đặc điểm và sự biến đổi của các chủng virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn tại việt nam

Trong nghiên cứu này, 22 chủng virus PRRSđã được phân lập từ các mẫu bệnh phẩm thu thập tại Việt Nam trong giai đoạn 2011 – 2014 và được tiến hành giải trình tự và phân tích so sánh vùng

M VÀ SỰ BIẾN ĐỔI DI TRUYỀN

NG VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐ

N VÀ HÔ HẤP Ở LỢN TẠI VIỆT NAM

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

ĐỖ HẢI QUỲNH

ĐẶC ĐIỂM VÀ SỰ BIẾN ĐỔI DI TRUYỀN CỦA CÁC CHỦNG VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN TẠI VIỆT

NAM

CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS LÊ VĂN PHAN

HÀ NỘI, NĂM 2015

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng đượccông bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2015

Tác giả luận văn

Đỗ Hải Quỳnh

Đặc biệt tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới người thầy kính mến TS.Lê Văn Phan,

Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình chỉ bảo, luôn giúp đỡ hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện khóa luận

Tôi xin được gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo cùng toàn thể các anh chị, các bạn trong Công ty cổ phần phát triển công nghệ nông thôn (RTD), đặc biệt là các anh chị tại phòng R&D Lab nơi tôi công tác đã tận tình hướng dẫn chỉ bảo, chia sẻ và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, các bạn trong tập thể lớp CH22 CNSHC, những người luôn động viên, giúp đỡ tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập, nghiên cứu để hoàn thành tốt luận văn này

Hà Nội, ngày tháng năm 2015

Học viên

Đỗ Hải Quỳnh

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh sách các chữ viết tắt vi

Danh mục bảng vii

Danh mục hình viii

Tóm tắt ix

Abstract .x

Phần 1 Mở đầu 1

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.3 Phạm vi nghiên cứu 2

1.4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 2

Phần 2 Tổng quan tài liệu 4

2.1 Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn 4

2.1.1 Lịch sử và địa dư bệnh 4

2.1.2 Triệu chứng – bệnh tích 6

2.1.3 Con đường truyền lây 8

2.1.4 Tác hại 8

2.1.5 Phòng chống – điều trị 8

2.2 Virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn 9

2.2.1 Đặc điểm của virus 9

2.2.2 Hình thái và cấu trúc hạt virut 9

2.2.3 Tổ chức bộ gene 12

2.3 Sự biến đổi các đặc điểm di truyền của virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn 13

2.4 Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới 15

2.4.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 15

2.4.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 15

Phần 3 Vật liệu và phương pháp 17

3.1 Địa điểm nghiên cứu 17

3.2 Thời gian nghiên cứu 17

3.3 Đối tượng – vật liệu nghiên cứu 17

3.3.1 Đối tượng nghiên cứu 17

3.3.2 Vật liệu 18

3.4 Nội dung nghiên cứu 20

3.5 Phương pháp nghiên cứu 20

3.5.1 Phương pháp nuôi cấy virus trên dòng tế bào Marc-145 20

3.5.2 Phương pháp chuẩn độ virus 20

3.5.3 Phương pháp tách chiết RNA của virus PRRS 22

3.5.4 Phương pháp tổng hợp cDNA 22

3.5.5 Phương pháp PCR và giải trình tự gen (sequencing) 22

3.5.6 Phương pháp xác định trình tự amino acid suy biến 22

3.5.7 Phương pháp căn trình tự 23

3.5.8 Phương pháp xây dựng cây phả hệ nhằm định genotype các chủng ở Việt Nam 23

3.5.9 Phương pháp phân tích vị trí N-glycosyl hóa 23

3.5.10 Phương pháp đánh giá sự thay đổi đặc điểm di truyền của các chủng virus PRRS tại Việt Nam 23

3.5.11 Phương pháp đánh giá vị trí chịu áp lực chọn lọc 24

Phẩn 4 Kết quả và thảo luận 25

4.1 Kết quả 25

4.1.1 Kết quả phân lập các chủng virus PRRS từ thực địa 25

4.1.2 Kết quả chuẩn độ các chủng virus PRRS phân lập được 27

4.1.3 Kết quả khuếch đại và giải trình tự gene ORF5 của các chủng virus thu thập được 28

4.1.4 Kết quả phân tích trình tự vùng gene ORF5 của các chủng virus PRRS lưu hành tại Việt Nam 29

4.1.5 Kết quả phân tích về cây phả hệ (phylogenetic tree) 32

4.1.6 Kết quả nghiên cứu sự biến đổi về đặc điểm di truyền của các chủng PRRSV lưu hành tại Việt Nam 33

4.1.7 Kết quả phân tích vị trí N-glycosyl hóa trên trình tự protein GP5 36 4.1.8 Nghiên cứu vị trí chịu áp lực chọn lọc đa dạng của các chủng PRRSV tại

