Đánh giá đáp ứng miễn dịch của trâu bò sau khi tiêm vaccine lỡ mồm long móng tại thị xã điện bàn, tỉnh quảng nam

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM PHẠM BẢO HỒI ĐÁNH GIÁ ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA TRÂU BỊ SAU TIÊM VACCINE LỞ MỒM LONG MÓNG TẠI THỊ XÃ ĐIỆN BÀN, TỈNH QUẢNG NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ THÚ Y Chuyên ngành: THÚ Y HUẾ - 2018 ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM PHẠM BẢO HỒI ĐÁNH GIÁ ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA TRÂU BÒ SAU TIÊM VACCINE LỞ MỒM LONG MÓNG TẠI THỊ XÃ ĐIỆN BÀN, TỈNH QUẢNG NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ THÚ Y Chuyên ngành: THÚ Y Mã số: 8640101 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS LÊ VĂN PHƯỚC TS TRẦN QUANG VUI HUẾ - 2018 i LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu khoa học riêng Các số liệu, kết nêu Luận văn thân trực tiếp điều tra, thu thập theo dõi với thái độ hoàn toàn khách quan trung thực, chưa cơng bố cơng trình khác Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực Luận văn cảm ơn thơng tin trích dẫn Luận văn rõ nguồn gốc./ Huế, ngày tháng 02 năm 2018 Tác giả luận văn Phạm Bảo Hoài ii LỜI CẢM ƠN Trong trình học tập thực luận văn này, hướng dẫn trực tiếp TS Trần Quang Vui Trước hết xin chân thành cảm ơn quý thầy cô giáo khoa Chăn ni Thú y, phịng Đào tạo Sau Đại học, trường Đại học Nông Lâm – Đại Học Huế, giảng dạy, truyền đạt kiến thức cho suốt thời gian học tập Trường Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy hướng dẫn TS Trần Quang Vui, người dành nhiều thời gian q báu tận tình giúp đỡ tơi suốt q trình thực hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn đến: Lãnh đạo chi cục, tập thể Trạm chẩn đoán, xét nghiệm bệnh động vật, Chi cục Thú y vùng III, Lãnh đạo chi cục, tập thể Trạm chẩn đoán, xét nghiệm bệnh động vật, Chi cục Thú y vùng VI, Lãnh đạo tồn thể cán Chi cục Chăn ni Thú y tỉnh Quảng Nam, Lãnh đạo toàn thể cán Trạm Chăn nuôi Thú y Điện Bàn, đặc biệt cán thú y 03 xã: Điện Phong, Điện Trung, Điện Quang, Gia đình, bạn bè, đồng nghiệp tạo điều kiện, động viên, giúp đỡ tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Huế, ngày tháng 02 năm 2018 Tác giả luận văn Phạm Bảo Hồi iii TĨM TẮT LUẬN VĂN Đề tài “Đánh giá đáp ứng miễn dịch trâu bị sau tiêm vaccine Lở mồm long móng thị xã Điện Bàn, tỉnh Quảng Nam” tiến hành từ tháng 8/2017 đến tháng 02/2018 thị xã Điện Bàn, tỉnh Quảng Nam Mục tiêu nghiên cứu điều tra tình hình tiêm phịng vaccine Lở mồm long móng (LMLM) trâu bị địa bàn thị xã Điện Bàn giai đoạn 2013 – 2017, xác định tỷ lệ bảo hộ yếu tố ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch sau tiêm vaccine LMLM trâu bò type O Nghiên cứu thực thông qua việc thu thập thông tin điều tra đánh giá khả đáp ứng miễn dịch 179 trâu bò sau tiêm vaccine Lở mồm long móng type O 03 xã: Điện Phong, Điện Trung, Điện Quang thị xã Điện Bàn, tỉnh Quảng Nam Hiệu giá kháng thể sau tiêm vaccine xác định phương pháp xét nghiệm