất kháng sinh nhpenixillin, streptomyxin, xefotaxinvv) Khi sử dụng chất này, ng-ời ta không dùng riêng lẻ mà để khử trùng mẫu sau khử trùng bề mặt Nhiều loài thực vật th-ờng chứa mầm bệnh nh- nấm, vi khuẩn, virus bên mô nghiên cứu tạo giống bệnh ng-ời ta cần sử dụng ph-ơng pháp [21] 1.2.3 Cấy tạo chồi nhân chồi Sau thời gian định nuôi cấy chồi môi tr-ờng ống nghiệm, chất dinh d-ỡng môi tr-ờng giảm không hấp thụ Thêm vào đó, số chất ức chế sinh tr-ởng phát triển đ-ợc chồi tiết môi tr-ờng, chồi cần đ-ợc chuyển sang môi tr-ờng Thời gian cấy chuyển phụ thuộc vào loài mục tiêu trình nhân giống Đối với nhân giống in vitro bạch đàn, thời gian cấy chuyển từ 25 đến 30 ngày sau cấy Tuy nhiên, với thí nghiệm mà mục tiêu trì giống bảo tồn in vitro thời gian cấy chuyển dài Môi tr-ờng nhân chồi th-ờng có mặt auxin cytokinin với tỷ lệ thích hợp với loài chí cá thể 1.2.4 Cấy tạo rễ Để tạo hoàn chỉnh gồm rễ, thân lá, chồi đ-ợc cấy vào môi tr-ờng tạo rễ Mục tiêu giai đoạn kích thích trình hình thành rễ phần mặt cắt (phần gốc) chồi Môi tr-ờng tạo rễ th-ờng có mặt auxin mà mặt cytokinin 1.2.5 Huấn luyện cấy bầu Trong nhân giống in vitro, ống nghiệm đ-ợc sản xuất điều kiện nhân tạo nhiệt độ, ánh sáng môi tr-ờng dinh d-ỡng Do cần đ-ợc huấn luyện nhằm tăng tỷ lệ sống cấy v-ờn -ơm Huấn luyện cách đặt bình điều kiện nhiệt độ ánh sáng tự nhiên (th-ờng không để ánh sáng chiếu trực tiếp vào cây, có đ-ợc che tuỳ theo thời điểm mùa) Thời gian huấn phụ thuộc loài mùa, với bạch đàn th-ờng thời gian huấn luyện khoảng 6-10 ngày Kết thúc giai đoạn huấn luyện, đ-ợc lấy cấy vào bầu Tuỳ thuộc vào mục tiêu thí nghiệm sản xuất mà sử dụng thành phần ruột bầu khác Tóm lại, trình nhân giống in vitro đ-ợc chia thành giai đoạn nh- nh-ng kết giai đoạn không tách biệt mà có kế thừa giai đoạn tr-ớc Trong giai đoạn giai đoạn chuẩn bị môi tr-ờng đặc biệt quan trọng, giai đoạn ảnh h-ởng xuyên suốt định thành công hay thất bại trình nhân giống 1.3 Cơ sở khoa học ph ơng pháp nuôi cấy in vitro 1.3.1 Tính toàn tế bào thực vật Nguyên lý nhân giống in vitro tính toàn tế bào thực vật Mỗi tế bào thể thực vật mang toàn l-ợng thông tin di truyền cần thiết đầy đủ thực vật gọi gen (genom) Đặc tính thực vật đ-ợc thể kiểu hình cụ thể thời kỳ trình phát triển phụ thuộc vào giải mã thông tin di truyền t-ơng ứng hệ gen tế bào Do đó, gặp điều kiện thích hợp, mối t-ơng tác qua lại với điều kiện môi tr-ờng, quan, mô tế bào phát triển thành cá thể hoàn chỉnh mang đặc tính di truyền giống nhcây mẹ 1.3.2 Sự phân hoá phản phân hoá tế bào Quá trình phát sinh hình thái nuôi cấy mô tế bào thực vật thực chất kết phân hoá phản phân hoá tế bào Cơ thể thực vật tr-ởng thành chỉnh thể thống bao gồm nhiều quan chức khác nhau, ... (Eucalyptus urophylla S.T Blake) PN4 6 PN4 7 ph-ơng pháp nuôi cấy in vitro 3 Ch-ơng tổng quan vấn đề nghiên cứu 1.1 Khái niệm nhân giống in vitro Nuôi cấy mô tế bào thực vật gọi nuôi cấy thực vật... gồm [16]: Nuôi cấy cây: nuôi cấy thực vật Nuôi cấy phận đ-ợc tách khỏi thực vật: nuôi cấy quan Nuôi cấy phôi thành thục hay ch-a thành đ-ợc tách khỏi thực vật: nuôi cấy phôi Nuôi cấy mô bắt... hoàn chỉnh ph-ơng pháp nuôi cấy in vitro cho dòng PN4 6 PN4 7 Huấn luyện ống nghiệm cấy v-ờn -ơm 2.2 Đối t-ợng nghiên cứu Chúng tiến hành nghiên cứu nhân giống cho hai dòng PN4 6 PN4 7 Hai dòng đ-ợc