Việt Nam 38

4.2 Thảo luận 40

4.2.1 Vấn đề phân lập virus PRRS trên dòng tế bào Marc-145 40

4.2.2 Mức độ đa dạng di truyển của các chủng PRRSV ở Việt Nam dựa trên trình tự gene ORF5 41

4.2.3 Phân tích mối quan hệ di truyền của các chủng PRRSV tại Việt Nam 41

4.2.4 Sự thay đổi các đặc điểm di truyền của các chủng PRRSV tại Việt Nam 43

Phần 5 Kết luận và kiến nghị 47

5.1 Kết luận 47

5.2 Kiến nghị 47

Danh mục các công trình đã công bố 48

Danh mục tài liệu tham khảo 49

Phụ lục 59

PAM Tế bào đại thực bào phế nang lợn

PBS Phosphate Buffered Saline

PCV2 Virus gây hội chứng còi cọc sau cai sữa type 2

PEARS Hội chứng hô hấp và sảy thai ở lợn

PRRS Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn

PRRSV Virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn

RNA Ribonucleic acid

RT-PCR Reverse transcriptase Polymerase chain reaction

TCID 50 Liều lây nhiễm 50% tế bào

Type Dòng

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Tình hình nhiễm bệnh tai xanh trong cả nước giai đoạn 2007 – 2013 5

Bảng 3.1 Thông tin các chủng virus PRRS được sử dụng trong đề tài 17

Bảng 3.2 Trình tự cặp mồi dùng sử dụng trong đề tài 19

Bảng 4.1 Kết quả biểu hiện bệnh tích tế bào sau 5 đời cấy truyền của các chủng virus 27

Bảng 4.2 Mức độ tương đồng về trình tự nucleotide của các chủng virus PRRS qua từng năm 30

Bảng 4.3 Mức độ tương đồng về trình tự amino acid của các chủng virus PRRS qua từng năm 31

Bảng 4.4 Kết quả dự đoán vị trí N-glycosyl hóa trên trình tự protein GP5 ở các chủng PRRSV lưu hành ở Việt Nam trong giai đoạn 2007 - 2014 36

Bảng 4.5 Kết quả dự đoán vị trí N-glycosyl hóa trên trình tự protein GP5 ở các chủng PRRSV nhóm 1 lưu hành ở Việt Nam trong giai đoạn 2007 - 2014 37

Bảng 4.6 Kết quả dự đoán vị trí N-glycosyl hóa trên trình tự protein GP5 ở các chủng PRRSV nhóm 2 lưu hành ở Việt Nam trong giai đoạn 2010 - 2013 37

Bảng 4.7 Vị trí được dự đoán chịu áp lực chọn lọc đa dạng dựa trên trình tự gene ORF5 38

Bảng 4.8 Vị trí được dự đoán chịu áp lực chọn lọc thuần dựa trên trình tự gene ORF5 39

Bảng 4.10 Vị trí được dự đoán chịu áp lực chọn lọc thuần dựa trên trình tự gene ORF5 của từng nhóm 45

Bảng 4.11 Vị trí được dự đoán chịu áp lực chọn lọc đa dạng dựa trên trình tự gene ORF5 của từng nhóm 45

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Triệu chứng hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn 6

Hình 2.2 Triệu chứng hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn 7

Hình 2.3 Cấu trúc hạt virion của PRRSV 10

Hình 2.4 Tương tác giữa protein cấu trúc của virus với thụ thể trên tế bào kí chủ 11

Hình 2.5 Sơ đồ tổ chức genome và các quá trình dịch mã của PRRSV 13

Hình 4.1 Hình ảnh bệnh tích tế bào của một số chủng phân lập được 25

Hình 4.2 Kết quả điện di kiểm tra sự có mặt của virus PRRS trên tế bào Marc-145 26

Hình 4.3 Kết quả chuẩn độ các chủng virus PRRS sau 5 đời cấy truyền trên môi trường tế bào Marc-145 28