kỹ thuật trung hòa virus theo mã số quy trình V615-10 Định type virus phương pháp ELISA Kết cho thấy, tỷ lệ tiêm vaccine LMLM trâu bò xã 95,48%; tỷ lệ bảo hộ sau tiêm vaccine 21 ngày 91,52%, 28 ngày 88,13%, 70 ngày 81,96%; tỷ lệ bảo hộ nhóm tuổi năm tuổi 84,86%, – năm tuổi năm tuổi 100%; tỷ lệ bảo hộ đực tương đương nhau, 87,12 87,23; tỷ lệ bảo hộ nhóm có bổ sung thức ăn tinh 96,72%, nhóm khơng bổ sung 64,40%; hiệu giá kháng thể sau tiêm vaccine LMLM đợt cao (GMT = 8,42) so với đợt (GMT = 8,01); virus gây bệnh LMLM địa bàn tỉnh Quảng Nam type O iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN .ii TÓM TẮT LUẬN VĂN iii MỤC LỤC iv DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT vii DANH MỤC BẢNG BIỂU viii DANH MỤC BIỂU ĐỒ ix MỞ ĐẦU 1 ĐẶT VẤN ĐỀ MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CHƯƠNG TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 VACCINE 1.1.1 Khái niệm vaccine 1.1.2 Đặc tính vaccine 1.1.3 Phân loại vaccine 10 1.1.4 Nguyên lý sử dụng vaccine 10 1.2 MIỄN DỊCH VÀ SỨC ĐỀ KHÁNG CỦA CƠ THỂ 11 1.2.1 Khái niệm miễn dịch 11 1.2.2 Các quan miễn dịch 11 1.2.3 Cơ chế miễn dịch 17 1.2.4 Phân loại miễn dịch 18 1.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch 19 1.2.6 Kết kết hợp kháng nguyên kháng thể 23 1.2.7 Hợp tác tế bào đáp ứng miễn dịch 24 1.3 KHÁI QUÁT TÌNH HÌNH BỆNH LMLM 24 1.3.1 Khái quát tình hình bệnh LMLM giới 24 v 1.3.2 Khái quát tình hình bệnh LMLM Việt Nam 26 1.3.3 Khái quát tình hình bệnh LMLM Quảng Nam 29 1.4 BỆNH LỞ MỒM LONG MÓNG 30 1.4.1 Loài vật mắc bệnh 30 1.4.2 Chất chứa virus 31 1.4.3 Đường xâm nhập nhân lên virus 31 1.4.4 Dịch tễ 32 1.4.5 Cách sinh bệnh 33 1.4.6 Cách truyền lây 33 1.4.7 Triệu chứng, bệnh tích 34 CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36 2.1 PHẠM VI, ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 36 2.1.1 Phạm vi nghiên cứu 36 2.1.2 Đối tượng nghiên cứu 36 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 36 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36 2.3.1 Phương pháp điều tra chọn mẫu nghiên cứu 36 2.3.2 Phương pháp định lượng kháng thể sau tiêm vaccine LMLM 37 2.3.3 Phương pháp định type virus LMLM 38 2.3.4 Phương pháp xử lý số liệu 38 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 39 3.1 TÌNH HÌNH TIÊM PHỊNG VACCINE LỞ MỒM LONG MĨNG TRÂU BỊ CỦA 03 XÃ ĐIỆN PHONG, ĐIỆN TRUNG, ĐIỆN QUANG TỪ NĂM 2013 – 2017 39 3.2 ĐÁNH GIÁ ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH SAU TIÊM VACCINE LỞ MỒM LONG MÓNG THEO THỜI ĐIỂM LẤY MẪU 40 3.3 ĐÁNH GIÁ ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH SAU TIÊM VACCINE LỞ MỒM LONG MÓNG THEO NHÓM TUỔI 42 3.4 ĐÁNH GIÁ ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH SAU TIÊM VACCINE LỞ MỒM LONG MĨNG THEO TÍNH BIỆT 44 vi 3.5 ĐÁNH GIÁ ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH SAU TIÊM VACCINE LỞ MỒM LONG MÓNG THEO THỨC ĂN BỔ SUNG 46 3.6 ĐÁNH GIÁ ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH SAU TIÊM VACCINE LỞ MỒM LONG MĨNG THEO ĐỢT TIÊM PHỊNG 49 