2.3.2.1 Xác định Salmonella trong thực phẩm (PHỤ LỤC AOAC 991,38).
2.3.2.2 Xác định Clostrodium Perfringens (PHỤ LỤC AOAC 976.30)
Chuẩn bị:
(a) Đối với lưu trữ và vận chuyển
.-Sử dụng kỹ thuật vô trùng, chuyển 50 g mẫu thử vào túi nhựa vô trùng như Whirl - Pak và thêm 50 g vô trùng đệm glycerol - dung dịch muối. Trộn đều bằng cách nhào túi hoặc khuấy với Pipet tiệt trùng. Cho dung dịch hòa lẫn vào thực phẩm rắn trong 10 phút trước khi đông lạnh. Xử lý mẫu thử nghiệm chất lỏng như nước thịt bò hoặc nước thịt với đôi sức mạnh (20% glycerol), giải pháp để có được nồng độ cuối cùng là 10% glycerol. Đông lạnh mẫu thử càng nhanh càng tốt trong tủ lạnh nhiệt độ cực thấp ở -68 ° C hoặc, bằng cách đặt trong hộp kim loại bịt kín và lưu trữ với CO2 rắn trong thùng chứa đem đi cách ly. Để vận chuyển mẫu trong phòng thí nghiệm, đặt trong hộp kim loại bịt kín và đóng gói trong cách điện tốt xốp vận chuyển thùng với đủ khí CO2 rắn để giữ mẫu trong phòng thí nghiệm đông lạnh trong quá trình vận chuyển. Vận chuyển bởi hầu hết các phương tiện nhanh chóng nhất có thể. Khi nhận được, chuyển mẫu trong phòng thí nghiệm để tủ lạnh nhiệt độ cực thấp ở -68 ° C hoặc bổ sung CO2 vững chắc trong vận chuyển thùng để duy trì nhiệt độ ở khoảng -56 ° C cho đến khi mẫu trong phòng thí nghiệm có thể được kiểm tra. Mẫu trong phòng thí nghiệm rã đông và tiến hành như trong (b) không chậm trễ.
(b) Đối với phân tích.
-Sử dụng kỹ thuật vô trùng,cho 50 g mẫu thực phẩm vào máy xay sinh tố bình vô trùng. Thêm 450 ml peptone pha loãng H2O và đồng nhất 2 phút ở tốc độ thấp (13 000 rpm). Sử dụng tỉ lệ 1:10 pha loãng này để chuẩn bị pha loãng nối tiếp 10-2 đến 10-6 bằng cách chuyển 10 ml 1:10 pha loãng đến 90 ml trống pha loãng, trộn lẫn hợp với lắc nhẹ nhàng, và tiếp tục cho đến khi pha loãng 10-6 đạt được.
(c) Kỹ thuật đếm trên màng
Đổ thạch khoảng 5 ml TSC không có lòng đỏ trứng vào mỗi mười 100 eqn_5. gif 15 mm Đĩa Petri và trải đều bằng cách quay nhanh đĩa. Khi thạch đã đông đặc, dán nhãn và vô trùng Pipet 1 ml mỗi nồng độ pha loãng lên bề mặt thạch trong trung tâm của đĩa. Đổ thêm 15 ml thạch TSC không có lòng đỏ trứng vào đĩa và trộn đều bằng que cấy bằng cách nhẹ nhàng xoay đĩa.
Ngoài ra, với que trải thủy tinh vô trùng, trải 0,1 ml pha loãng lên đĩa đã đổ trước thạch TSC chứa lòng đỏ trứng nhũ tương. Cho đĩa hấp thụ nguồn sinh khối 5-10 phút; sau đó phủ lên với 10 ml thạch TSC không có lòng đỏ trứng. (Thạch TSC chứa lòng đỏ trứng được ưa thích đối với thực phẩm cũng có thể chứa sulfite-giảm khác Clostridium spp.)