Hình 4.4 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm khuếch đại vùng gene ORF5 29

Hình 4.5 Cây phả hệ thể hiện mối quan hệ di truyền của các chủng PRRSV của Việt Nam và các chủng tham chiếu trên thế giới 32

Hình 4.6 Mối quan hệ di truyền giữa các chủng HP-PRRSV lưu hành ở Việt Nam 33

Hình 4.7 Mối quan hệ di truyền giữa các chủng PRRSV ở Việt Nam 35

TÓM TẮT

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (Porcine reproductive and respiratory syndrome) là một trong những bệnh truyền nhiễm nguy hiểm gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi lợn ở Việt Nam Việc đánh giá đặc điểm và sự biến đổi về di truyền của các chủng virusPRRS đóng vai trò quan trọng trong việc xây dựng chiến lược phòng chống bệnh Trong nghiên cứu này, 22 chủng virus PRRSđã được phân lập từ các mẫu bệnh phẩm thu thập tại Việt Nam trong giai đoạn 2011 – 2014 và được tiến hành giải trình tự và phân tích so sánh vùng gene ORF5 với các chủng virus PRRS tham chiếu khác của Việt Nam thu thập được trên ngân hàng GenBank Kết quả phân tích trình tự gen ORF5 cho thấy mức độ tương đồng về trình tự nucleotide giữa các chủng virus PRRS lưu hành ở Việt Nam dao động từ 94,6 – 100%, đồng thời sự dao động về mức độ tương đồng về trình tự nucleotide của các chủng giữa các năm có sự khác biệt Phân tích về mối quan hệ di truyền cho thấy, hầu hết các chủng virus PRRS

đã và đang lưu hành ở Việt Nam đều thuộc dòng (type) Bắc Mỹ, nhánh (sub-lineage) 8.7, có mối quan hệ di truyền gần gũi với các chủng virus PRRS độc lực cao có nguồn gốc từ Trung Quốc.Kết quả phân tích về trình tự amino acid của gen ORF5 cho thấy mức độ tương đồng giữa các chủng virus PRRS đã và đang lưu hành ở Việt Nam dao động từ92 – 100% Vị trí N-glycosyl hóa được dự đoán ở các vị trí N30, N32, N33, N34, N35, N44 và N51, trong đó vị trí N32, N33 và N34 có sự biến đổi đa dạng Ngoài

ra, sự biến động về vị trí N-glycosyl hóa ở các nhóm khác nhau là khác nhau Protein cấu trúc GP5 (Glycoprotein 5) của các chủng virus PRRS xuất hiện ở Việt Nam ghi nhận 8 vị trí chịu áp lực chọn lọc đa dạng và 21 vị trí chịu áp lực chọn lọc thuần Ngoài

ra vị trí chịu áp lực chọn lọc giữa các nhóm cũng có sự sai khác.Kết quả nghiên cứu này

đã góp phần đánh giá sự đa dạng di truyền của các chủng virus PRRS ở Việt Nam và đóng góp thông tin cho việc lựa chọn vaccine phòng chống bệnh PRRS phụ hợp ở Việt Nam

ABSTRACT

Porcine respiratory and reproductive syndrome (PRRS) is one of the most economically important pathogen in Vietnamese swine industry Analysing the genetic characterization plays an important role in pathogen transmission In this study, ORF5

of 22 field PRRSV strains isolated in Vietnam in 2011 – 2013 were sequenced, analyzed and compared to other Vietnamese field strains in 2007 – 2014 period collected from GenBank The result of ORF5 sequences analyzing showed that, Vietnamese PRRSV strains collected in this period shared 94.6 – 100% nucleotide identity and there was a different of nucleotide identity among PRRSV strains in each year Phylogenetic analysis showed that, almost PRRSV strains in Vietnam were North America genotype and classified into sub-lineage 8.7, which related to high pathogenic PRRSV strains from China.The result of glycoprotein 5analyzing showed that amino acid identity among Vietnamese PRRSV strainswas oscillated in 92 – 100%.N- glycosylation sites were predicted at N30, N32, N33, N34, N35, N44 and N51 and N32, N33 and N34 N-glycosylation sites in there were different among strains In addition, changes in N-glycosylation sites in different groups were different Structure glycoprotein 5 sequences in Vietnamese PRRSV strains had 8 diversity selection sites and 21 purified selection sites Futher more, there was a different in selection sites between different groups This study provided new information about genetic variant of PRRSV circulated in Vietnam and may assist effective choice of vaccine in Vietnam