3.7 ĐỊNH TYPE VIRUS GÂY BỆNH LỞ MỒM LONG MÓNG TRÊN ĐỊA BÀN TỈNH QUẢNG NAM 51 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 52 4.1 KẾT LUẬN 52 4.2 ĐỀ NGHỊ 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 PHỤ LỤC I 56 QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG KHÁNG THỂ KHÁNG VIRUS LỞ MỒM LONG MĨNG BẰNG KỸ THUẬT TRUNG HỊA TRÊN TẾ BÀO ĐỘNG VẬT .56 PHỤ LỤC II 63 PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM ĐỊNH TYPE VIRUS LMLM BẰNG KỸ THUẬT AgELISA 63 vii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT - LMLM :Foot-and-Mouth Disease (Bệnh lở mồm long móng) - FMDV : Foot-and-Mouth Disease Virus (Virus lở mồm long móng) - OIE : World Organisation for Animal Health- Office des Epizooties (Tổ chức Thú y giới) - VIA : Virus infection associated - BHK : Baby Hamster Kidney - TCID50 : 50% Tissue Culture Infectious Dose - ELISA : Enzyme-Linked Immunosorbent Assay - EITB : Enzyme-linked immuno-electro-transfer blot - PBS : Phosphate Buffered Saline viii DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 3.1 Tỷ lệ tiêm phòng vaccine LMLM trâu bò qua năm 39 Bảng 3.2 Hiệu giá kháng thể LMLM trâu bò theo thời điểm lấy mẫu sau tiêm phòng vaccine 40 Bảng 3.3 Hiệu giá kháng thể LMLM trâu bị theo nhóm tuổi 43 Bảng 3.4 Hiệu giá kháng thể LMLM trâu bò theo tính biệt 45 Bảng 3.5 Hiệu giá kháng thể LMLM trâu bò theo chế độ dinh dưỡng 48 Bảng 3.6 Hiệu giá kháng thể LMLM trâu bò theo đợt tiêm phòng 50 63 PHỤ LỤC II PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM ĐỊNH TYPE VIRUS LMLM BẰNG KỸ THUẬT AgELISA - Giới thiệu Kít dùng để phát kháng nguyên virus lở mồm long móng (FMDV) với serotype O, A, C, Asia-1 Nguyên liệu cung cấp phịng thí nghiệm tham chiếu Pirbright (Anh), với nguyên liệu đủ để xét nghiệm tối thiểu 360 mẫu gồm: Các nguyên liệu bẫy kháng thể phủ đáy đĩa rabbit antisera bao gồm serotype FMDV O, A, C Asia-1 Các nguyên liệu phát kháng thể (guinea pig antisera) bao gồm serotype FMDV O, A, C Asia-1 Một kháng thể kháng guinea pig –Conjugate horse immunoglobulin peroxidase (HRP) Các kháng nguyên (antigen) FMDV sản xuất dòng tế bào bất hoạt binary ethyleneimine (BEI) Kit dựa kỹ thuật ELISA gián tiếp sandwich (indirect sandwich ELISA technique) để xác định diện FMDV mẫu mô mô tả Le Blanc Roeder Smith (1987); Ferris Dawson (1988) Kháng thể bắt bẫy rabbit antisera serotype khác FMDV gắn đáy đĩa Với việc bổ sung mẫu xét nghiệm, kháng ngun (nếu có) bị bắt dính với kháng thể phủ trước Và guinea pig kháng FMDV sau thêm vào phản ứng (bắt dính) với kháng ngun bị bắt dính trước Các kháng thể kháng guinea pig (conjugate) tiếp tục thêm vào Bằng việc bổ sung chất phát màu, sản phẩm có màu sắc tạo mà đo máy đọc điều giải thích kết mẫu xét nghiệm 64 Hình ảnh minh họa phản ứng ELISA - Các thiết bị + Máy đọc đĩa ELISA Máy đọc đĩa ELISA có kính lọc 492nm tương đương: máy ELISA-EPOCK mã HT-ELISA02-NS-2010 + Máy ủ lắc: HT-MUK01-NS-2010 HT-MUK02-NS-2002 + Dụng cụ rửa đĩa: Bằng tay máy rửa đĩa tự động, bán tự động (HT-MRE01-NS-2010) + Pipette