Khi thạch đã đông đặc, đặt đĩa ở nơi vị trí thẳng đứng trong bình kỵ khí. Để trong điều kiện yếm khí, và ủ bình 20 giờ ở 35 ° C trong môi trường thạch TSC không có lòng đỏ trứng và 24 giờ ở 35 ° C trong môi trường thạch TSC với lòng đỏ trứng. Sau khi ủ, loại bỏ đĩa từ bình và quan sát sự phát triển và đếm các khuẩn lạc màu đen. Chọn đĩa có số lượng ước tính 20-200 khuẩn lạc màu đen. Sử dụng Quebec đếm khuẩn lạc với miếng khăn giấy trắng trên khu vực đếm, đếm khuẩn lạc màu đen và tính toán số lượng Clostridium spp. C. perfringens trong môi trường có chứa lòng đỏ trứng có màu đen và thường được bao quanh bởi vùng
2-4mm kết tủa màu trắng do hoạt động lecithinase. Tuy nhiên, do một vài chủng là yếu hay âm tính đối với lecithinase, tính bất kỳ khuẩn lạc màu đen nghi là C. perfringens và xác nhận danh tính như trong (d).
(d) Phương pháp khẳng định
Chọn 10 khuẩn lạc đặc trưng từ đĩa đếm được (20-200 khuẩn lạc), cấy từng vào ống chất lỏng môi trường thioglycollate, và ủ 18-24 giờ ở 35 ° C. Phết tế bào nhuộm Gram của nền chất lỏng nuôi cấy thioglycollate và kiểm tra độ tinh khiết và sự hiện diện ngắn, dày, vi khuẩn Gram dương đặc trưng của C. perfringens. Vết bị ô nhiễm nền nuôi cấy trên môi trường thạch TSC chứa lòng đỏ trứng và ủ đĩa kỵ khí 24 giờ ở 35 ° C để có được nền nuôi cấy thuần. Đâm-cấy đệm nhu động-nitrat và lactose dụng cụ cấy truyền gelatin thành vòng 2 mm chất lỏng tinh khiết thioglycollate nuôi cấy hoặc một phần của khuẩn lạc phân lập từ TSC đĩa thạch. Cấy hình thành bào tử canh với 1 ml nuôi cấy thioglycollate chất lỏng và ủ 24 giờ ở 35 ° C.
Kiểm tra ống đệm môi trường hoạt lực-nitrat bởi ánh sáng truyền qua cho loại hình tăng trưởng theo đâm. Khuẩn lạc không di động tăng trưởng chỉ trong và dọc theo dòng đâm. Khuẩn lạc di động hơn tăng trưởng khuếch tán ra môi trường từ đường đâm.
Kiểm tra môi trường đường lactose gelatin sinh khí và thay đổi màu sắc từ đỏ sang vàng, chỉ ra rằng lactose được lên men với sản sinh ra axit. Ống lạnh 1 giờ ở 5 ° C và kiểm tra gelatin hóa lỏng. Nếu rắn lại môi trường, kìm hãm thêm 24 giờ ở 35 ° C và lặp lại thử nghiệm cho gelatin hóa lỏng. Hãy phết tế bào nhuộm Gram từ bào tử canh và kiểm tra bằng kính hiển vi đối với bào tử. Báo cáo có hoặc không bào tử được tạo ra. Lưu trữ bào tử sinh ra trên nền nuôi cấy ở 4 ° C nếu thử nghiệm thêm các chủng mong muốn.
Không di động, trực khuẩn Gram dương, sản xuất khuẩn lạc màu đen trong môi trường thạch TSC, giảm nitrat để nitrit, sản xuất ra axit và khí từ lactose, và hóa lỏng gelatin trong vòng 48 giờ được tạm xác định là C. perfringens.
Sinh vật nghi là C. perfringens không đáp ứng các tiêu chí đã nêu ở trên phải được xác nhận bằng cách kiểm tra thêm. môi trường chất lỏng nuôi cấy thioglycollate phân lập không hóa lỏng gelatin hoặc là điển hình ở khía cạnh khác. Ủ 24 giờ ở 35 ° C, phết tế bào nhuộm Gram, và kiểm tra độ tinh khiết. Cấy một ống PY trung bình, C (g), có chứa 1% salicin và một ống có chứa 1% raffinose với 0,1 ml chất lỏng thioglycollate nuôi cấy. Ủ dụng cụ cấy truyền 24 giờ ở 35 ° C và kiểm tra PY-salicin đối với axit và khí đốt. Chuyển 1,0 ml nuôi cấy để kiểm tra ống và thêm 1-2 giọt 0,04% phenol đỏ. Màu vàng chỉ ra axit được sản xuất từ salicin. (Salicin thường không được lên men bằng C. perfringens nhưng nhanh chóng lên men với sản sinh ra axit và khí của các loài có quan hệ gần gũi.)