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Ngành chăn nuôi, đặc biệt là ngành chăn nuôi lợn đã và đang đóng góp ngày càng lớn đối với sự phát triển kinh tế nói chung Tuy nhiên, việc chăn nuôi lợn ở nước ta gặp nhiều khó khăn do các loại dịch bệnh liên tiếp nổ ra như bệnh lở mồm long móng, bệnh dịch tả lợn, hội chứng còi cọc ở lợn con sau cai sữa (PCV2) , gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng đối với người nông dân Trong số các loại dịch bệnh trên lợn thì hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấpở lợn (PRRS), còn được gọi là bệnh “tai xanh”,đã và đang gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng đối với ngành chăn nuôi lợncông nghiệp Bệnh PRRS đã được xếp vào bảng B danh mục các bệnh thú y nguy hiểm của Tổ chức Thú y thế giới Theo số liệu chính thức của Cục Thú y – Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn,trong giai đoạn từ 2007 – 2013số lợn mắc hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn lên tới gần 1,7 triệu con, trong đó số lợn chết hoặc bị tiêu hủy là trên 800 nghìn con

Tác nhân gây bệnh “tai xanh” do Porcine reproductive and respiratory

syndrome virus (PRRSV), một virus thuộc chi Artervirus - họ Arterviridae - bộ Nidovirales(Conzelmann et al., 1993), gây ra PRRSV có bộ gene khoảng 15

kilobase, bao gồm 10 khung đọc mở (ORF): ORF1a, ORF1b mã hóa cho các protein phi cấu trúc, ORF2a, ORF2b, ORF3, ORF4, ORF5a, ORF5, ORF6 và ORF7 mã hóa cho các protein cấu trúc (Meulenberg, 2000; Yun and Lee, 2013;

Johnson et al., 2011) Kết quả phân tích trình tự genome cho thấy, PRRSV được

phân thành genotype I với đại diện là chủng Lelystad và genotype II có nguyên mẫu là chủng VR2332.Kể từ năm 2006, một biến chủng thuộc genotype II có độc lực cao đã xuất hiện ở Trung Quốc và lan rộng ra nhiều nước thuộc Đông Nam Á(Nguyễn Bá Hiên và cs., 2013).Trong các gene cấu trúc, ORF5 mã hóa cho glycoprotein chính trên bề mặt của virus, đóng vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhập của virus vào tế bào của vật chủ, đồng thời chứa nhiều epitope kích

thích hệ thống miễn dịch của cơ thể sản sinh kháng thể trung hòa virus(Dea et al.,

2000; Meulenberg, 2000) Chính vì thế, trình tự ORF5 được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu về đa dạng di truyền cũng như tiến hóa của PRRSV

Gần đây, đã có nhiều nghiên cứu tập trung đánh giá các đặc điểm di truyền

và tiến hóa của các chủng PRRSVdựa trên trình tự gene ORF5 tại mỗi quốc gia

cũng như trên toàn thế giới (Nguyen et al., 2014; Shi et al., 2010) Ở Việt Nam,

kể từ khi dịch “tai xanh” bùng pháttrong năm 2007, trình tự gene ORF5 của các chủng PRRSV đang lưu hành đã được công bố trên ngân hàng GenBank Đã có một số nghiên cứu cho thấy sự phức tạp và đa dạng di truyền của các chủng PRRSV tại Việt Nam, với sự xuất hiện của nhiều type cũng như nhóm có độc lực khác nhau của virus PRRS(Đỗ Hữu Dũng và Nguyễn Viết Không, 2014;

Nguyễn Ngọc Hải và Võ Khánh Hưng, 2012; Nguyen et al., 2013; Tung et al.,

2011).Tuy nhiên, sự biến đổi về các đặc tính di truyền của các chủng PRRSV ở Việt Nam theo thời gian vẫn chưa được làm sáng tỏ, đặc biệt là mối quan hệ di truyền giữa các chủng PRRSV ở Việt Nam và trên thế giới.Bên cạnh đó, các nghiên cứu cũng chưa đi sâu phân tíchsự thay đổi về vị trí glycosyl hóa cũng như các vị trí chịu áp lực chọn lọc trên trình tự gene ORF5 của các chủng đang lưu hành hiện nay

Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài nghiên cứu:

“Đặc điểm và sự biến đổi di truyền của các chủng virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn tại Việt Nam”