Pipette đa kênh (multichannel pipette) từ 5-50μl, 50-300μl đầu tip tương ứng; Pipette đơn (single pipette) từ 0.5-10μl, 10-100μl, 100-1000μl đầu tip tương ứng Dụng cụ chứa nguyên liệu (Reservoirs) Dụng cụ chứa nguyên liệu dùng cho pipette đa kênh + Hệ thống nước Tối thiểu nước cất lần/nước khử ion + Tủ lạnh mát Có nhiệt độ từ +1 đến +8 oC (HT-TLT02-NS-2006, HT-TLT10-NS-2015, HTTLT11-NS-2015, HT-TLT13-LIFSAP-2015) Tủ lạnh âm Có nhiệt độ từ -30oC đến -5oC (HT-TL05-FAO-2006) âm -90oC đến -50 oC (BL-TL12-LIFSAP-2015) + Tủ ấm Có nhiệt độ dao động từ +35oC đến +39 oC (VT-TA06-NS-2003) + Dụng cụ đo pH (được cung cấp kít ) 65 + Các chai lọ thủy tinh nhựa Chứa 20-400ml, 50-1000ml, 10-2000ml, 1-20ml,….vv Lọ nhỏ: Dùng để giữ nguyên liệu Máy trộn nhỏ (Vortex Mixer) – (HT-MLTMN10-NS-2013) Cân điện tử - (HT-CPT01-VAHIP-2009) Đồng hồ (Timer) Đồng hồ đếm thời gian có báo âm kết thúc + Cây viết : dùng để đánh dấu đĩa - Quy cách nguyên liệu + Kháng thể bắt bẫy-(Trapping Antibody) Rabbit anti FMDV serotype O, A, C Asia-1 Tất rabbit antisera dạng đông khô Giữ nhiệt độ +1 đến +8oC tủ mát HT-TLT11-NS-2015 phòng Huyết + Đối chứng Antigen (Control Antigen) FMDV serotype O, A, C Asia-1 Tất đối chứng Antigen dạng đông khô Giữ nhiệt độ +1 đến +8oC tủ mát HT-TLT11-NS-2015 phòng Huyết + Kháng thể phát hiện-(Detecting antibody Guinea Pig) Guinea pig kháng FMDV serotype O, A, C Asia-1 Tất Guinea pig dạng đông khô Giữ nhiệt độ +1 đến +8oC tủ mát HT-TLT11-NS-2015 phòng Huyết + Conjugate Horseradish peroxidase-conjugate rabbit anti guinea pig Tất dạng đông khô Giữ nhiệt độ +1 đến +8oC tủ mát HT-TLT11-NS-2015 phòng Huyết + Dung dịch đệm dùng để phủ đĩa (Coating Buffer) Carbonate/bicarbonate dạng viên Giữ nhiệt độ phòng 66 + Nước rửa/và nước dùng để pha nguyên liệu (Wash/Diluent Buffer) Phosphate buffer saline (PBS) dạng viên Giữ nhiệt độ phòng + Dung dịch làm Tween 20, dạng dung dịch Giữ nhiệt độ phòng + Chất xúc tác (Blocking Agent) Sữa Skim milk Giữ âm -30oC đến -5oC tủ lạnh HT-TLT13-LIFAP-2015 phòng Huyết + Hoạt chất (Substrate) Hydrogen peroxide dạng viên Giữ nhiệt độ +1 đến +8oC tủ mát HT-TLT11-NS-2015 phòng Huyết + Chất phát màu (Chromogen) OPD: Ortho Phenylenediamin dạng viên 30mg Giữ nhiệt độ +1 đến +8oC tủ mát HT-TLT11-NS-2015 phòng Huyết + Dung dịch nước dùng để hoàn nguyên nguyên liệu(Water Diluent 1) Giữ nhiệt độ +1 đến +8oC tủ mát HT-TLT11-NS-2015 phòng Huyết + Dung dịch nước dùng để hoàn nguyên nguyên liệu(Water Diluent 2) Giữ nhiệt độ +1 đến +8oC tủ mát HT-TLT11-NS-2015 phòng Huyết + Dung dịch đệm cho chất phát màu (Chromogen Buffer) Phosphate Citrate buffer dạng viên Giữ nhiệt độ +1 đến +8oC tủ mát HT-TLT11-NS-2015 phòng Huyết + Đĩa phản ứng (Microplates) Đĩa hấp phụ kháng thể NUNC Immunoplate, Maxisorp Giữ + oC đến 15oC phịng Huyết - Hồn ngun giữ ngun liệu + Giữ kháng thể bắt bẫy-(Trapping Antibody Stocks) Hoàn nguyên rabbit antiserum FMDV serotype O, A, C Asia-1 dạng đông khô với 0.5ml dung dịch Diluen cung cấp sẵn kít 67 Tất rabbit antiserum pha