Đánh giá đáp ứng miễn dịch dịch thể sau khi tiêm vắc xin tái tổ hợp phòng bệnh do e coli gây ra ở lợn

i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi trực tiếp thực hướng dẫn PGS.TS Đinh Thị Bích Lân giúp đỡ chân tình anh, chị môn Miễn dịch học vắc xin - Viện Công Nghệ Sinh Học – Đại học Huế Các số liệu, hình ảnh kết nêu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình Tơi xin cam đoan thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Thừa Thiên Huế, tháng 05 năm 2018 Tác giả luận văn Nguyễn Hữu Thành ii LỜI CẢM ƠN Trong suốt năm học tập, với nỗ lực thân, nhận giúp đỡ, hướng dẫn tận tình nhiều cá nhân tập thể, đến luận văn tơi hồn thành Nhân dịp này, cho phép tơi bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới: Ban Giám hiệu, quý thầy cô Khoa Chăn nuôi - Thú y, Phòng Đào tạo sau đại học Trường Đại học Nông - Lâm Huế giảng dạy, tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian học tập nghiên cứu khoa học Lãnh đạo Trung tâm Giống vật ni Quảng Bình, Bộ mơn Miễn dịch học Vắc xin - Viện công nghệ sinh học – Đại Học Huế cho phép, giúp đỡ trình học tập nghiên cứu Đặc biệt, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới PGS TS Đinh Thị Bích Lân, tận tâm hướng dẫn, bảo tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt thời gian nghiên cứu hồn thành luận văn Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người thân bạn bè động viên giúp đỡ tơi vượt qua khó khăn suốt trình học tập, nghiên cứu thực đề tài Cuối xin kính chúc tất người thật nhiều sức khỏe, hạnh phúc thành công! Thừa Thiên Huế, tháng 05 năm 2018 Tác giả luận văn Nguyễn Hữu Thành iii TÓM TẮT LUẬN VĂN Đề tài đánh giá đáp ứng miễn dịch dịch thể lợn sau tiêm vắc xin tái tổ hợp phòng bệnh E coli gây lợn Lợn nái tiêm vắc xin vào thời điểm trước phối giống ngày mang thai thứ 90, kiểm tra kháng thể sữa đầu huyết (trước tiêm vắc xin thời điểm nái sinh con) Kết ELISA cho thấy vào thời điểm trước tiêm vắc xin, lượng kháng thể kháng kháng nguyên bám dính E coli huyết lợn nái thấp, giá trị OD450 đạt 0,330 ± 0,048) Vào thời điểm nái sinh con, hàm lượng kháng thể huyết sữa đầu tăng cao, giá trị OD450 kháng thể huyết đạt 0,876 ± 0,045, sữa đầu 1,956 ± 0,445 Kiểm tra kháng thể thụ động lợn sinh từ nái tiêm vắc xin cho thấy lượng kháng thể huyết lợn vào thời điểm ngày tuổi có giá trị OD450 = 0.734 ± 0,029, sau giảm dần, đến thời điểm 28 ngày tuổi, lượng kháng thể huyết lợn thấp (có giá trị OD450 0,329 ± 0,012) Để đánh giá đáp ứng miễn dịch chủ động lợn con, tiến hành tiêm cho lợn mũi vắc xin lúc 35 49 ngày tuổi, lấy máu tuần lần để kiểm tra lượng kháng thể Kết ELISA cho thấy, sau mũi tiêm thứ lượng kháng thể giảm nhanh Vào ngày tuổi 49 (sau mũi tiêm thứ tuần) lượng kháng thể cho giá trị OD450 0,136 ± 0,024 Tuy nhiên sau sau mũi tiêm thứ 2, lượng kháng