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

- Phân lập được các chủng virus PRRS từ các mẫu bệnh phẩm của lợn nghi mắc bệnh PRRS thu thập được ở Việt Nam trong giai đoạn từ 2011- 2014

- Giải mã,phân tích gen ORF5, và xác định được nguồn gốc tiến hóa, sự biến đổi di truyền của các chủng virus PRRS phân lập được

- Trong nghiên cứu này, sự thay đổi về vị trí glycosyl hóa, cũng như các vị trí chịu áp lực chọn lọc trên trình tự protein GP5 cũng được đánh giá

1.3 PHẠM VI NGHIÊN CỨU

Các chủng virus PRRS phân lập được tại một số tỉnh miền Bắc của Việt Nam trong giai đoạn 2011 - 2014 và các trình tự gene ORF5 tham chiếu khác của virus PRRS thu thập được trên ngân hàng GenBank

1.4.Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ Ý NGHĨA THỰC TIỄN

1.4.1 Ý nghĩa khoa học

Đề tài được thực hiện sẽ góp phần làm sáng tỏ mối quan hệ di truyền và đặc điểm tiến hóa của các chủng virus PRRS đã và đang lưu hành tại Việt Nam trong những năm vừa qua Đồng thời, vị trí chịu áp lực chọn lọc và sự thay đổi các vị trí glycosyl hóa của các chủng lưu hành tại Việt Nam sẽ đóng góp thông tin quan

trọng trong nghiên cứu sự biến đổi theo thời gian của virus PRRS nói riêng và các loại virus nói chung

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn

Thông tin về di truyền của các chủng virus PRRS đã và đang lưu hành tại Việt Nam sẽ cung cấp những thông tin quan trọng góp phần lựa chọn được chủng virus vaccine thích hợp để sản xuất vaccine hiệu quả phòng chống dịch PRRS Các chủng virus PRRS phân lập được sẽ là nguồn vi sinh vật quan trọng phục vụ các nghiên cứu sản xuất vaccine, kít chẩn đoán

PHẦN 2.TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN

2.1.1.Lịch sử và địa dư bệnh

2.1.1.1.Lịch sử hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn trên thế giới

Vào những năm cuối thập kỉ 80 của thế kỉ 20, ở Mỹ xuất hiệndịch bệnh gây hội chứng suy giảm khả năng sinh sản và gây bệnh đường hô hấp ở các đàn lợn

mà không xác định được nguyên nhân Hội chứng tương tự cũng được ghi nhận xảy ra ở một số nước châu Âu như: Đức, Hà Lan, Anh, Bỉ, Tây Ban

Nha (Collins et al., 1992; Wensvoort et al., 1991) Ở châu Á, dịch bệnh được

ghi nhận lần đầu ở Nhật Bản năm 1988 và Đài Loan năm 1991 (Zimmerman, 2003) và sau đó lan rộng ra nhiều nước khác

Các tác nhân gây bệnh nghi ngờ ban đầubao gồm: Chlamydia, virus cúm

lợn, parovirus v.v., tuy nhiên, các tác nhân này đã không được xác nhận bằng kết quả lây bệnh thực nghiệm(Wensvoort, 1993) Do đó, bệnh ban đầu có nhiều tên gọi khác nhau: hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (Porcine reproductive and respiratory syndrome - PRRS), hội chứng hô hấp và sảy thai ở lợn (porcine endemic abortion and respiratory syndrome – PEARS), bệnh bí hiểm ở lợn (Mystery swine disease) Đến năm 1992, tác nhân gây bệnh là một loại virus

mới đã được phân lập và xác định độc lập ở Mỹ và châu Âu(Collins et al., 1992; Wensvoort et al., 1991).Cũng trong năm này, tổ chức thú y thế giới (OIE) đã

thống nhất tên gọi của bệnh là “Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn” Theo Zimmerman (2003) và các tài liệu liên quan, kết quả nghiên cứu hồi cứu cho thấy, các đàn lợn dương tính huyết thanh học đối với virus PRRS đã xuất hiện muộn nhất kể từ năm 1979 tại Canada Cũng theo nghiên cứu này, 1 trên tổng số 26 mẫu huyết thanh lợn dương tính huyết thanh học với virus PRRS ở bang Iowa Mỹ vào năm 1985 (chiếm 3,8%), và con số này đã tăng nhanh chóng vào các năm sau đó Kết quả tương tự cũng được quan sát thấy ở các nước châu Âu, khi số lượng các đàn lợn dương tính huyết thanh học đối với virus PRRS tăng mạnh trong khoảng năm 1988 và 1989, trước khi các đợt dịch đầu tiên bùng nổ