loãng 1/1000 coating buffer sử dụng Nguyên liệu chia thành nhiều ống nhỏ, ống đủ xét nghiệm 1-2 lần, bảo quản nhiệt độ âm -90 oC đến -50oC tủ lạnh âm BL-TL12-LIFSAP-2015 phịng lưu mẫu Ngun liệu giải đơng nhiệt độ phòng (20-25°C) ngăn mát tủ lạnh trước sử dụng Giữ kháng thể phát hiện-(Detecting antiserum Guinea Pig Stocks) Hoàn nguyên guinea pig antiserum FMDV serotype O, A, C Asia-1 dạng đông khô với 0.5ml dung dịch Diluen cung cấp sẵn kít Tất Guinea pig antiserum pha loãng 1/100 Buffer B sử dụng Nguyên liệu chia thành nhiều ống nhỏ, ống đủ xét nghiệm 1-2 lần, bảo quản nhiệt độ âm -90 oC đến -50oC tủ lạnh âm BL-TL12-LIFSAP-2015 phòng lưu mẫu Ngun liệu giải đơng nhiệt độ phịng (20-25°C) ngăn mát tủ lạnh trước sử dụng Giữ Conjugate Hồn ngun Conjugate dạng đơng khơ với 1ml dung dịch Diluen cung cấp sẵn kít Ngun liệu pha lỗng 1/200 Buffer B sử dụng Nguyên liệu chia thành nhiều ống nhỏ, ống đủ xét nghiệm 1-2 lần, bảo quản nhiệt độ âm -30oC đến -5oC tủ lạnh SHPT-TL09-FAO-2006 phịng master mix Giữ Antigen Hồn ngun Antigen serotype O, A, C Asia-1 dạng đông khô với ml dung dịch Diluen cung cấp sẵn kít Nguyên liệu chia thành nhiều ống nhỏ, ống đủ xét nghiệm 1-2 lần, bảo quản nhiệt độ âm -30oC đến -5oC tủ lạnh SHPT-TL09-FAO-2006 phòng master mix Dung dịch đệm cho chất phát màu (Chromogen Buffer) Phosphate-Citrate Buffer, pH 5.0 Pha viên 100ml nước khử ion/nước cất hai lần để tạo thành dung dịch 0.05M phosphate citrate buffer với pH đạt 5.0 (pH 5.0) Giữ nhiệt độ +1 đến +8 oC không tuần Chất phát màu (Chromogen) Viên OPD (30mg) Một viên pha với 50ml Phosphate-Citrate Buffer, pH 5.0 68 Nguyên liệu chia thành nhiều ống falcon 15ml, bọc bao thiếc để tránh ánh sáng, ống đủ xét nghiệm 1-2 lần, bảo quản nhiệt độ âm -30 oC đến -5oC tủ lạnh HT-TLT13-LIFSAP-2015 phịng Huyết Giữ khơng q 1-2 tháng Nguyên liệu giải đông nhiệt độ phòng trước sử dụng Giữ hoạt chất (Substrate) H2O2 dạng viên Pha loãng viên hydrogen peroxide (H2O2) dạng viên với 10ml nước khử ion vô trùng tạo thành dung dịch hydrogen peroxide H2O2 3% Giữ nhiệt độ +1 đến +8 oC tối Nên chiết nhỏ nguyên liệu thành nhiều ống nhỏ, bảo quản tủ lạnh HT— TLT10-NS-2015 phòng Huyết Dung dịch đệm dùng để phủ đĩa (Coating Buffer) 0.05 M Carbonate/bicarbonate, pH 9.6 ± 0.05 Pha viên 100 ml nước cất lần nước khử ion Dán nhãn giữ +1 đến +8oC không tuần tủ lạnh HT-TLT10-NS-2015 phòng Huyết Dung dịch pha mẫu (Sample Buffer) 0.04 M Phosphate Buffer Saline (PBS), pH 7.4 ± 0.02 Pha viên PBS 50 ml nước khử ion nước cất lần Dán nhãn giữ +1 đến 80C không hai tuần tủ lạnh HT-TLT10-NS-2015 phòng Huyết Nên chia nhỏ khoảng 25 ml giữ -300C đến -50C tủ lạnh SHPT-TL04FAO-2006 phòng master mix Dung dịch Buffer A (dùng pha loãng Antigen) 0.01 M PBS đạt pH 7.4 ± 0.20 cộng với 0.05% Tween 20 Ví dụ: Pha viên PBS lít nước cất lần nước khử ion, cho vào 500μl Tween 20, sau lắc Dán nhãn giữ nhiệt độ +1 đến +8 oC khơng q tuần tủ lạnh HT-TLT10-NS-2015 phịng Huyết Dung dịch Buffer B (dùng pha loãng Guinea pig Conjugate) 0.01M PBS, pH 7.4± 0.20; cộng 