thể tăng cao kéo dài, giá trị OD450 kháng thể vào thời điểm 63 ngày tuổi 0,980 ± 0,142, sau giảm dần kéo dài đến 119 ngày tuổi (0,457 ± 0,038) Kết nghiên cứu cho thấy lợn lợn nái tiêm mũi vắc xin E coli tái tổ hợp bị tiêu chảy E coli lợn nái không tiêm vắc xin E coli tái tổ hợp Điều chứng tỏ vắc xin có hiệu cao phòng bệnh E coli iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii TÓM TẮT LUẬN VĂN iii MỤC LỤC iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT viii DANH MỤC CÁC BẢNG ix DANH MỤC CÁC HÌNH x MỞ ĐẦU 1 ĐẶT VẤN ĐỀ MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI .2 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN 3.1 Ý nghĩa khoa học 3.2 Ý nghĩa thực tiễn CHƯƠNG TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ E COLI GÂY BỆNH Ở LỢN .3 1.1.1 Tình hình nghiên cứu nước 1.1.2 Tình hình nghiên cứu nước ngồi 1.2 VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI 1.2.1 Đặc điểm hình thái 1.2.2 Đặc tính sinh hóa 1.2.3 Đặc tính ni cấy 1.2.4 Sức đề kháng 1.2.5 Cấu trúc kháng nguyên vi khuẩn E coli 1.2.6 Phân loại 1.3 TÍNH MIỄN DỊCH 1.4 YẾU TỐ ĐỘC LỰC CỦA E COLI 10 v 1.4.1 Độc tố ruột 10 1.4.2 Nhóm độc tố tế bào .12 1.4.3 Độc tố Stx2e 13 1.5 CÁC KHÁNG NGUYÊN BÁM DÍNH CỦA E COLI 14 1.5.1 Kháng nguyên bám dính F4 14 1.5.2 Kháng nguyên bám dính F18 16 1.5.3 Kháng nguyên bám dính F5 18 1.5.4 Kháng nguyên bám dính F6 18 1.5.5 Nghiên cứu sử dụng kháng nguyên bám dính để sản xuất vắc xin 19 1.6 BỆNH DO E COLI GÂY RA Ở LỢN .20 1.6.1 Cơ chế gây bệnh vi khuẩn E coli 20 1.6.2 Triệu chứng 21 1.6.3 Bệnh tích 21 1.6.4 Chuẩn đoán 22 1.7 PHÒNG BỆNH 23 1.7.1 Phòng bệnh chế phẩm sinh học .23 1.7.2 Phòng bệnh kháng sinh 23 1.7.3 Phòng bệnh vắc xin 23 1.8 PHƯƠNG PHÁP ELISA 24 1.8.1 Khái niệm 24 1.8.2 Các phương pháp ELISA thường dùng 25 1.9 VẮC XIN 25 1.9.1 Lịch sử đời vắc xin 25 1.9.2 Định nghĩa 26 1.9.3 Đặc tính vắc xin 26 1.9.4 Các loại vắc xin 27 1.9.5 Thành phần vắc xin 28 1.9.6 Nguyên lý 29 vi 1.9.7 Một số điều cần ý sử dụng vắc xin 29 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 34 2.2 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 34 2.3 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU .34 2.3.1 Vắc xin 34 2.3.2 Hóa chất 34 2.3.3 Dụng cụ thiết bị 35 2.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 35 2.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 2.5.1 Phương pháp lấy mẫu tách huyết .35 2.5.2 Nghiên cứu đáp ứng kháng thể chủ động lợn nái sau tiêm vắc xin E coli tái tổ hợp 36 2.5.3 Nghiên cứu đáp ứng kháng thể thụ động lợn sinh từ lợn nái tiêm vắc xin E coli tái tổ hợp 36 2.5.4 Nghiên cứu đáp ứng kháng thể chủ động lợn sau cai sữa tiêm phòng vắc xin E coli tái tổ hợp 36 2.5.5 Theo dõi tỷ lệ tiêu chảy lợn theo mẹ sau tiêm phòng vắc xin E coli tái tổ hợp 37 2.5.6 Đánh giá khả bảo hộ vắc