Từ năm 2005 trở lại đây, 25 nước và vùng lãnh thổ trên hầu hết các châu lục đều đã báo cáo về sự lưu hành của virus PRRS Đặc biệt, kể từ năm 2006,

một biến chủng mới của virus PRRS xuất hiện ở Trung Quốc và nhanh chóng lan

rộng ra nhiều nước ở Đông Nam Á như Việt Nam (Feng et al., 2008), Thái Lan (Nilubol et al., 2013), Ấn Độ, Campuchia, Lào, v.v (Thông cáo của OIE, 2015)

2.1.1.2 Lịch sử hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn tại Việt Nam

Bằng chứng huyết thanh học cho thấy sự phơi nhiễm đối với virus PRRS ở Việt Nam đã xuất hiện muộn nhất kể từ năm 1997, khi kết quả kiểm tra huyết thanh học cho thấy 10/51 lợn giống nhập khẩu từ Mỹ đã cho kết quả dương tính với PRRS.Theo báo cáo của cục thú y (2007), đã có một tỉ lệ lợn giống nhất định có huyết thanh dương tính với bệnh “tai xanh” Tuy nhiên, bệnh chỉ bắt đầu gây thiệt hại nghiêm trọng đối với ngành chăn nuôi lợn ở Việt Nam kể từ tháng 3/2007, khi xuất hiện các ổ dịch tại miền Bắc, và sau đó nhanh chóng lan rộng ra cả nước Trong giai đoạn từ 2007 – nửa đầu năm 2013, tại Việt Nam đã có 3 đợt dịch lớn xảy ra vào các năm 2008, 2010 và 2012 (Bảng 2.1), chủ yếu xảy ra trong giai đoạn khoảng từ tháng 3 đến tháng 9, đặc biệt trong giai đoạn từ tháng 3 đến

tháng 5 và tháng 7 đến tháng 9 (Đỗ Hữu Dũngvà cs., 2013; Văn Đăng Kỳ, 2012)

Bảng 2.1 Tình hình nhiễm bệnh tai xanh trong cả nước

Nguồn: Thống kê của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn

Theo số liệu chính thức của cục thú y, trong giai đoạn từ nửa cuối năm 2013 đến tháng 9/2015, dịch “tai xanh” không xuất hiện trên cả nước Tuy nhiên, mới đây, kể từ đầu tháng 10/2015, dịch “tai xanh” đã được công bố tại 4 tỉnh: Tiền Giang, Hà Tĩnh, Sóc Trăng, Nghệ An Bên cạnh đó, chúng tôi cũng đã phát hiện một số đàn lợn dương tính với virus “tai xanh” tại một số huyện thuộc địa bàn tỉnh Hưng Yên

2.1.2 Triệu chứng – bệnh tích

2.1.2.1 Triệu chứng

Triệu chứng lâm sàng của PRRS rất đa dạng, phụ thuộc vào chủng virus gây bệnh, giai đoạn phát triển của lợn cũng như sức đề kháng của cơ thể cũng như việc nhiễm ghép với các bệnh khác (Nguyễn Bá Hiên và cs., 2013; Tô Long Thành, 2007) Lợn mắc PRRS ở mọi lứa tuổi thường có các triệu chứng như: sốt,

ủ rũ, chán ăn, ho, khó thở, xanh da Ngoài ra, tùy thuộc vào từng lứa tuổi mà bệnh có các triệu chứng đặc trưng khác nhau

Triệu chứng điển hình nhất của PRRS có thể quan sát thấy ở các đàn lợn nái

và lợn con theo mẹ Theo Tô Long Thành (2007), triệu chứng thường gặp ở lợn nái bao gồm: sảy thai 1 – 3% số nái từ ngày chửa thứ 21 – 109, đẻ non (chiếm 1 – 20%), đẻ ra thai đã chết, thai gỗ, tỷ lệ đẻ giảm, rối loạn động dục, mất sữa, v.v Đối với lợn con theo mẹ, tỷ lệ chết cao, từ 10 – 40%, đa số lợn con chết trong tuần đầu sau khi sinh, số còn lại mắc các triệu chứng như khó thở, tiêu chảy, gầy còm, sưng

mí mắt và kết mạc

Hình 2.1 Triệu chứng hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn

A:Lợn bị sảy thai, đẻ non, B:Biến màu ở tai, C:Lợn sơ sinh chết hoặc yếu, D, E, F, G: lợn sau cai sữa chết, loại