0.05% Tween 20; cộng 5% sữa Skim milk Ví dụ: 10ml Buffer A thêm vào 0.5g sữa Skim milk Chỉnh pH=7.2-7.4 dung dịch NaOH 1N Nước rửa (Wash Buffer) 0.002 M PBS, pH 7.4± 0.20 69 Ví dụ: Pha viên PBS lít nước cất lần nước khử ion Dán nhãn giữ nhiệt độ phịng khơng q tuần Dung dịch khử trùng 0.2% Acid Citric Pha gam acid citric lít nước khử khống nước cất hai lần Dán nhãn giữ nhiệt độ phòng Dung dịch dừng phản ứng (Stopping Solution) 1.25 M Sulphuric Acid Ví dụ: Lấy 68 ml sulphuric acid nồng độ đậm đặc (18 Mol) pha 932 ml nước cất lần nước khử ion Dán nhãn giữ nhiệt độ phòng Lưu ý: Cho giọt acid vào nước không làm ngược lại Chuẩn bị mẫu Nếu mẫu biểu mơ có dính nhiều chất bẩn (ví dụ đất, bùn…) dính nhiều chất bảo quản glycerol rửa nhẹ nhàng 3-4 lần với dung dịch đệm PBS pH 7.2 Nghiền mẫu cối, chày sứ với bột thuỷ tinh, thêm vào dung dịch đệm 0.04M PBS pH 7.4 ± 0.02 đủ để tạo thành huyễn dịch 10% Cho vào ống falcon 15ml ly tâm 1000g 10 phút Lấy chất lỏng phần ống đem xét nghiệm Ví dụ: Nghiền 0.5g biểu mô, thêm vào 5ml 0.04M PBS pH 7.4 ± 0.02 để tạo thành huyễn dịch 10% Trường hợp kiểm tra virus tế bào (cell culture) ly tâm huyễn dịch tế bào 1000g 10 phút để loại bỏ xác tế bào Chú ý: Mẫu biểu mô lưu trữ PBS 0.04 M nhiệt độ âm -90 đến -500C thời gian dài Ngồi mẫu lưu trữ âm -200C sau bổ sung thêm lượng với glycerol vô trùng (PBS + 50% glycerol) - Các bước thực Chuẩn bị phủ đĩa - Lấy trapping rabbit antiserum từ tủ lạnh âm BL-TL02-VAHIP-2009 lên ngăn mát tủ lạnh, từ ngăn mát tủ lạnh để ổn định nhiệt độ phịng, sau lắc đều-nhẹ nhàng để bảo đảm tính đồng nguyên liệu trước sử dụng - Chuẩn bị pha loãng 1:1000 cho rabbit antiserum serotype O, A, C Asia1 coating buffer pH 9.6 máng chứa ngăn (reservoir ngăn) tương ứng (xem sơ đồ 1) 70 - Cho 50uL rabbit antiserum tương ứng serotype O, A, C Asia-1 pha loãng vào đĩa phản ứng (Maxisorp-NUNC) - Dán kín đĩa ủ lắc liên tục nhiệt độ 35 đến 39 0C máy ủ lắc HT-MUK02-NS-2002 phòng Huyết Ngồi đĩa ủ nhiệt độ +1 đến +8 oC qua đêm (18 giờ) hộp nhựa ẩm ướt Cho mẫu xét nghiệm đối chứng Antigen (Control Antigen) Pha loãng Antigen Control Serotype Type O A Type A B Type C C Asia-1 D Type O E Type A F Type C G Asia-1 H 1/ 1/ 25 1/ 1/ 125 625 Mẫu Mẫu Blank Mẫu Mẫu Mẫu 11 Blank Mẫu 10 Mẫu 12 Mẫu Sơ đồ 1: Sơ đồ bố trí mẫu phản ứng - Chuẩn bị mẫu xét nghiệm (huyễn dịch 10%) vào ống Eppendorf tương ứng, ghi ký hiệu mẫu - Chuẩn bị mẫu đối chứng + Sử dụng đĩa 96 giếng, đáy chữ U; + Cho 60 μl Buffer A vào giếng từ A1 đến H4 Cho 15 μl antigen serotype O vào giếng A1 đĩa 71 Cho 15 μl antigen serotype A vào giếng B1 đĩa Cho 15 μl antigen serotype C vào giếng C1 đĩa Cho 15 μl antigen antigen Asia vào giếng D1 đĩa Sử dụng pipette đa kênh trộn từ giếng hàng A đến hàng D, sau chuyển 15 μl từ giếng đến giếng ( từ hàng A đến D), trộn chuyển 15 μl từ giếng đến giếng 3, trộn chuyển 15 μl từ giếng đến giếng 4, trộn loại bỏ 15 μl từ cộ Đây pha loãng bậc cho đối chứng antigen; - Rửa đĩa phản ứng lần với nước rửa PBS, pH 7.4±0.2 - Cho 50 μl mẫu đối chứng