xin E coli tái tổ hợp lợn sau cai sữa 37 2.5.7 Phương pháp ELISA gián tiếp 37 2.5.8 Phương pháp xử lý số liệu 38 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 39 3.1 ĐÁNH GIÁ ĐÁP ỨNG KHÁNG THỂ CHỦ ĐỘNG Ở LỢN NÁI SAU KHI TIÊM VẮC XIN E COLI TÁI TỔ HỢP 39 3.2 ĐÁNH GIÁ ĐÁP ỨNG KHÁNG THỂ THỤ ĐỘNG Ở LỢN CON SINH RA TỪ LỢN NÁI ĐƯỢC TIÊM VẮC XIN E COLI TÁI TỔ HỢP 40 vii 3.3 ĐÁNH GIÁ ĐÁP ỨNG KHÁNG THỂ CHỦ ĐỘNG Ở LỢN CON SAU CAI SỮA KHI TIÊM PHÒNG VẮC XIN E COLI TÁI TỔ HỢP 42 3.4 THEO DÕI TỶ LỆ TIÊU CHẢY CỦA LỢN CON THEO MẸ SAU KHI TIÊM PHÒNG VẮC XIN E COLI TÁI TỔ HỢP 43 3.5 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG BẢO HỘ CỦA VẮC XIN E COLI TÁI TỔ HỢP ĐỐI VỚI LỢN SAU CAI SỮA .45 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46 4.1 KẾT LUẬN 46 4.2 ĐỀ NGHỊ 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 PHỤ LỤC 55 viii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT AEEC : Adhesive Enteropathogeneic E coli Ci : Simmons’ Citrate Cs : Cộng DAEC : Diffusely adherent E Coli EIEC : Enteroinvasive E coli EMB : Methylene Blue ELISA : Enzyme Linked Immunosorbent Assay ETEC : Enterotoxigenic Escherichia coli EPEC : Enteropathogeneic E Coli F : Kháng nguyên Fimbriae KIA : Kligler Iron Agar LT : Heat Labile Toxin MC : MacConkey MR : Methyl Red ST : Heat Stable Toxin VTEC : Verotoxigeneic E coli VP : Proskauer ix DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Kết ELISA đánh giá đáp ứng miễn dịch lợn nái sau tiêm vắc xin E coli tái tổ hợp 39 Bảng 3.2 Tỷ lệ tiêu chảy lợn theo mẹ 44 Bảng 3.3 Theo dõi tỷ lệ tiêu chảy nhóm lợn tiêm không tiêm vắc xin 45 x DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 3.1 Đáp ứng miễn dịch lợn nái tiêm vắc xin E coli tái tổ hợp 40 Hình 3.2 Kết ELISA đánh giá đáp ứng kháng thể thụ động lợn sinh từ lợn nái tiêm vắc xin E coli tái tổ hợp 41 Hình 3.3 Đáp ứng kháng thể chủ động lợn cai sữa tiêm vắc xin E coli tái tổ hợp 42 Hình 3.4 Tỷ lệ tiêu chảy lợn 43 42 3.3 ĐÁNH GIÁ ĐÁP ỨNG KHÁNG THỂ CHỦ ĐỘNG Ở LỢN CON SAU CAI SỮA KHI TIÊM PHÒNG VẮC XIN E COLI TÁI TỔ HỢP Thí nghiệm đánh giá đáp ứng miễn dịch chủ động lợn sau cai sữa tiến hành 50 lợn lợn nái chưa tiêm vắc xin E coli tái tổ hợp Tiến hành tiêm vắc xin E coli tái tổ hợp vào thời điểm lúc lợn 35 49 ngày tuổi Huyết thu thập trước vào trước lúc lợn tiêm vắc xin lần sau định kỳ lấy mẫu 14 ngày lần Kết đánh giá đáp ứng kháng thể chủ động lợn sau cai sữa trình bày hình 3.3 Hình 3.3 Đáp ứng kháng thể chủ động lợn cai sữa tiêm vắc xin E coli tái tổ hợp Theo Jayappa cs (2001); Wegner cs (2012), kháng thể mẹ truyền mức độ cao cản trở làm giảm hiệu vắc xin Vì chọn thời điểm lúc lợn 35 ngày tuổi, lượng kháng thể thụ động xuống thấp kết cho thấy trước tiêm vắc xin, lợn lúc 35 ngày tuổi khơng có kháng thể E coli với giá trị trung bình 0,061 ± 0,01 (