(Nguồn: http://www.vietlinh.vn/chan-nuoi/heo-benh-tai-xanh-prrs2.asp)

Đối với lợn sau cai sữa và lợn trưởng thành, có thể quan sát thấy hiện tượng sốt, khó thở, viêm phổi, kém ăn Lợn đực giống có thể bị hôn mê, giảm hoặc mất tính dục, lượng tinh dịch ít, chất lượng tinh thấp Đặc biệt, bệnh thường nghiễm kèm với một số bệnh khác như bại huyết, dịch tả, suyễn lợn, viêm màng não, v.v làm tăng mức độ trầm trọng của bệnh (Nguyễn Bá Hiên và cs., 2013)

2.1.2.2 Bệnh tích

a, Bệnh tích đại thể

TheoNguyễn Bá Hiên và cs (2013),biểu hiện thường gặp khi mổ khám lợn nhiễm PRRSV là hiện tượng viêm kẽ phổi, các hạch lympho sưng to, cứng, có màu nâu vàng nhạt sau chuyển màu trắng hoặc nâu sáng Phổi bị hoại tử và thâm nhiễm tạo thành các đám chắc, đặc, các thùy bị bệnh có màu xám đỏ, có mủ Phế nang chứa dịch viêm, nhăn Lợn đực có hiện tượng teo ống sinh tinh Ngoài ra còn có hiện tượng gan, lách sưng, tụ huyết, thận xuất huyết…

Hình 2.2 Triệu chứng hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn

A: Thận xuất huyết, B: Phổi xuất huyết, Mũi tên chỉ vị trí xuất huyết

Nguồn (Feng và cộng sự, 2008)

b, Bệnh tích vi thể

Kết quảquan sát bệnh tích vi thể ở lợn bị nhiễm hội chứng rối loạn sinh sản

và hô hấp của Tiêu Quang An và Nguyễn Hữu Nam (2011)cho thấy, tỉ lệ xuất huyết, sung huyết rất cao ở các mẫu phổi, hạch phổi, hạch amindan, hạch ruột, lách và thận Đồng thời, nghiên cứu này cũng ghi nhận hiện tượng thâm nhiễm, thoái hóa và tăng sinh tế bào, tăng sinh nang lympho xuất hiện phổ biến ở phổi, lách và các hạch trong cơ thể Lager andHalbur (1996) đã ghi nhận hiện tượng chết hoạt ở các mô mạch bao quanh thành ruột ở tất cả các lợn bị nhiễm PRRSV

Ngoài ra, PRRS còn có các bệnh tích vi thể khác như hiện tượng viêm phổi kẽ: các khoang phổi chứa đầy các mảnh tế bào bị phá hủy; viêm mũi: lớp biểu mô lông biến mất, các tế bào biểu mô phình to và bong khỏi lớp thượng bì (Christianson and Joo, 1994)

2.1.3 Con đường truyền lây

Virus PRRS có thể lây trực tiếp từ lợn bệnh sang lợn lành thông qua các dịch cơ thể, phân, tinh dịch v.v Bên cạnh đó, virus có thể xâm nhiễm vào bào thai thông qua nhau thai (Nguyễn Bá Hiên và cs., 2013) Việc virus có thể tồn tại lâu trong lợn ở nồng độ thấp đóng vai trò quan trọng trong quá trình lây truyền bệnh(Yun and Lee, 2013) Ngoài ra, Virus PRRS có thể phát tán thông qua đường không khí, các dụng cụ chăn nuôi, côn trùng và một số loài động vật khác

2010 cho thấy, việc nhiễm ghép PRRS và Leptospira làm tăng đáng kể tỉ lệ sảy

thai ở các đàn lợn nái, có thể lên tới 100% ở các ổ dịch, đồng thời làm giảm đáng

kể số lượng lợn con trong mỗi ổ(Cao Văn Thậtvà cs., 2012)