pha loãng vào giếng từ A1 đến D4 đĩa phản ứng - Cho 50 μl Buffer A vào cột hàng A đến D - Cho 50 μl huyễn dịch mẫu vào cột hàng A đến D Tiếp tục cho mẫu lại (xem sơ đồ 1) - Dán kín đĩa ủ lắc liên tục +35 đến +39 0C máy ủ lắc HTMUK02-NS-2002 phòng Huyết - Đem dung dịch chất phát màu chromogen OPD giữ âm -30 đến -50C để nhiệt phòng tránh ánh sáng (trong tối) Chuẩn bị Buffer B Dung dịch BufferA (0.01M PBST) cộng 5% sữa Skim milk Ví dụ: chuẩn bị 100 ml Buffer A thêm vào 5gam sữa Skim milk Điều chỉnh pH dãy pH 7.4±0.20 với dung dịch 0.1M NaOH Chuẩn bị Detecting Antibody-Guinea Pig - Lấy guinea pig từ tủ lạnh âm BL-TL02-VAHIP-2009 lên ngăn mát tủ lạnh, từ ngăn mát tủ lạnh để ổn định nhiệt độ phòng Trước kết thúc giai đoạn ủ antigen mẫu xét nghiệm, chuẩn bị pha loãng guinea pig Buffer B, thực recervoir ngăn Phải lắc trước sử dụng để đảm bảo tính đồng nguyên liệu - Pha loãng guinea pig 1/100 Buffer B cho serotype O, A, C Asia-1 - Sau ủ, lấy đĩa phản ứng từ máy ủ lắc để ổn định nhiệt độ phòng - Rửa đĩa phản ứng lần với nước rửa PBS, pH 7.4±0.2 72 - Cho 50μl guinea pig pha loãng vào hàng A đến hàng H tương ứng với serotype - Dán kín đĩa ủ lắc liên tục nhiệt độ +35 đến +390C máy ủ lắc HT-MUK02-NS-2002 phòng Huyết Chuẩn bị Conjugate - Lấy Conjugate từ tủ lạnh âm SHPT-TL09-FAO-2006, lắc trước sử dụng để đảm bảo tính đồng nguyên liệu - Trước kết thúc giai đoạn ủ Guinea pig, chuẩn bị pha loãng Conjugate 1/200 Buffer B - Sau ủ, lấy đĩa phản ứng từ máy ủ lắc để ổn định nhiệt độ phòng - Rửa đĩa phản ứng lần với nước rửa PBS, pH 7.4±0.2 Cho 50 μl conjugate pha loãng vào tất giếng đĩa phản ứng (không phân biệt serotype nào) - Dán kín đĩa ủ lắc liên tục nhiệt độ 35 đến 39 0C 45 phút máy ủ lắc HT-MUK02-NS-2002 phịng Huyết - Cho 50µl Conjugate vào ống Eppendorf để thử OPD Chuẩn bị dung dịch chất phát màu Substrate/Chromogen dung dịch dừng phản ứng Stop - Chuẩn bị đĩa “blanking plate” đĩa khơng có phủ antibody trapping Đĩa sau dùng xong rửa dán kín giếng chưa sử dụng cho lần xét nghiệm - Sau ủ, lấy đĩa phản ứng từ máy ủ lắc để ổn định nhiệt độ phòng - Rửa đĩa phản ứng lần với nước rửa PBS, pH 7.4±0.2 - Chuẩn bị dung dịch chất phát màu OPD: cho 30μl Substrate- H2O2 3% vào 6ml dung dịch chất phát màu OPD Như H2O2 3% sử dụng 1/200 (sử dụng cho đĩa phản ứng) - Thử dung dịch chất phát màu OPD: cho 100μl dung dịch OPD vào 50μl Conjugate, lắc nhẹ, sau 30 giây dung dịch OPD chuyển sang màu nâu cánh dán - Sau thử, cho 50μl substrate/chromogen vào cột bank đĩa “blanking plate”, sau cho vào tất giếng đĩa phản ứng, đậy nắp để nhiệt độ phòng tối - không lắc - Sau 15 phút ủ substrate/chromogen, cho 50μl dung dịch Stop (1.25M sulphuric acid) vào cột blank đĩa “blanking plate”, sau cho vào tất giếng 73 đĩa phản ứng Lắc máy lắc (hoặc dùng tay vỗ nhẹ vào thành giếng) để bảo đảm hổn hợp trộn Tất giếng lúc chứa 50μl substrate/chromogen 50μl dung dịch Stop + Đọc đĩa phản ứng - Trước đọc đĩa, cần phải đảm bảo khơng có bong bóng giếng nào, điều gây sai số quang học đảm bảo khơng có dấu (ví dụ: dấu vân tay) ngưng tụ thành đĩa phản ứng Nếu cần thiết, làm vỡ bong bóng tip sạch, lau phía đáy đĩa vải mềm - Đọc đĩa bước sóng 492nm máy ELISA-EPOCK mã HT-ELISA02-NS2010, máy tính HT-MT03-NS-2010 phịng máy PCR; - Đọc đĩa “banking plate” trước, đĩa phản ứng - Kết tính tốn phần mềm máy tính HT-MT03-NS-2012: Mycomputer/ổ D/xét nghiệm ELISA/FMDV + Phân tích đánh giá kết Phân tích kết quả: Trước tiên kiểm tra hiển thị màu giá trị đối chứng (Control antigen) nồng độ pha loãng bậc cột đến cột từ hàng A đến hàng D Tính giá trị trung bình cột (cột Blank) cho serotype Tính giá trị trung bình cột Blank đĩa “banking plate” cho serotype Ví dụ: Trên hàng A serotype O, lấy giá trị OD nồng độ pha loãng bậc trừ cho giá trị trung bình cột Blank đĩa “banking plate”, sau tiếp tục trừ giá trị trung bình cột Blank “cột 6” Tương tự tính tốn cho mẫu serotype cịn lại Đánh giá kết quả: Nếu mẫu xét nghiệm có giá trị OD trung bình sau trừ trung bình OD Blank mà > 0.1 mẫu ghi nhận dương tính với serotype tương ứng Nếu mẫu xét nghiệm có giá trị OD trung bình sau trừ trung bình OD Blank dừng 0.1 (=0.1) xét nghiệm lại (retesting) tiến hành phân lập mẫu tế bào (tissus culture) kiểm tra lại ELISA Điều kiện để chấp nhận kết quả: - Đối với serotype đối chứng: có giá trị OD nồng độ pha loãng sau trừ trung bình OD Blank ≥ 0.1 74 - Ở nồng độ pha loãng 1/625 serotype đối chứng có serotype có giá trị OD ≥ 0.1 - Hồ sơ lưu trữ Kết lưu ổ D máy tính (HT-MT03-NS-2012); Hồ sơ quan trắc theo biểu mẫu BM-HD-RAHO3-HT-07-01, cán kỹ thuật, tổ trưởng ký xác nhận chuyển tới phận cửa (Nguồn: Chi cục Thú y vùng III, 2017) 75 PHỤ LỤC III DANH SÁCH Hộ chăn ni có trâu bị lấy mẫu máu định lượng kháng thể kháng virus LMLM serotype O thị xã Điện Bàn, tỉnh Quảng Nam Hộ chăn nuôi Địa Ký hiệu mẫu Bổ sung thức ăn tinh Tuổi Tính biệt 76 PHỤ LỤC IV Giá trị log2(X) (trong X hiệu giá kháng thể độ pha loãng bậc 2) log28 = 3; log211 = 3,45; log216 = 4; log223 = 4,52; log232 = 5; log245 = 5,49; log264 = 6; log291 = 6,50; log2128 = 7; log2181 = 7,49; log2256 = 8; log2362 = 8,49; log2512 = 9; log2724 = 9,49; log21024 = 10 Bảng tính hiệu giá kháng thể độ pha lỗng bậc Mẫu huyết với giá trị PI khác > 50% Huyết pha loãng bậc 2 32 +- ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ 64 +- ++ ++ ++ ++ ++ 128 +- ++ ++ ++ 256 +- ++ Hiệu giá kháng thể 32 45 64 90 128 181 256 >256 77 ... Đề tài ? ?Đánh giá đáp ứng miễn dịch trâu bò sau tiêm vaccine Lở mồm long móng thị xã Điện Bàn, tỉnh Quảng Nam? ?? tiến hành từ tháng 8/2017 đến tháng 02/2018 thị xã Điện Bàn, tỉnh Quảng Nam Mục tiêu... tra đánh giá khả đáp ứng miễn dịch 179 trâu bị sau tiêm vaccine Lở mồm long móng type O 03 xã: Điện Phong, Điện Trung, Điện Quang thị xã Điện Bàn, tỉnh Quảng Nam Hiệu giá kháng thể sau tiêm vaccine. .. tài? ?Đánh giá đáp ứng miễn dịch trâu bò sau tiêm vaccine lở mồm long móng thị xã Điện Bàn, tỉnh Quảng Nam? ?? MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI Mục tiêu đề tài điều tra tình hình tiêm phịng vaccine LMLM trâu bò