Tính toán số C. perfringens trong mẫu thử nghiệm trên cơ sở phần trăm các khuẩn lạc thử nghiệm được xác nhận như C. perfringens.
2.3.2.3 Xác định Escherichia coli (PHỤ LỤC AOAC 988,19)
(a) Chuẩn bị:
Chuẩn bị tất cả các độ pha loãng thập phân với 90 ml chất pha loãng vô trùng, peptone pha loãng H2O, cộng với 10 ml pha loãng trước trừ trường hợp quy định. Lắc tất cả các độ pha loãng 25 lần trong 30 cm vòng cung. Pipets phải hút chính xác thể tích yêu cầu. Không sử dụng để hút <10% tổng thể tích của chúng. Ví dụ, để hút 1 ml, không sử dụng Pipet> 10 ml; để hút 0,1 ml, không sử dụng Pipet> 1 ml.
Thực phẩm đông lạnh hoặc ướp lạnh.-Sử dụng cân vô trùng có dung lượng >=2kg với độ nhạy 0,1 g để cân 50 g mẫu chưa rã đông (nếu đông lạnh). Thêm 450 ml dung môi pha loãng, (i) hoặc 966.23A (m) (2) (xem 17.2.01), và pha trộn 2 phút ở 10 000-12 000 rpm. Thời gian pha trộn cho mỗi mẫu kiểm tra không quá 15 phút cho đến khi tất cả các các độ pha loãng được thực hiện với dụng cụ cấy truyền thích hợp.
Nếu toàn bộ mẫu kiểm tra có khối lượng <50 g, trọng lượng tỷ lệ tương đương với 1/2 mẫu kiểm tra và thêm khối lượng của dung môi pha loãng vô trùng cần thiết để làm pha loãng 1:10. Tổng khối lượng trong bình máy trộn phải bao gồm lưỡi dao.
(b) Xác định
(1) Ống thí nghiệm được sử dụng trong phương pháp MPN cần được kiểm tra dưới ánh sáng tia cực tím để đảm bảo thủy tinh không phát huỳnh quang.
(2) Để tránh huỳnh quang dương tính giả, ánh sáng tia cực tím sóng dài được sử dụng trong phương pháp không được vượt quá 6 watt (Blak-Ray, mẫu UVL-56 [có sẵn từ UVP, Inc], hoặc tương đương).
Sắp xếp 3 ống MPN thành chuỗi trong canh lauryl sulfate tryptose có chứa MUG, (g), hút 1 ml inocula và pha loãng với các tỷ lệ 1:10, 1:100, 1:1000, mỗi ống ba lần ở mỗi độ pha loãng. Ủ trong 24 ± 2 giờ ở 35 ° C và điều chỉnh để ánh sáng huỳnh quang ở mức trung bình khi ống được giữ dưới ánh sáng tia cực tím sóng dài (336 nm).
Xếp các ống huỳnh quang dương tính lên bản Levine, (b), và ủ bản 24 ± 2 giờ ở 35 ° C.
Chọn 2 hoặc nhiều hơn các khuẩn lạc đặc trưng được phân lập từ bản Levine và chuyển đến thạch nghiêng được chuẩn bị từ môi trường thạch, (a). Ủ 18-24 giờ ở 35 ° C. Nếu các khuẩn lạc điển hình không có mặt, chọn 2 hoặc nhiều hơn các khuẩn lạc có nhiều khả năng là E. coli. Chọn > = 2 từ mỗi bản
Xác nhận E. coli theo quy định tại 966,24.
AOAC Official Method 991.38 Salmonella in Foods
AOAC Official Method 976.30 Clostridium perfringens in Foods
AOAC Official Method 988.19 Escherichia coli in Chilled or Frozen Foods