Bên cạnh đó, PRRS tạo áp lực lên công tác phòng chống bệnh và dập dịch Thiệt hại do PRRS hàng năm ở Mỹ trong giai đoạn 2005 – 2011 lên tới 664 triệu USD, tăng 104 triệu USD so với giai đoạn trước 2005, chủ yếu do giảm số lượng lợn

và tổng sản lượng thịt lợn Hơn nữa, các chi phí khác liên quan đến phòng chống

PRRS ước tính lên tới 477,79 triệu USD mỗi năm (Holtkamp et al., 2012) Ảnh

hưởng của các đợt dịch “tai xanh” diễn ra trong năm 2008 và 2009 ở Việt Nam cũng

đã làm giảm giá thịt lợn trên thị trường lên tới 30% (Zhang and Kono, 2012)

2.1.5 Phòng chống – điều trị

2.1.5.1 Phòng chống

Biện pháp hiệu quả nhất để phòng chống PRRS là tiêm phòng đầy đủvaccine phòng bệnh cho lợn Ngoài ra, chuồng trại cần được vệ sinh, sát trùng

thường xuyên Đồng thời, công tác quản lý trang trại cần phải được thực hiện nghiêm túc: quản lý chất lượng con giống sạch bệnh, tránh nhập lợn mới vào trại khi đang sảy ra dịch

2.1.5.2 Điều trị

Hiện nay, do không có thuốc điều trị đặc hiệu, việc điều trị lợn bị nhiễm PRRS chủ yếu được thực hiện theo hướng nâng cao sức đề kháng của vật nuôi, điều trị triệu chứng và hạn chế các bệnh kế phát Các biện pháp thông thường bao gồm:

- Loại bỏ các con lợn bị bệnh năng

- Không nhập lợn khỏe vào khu vực lợn bệnh, giãn mật độ nuôi tối đa

- Điều trị kháng sinh phổ rộng để hạn chế nhiễm trùng kế phát

- Hạ sốt đối với lợn bị sốt cao

2.2.VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN 2.2.1 Đặc điểm của virus

Tác nhân gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn là Porcine Reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), một virus thuộc chi

các đại thực bào, đặc biệt là đại thực bào phế nang, do đó, khi virus tấn công vào kí chủ, chúng làm suy giảm khả năng miễn dịch lợn, khiến cho chúng dễ dàng bị nhiễm khuẩn kế phát Bên cạnh đó, PRRSV có thể được phân lập và nuôi cấy trên các dòng tế bào CL2621 hoặc tế bào Marc-145, có nguồn gốc từ

tế bào thận khỉ xanh châu phi (MA-104) (Collins et al., 1992; Kim et al., 1993;

Meulenberg, 2000)

Đến nay, lợn được coi là kí chủ mẫn cảm duy nhất đối với PRRSV Lợn mắc bệnh có thể đào thải virus qua phân và nước tiểu trong 28 ngày, qua nước bọt trong 42 ngày và trong tinh dịch lên tới 92 ngày sau lây nhiễm Ngoài ra, virus có thể tồn tại trong máu, hạch và mô cơ của lợn trong khoảng thời gian lần lượt là 210 ngày, 157 ngày và từ 1 đến 2 tuần(Lazić and Petrović, 2007)

Tương tự với nhiều loại virus khác, PRRSV khá mẫn cảm với điều kiện nhiệt độ cao Virus bị bất hoạt khi lý ở 56oC trong vòng 10 phút Tuy nhiên, virus có thể được bảo quản trong điều kiện lạnh sâu trong thời gian dài (Lazić and Petrović, 2007)

2.2.2 Hình thái và cấu trúc hạt virut

Tương tự như các virus khác thuộc chi này, PRRSV có cấu trúc khối cầu đa

diện, kích thước khoảng 45 – 55 nm, tỉ trọng khoảng 1,14 g/cm3(Snijder and Meulenberg, 1998) Virus bao gồm một lõi capsid có kích thước khoảng 20 – 30

nm gồm nhiều tiểu phần giống nhau, bao quanh bởi màng lipidkhá nhẵn (Hinh 2.3.) Kết quả quan sát bằng kính hiển vi điện tử cho thấy, trên bề mặt virus có các mấu lồi có kích thước khoảng 2 nm, hoặc một số gai có đường kính 10 – 15

nm do các protein vỏ của virus tạo thành (Dokland, 2010)

Hình 2.3 Cấu trúc hạt virion của PRRSV

RNA: vật chất di truyền của PRRSV, GP2: glycoprotein 2, GP3: glycoprotein 3, GP4: glycoprotein 4, GP5:

glycoprotein 5, M: matrix protein, E: envelop protein, N: capsid protein.

(Nguồn: http://viralzone.expasy.org/all_by_species/284.html)

Protein capsid: có khối lượng khoảng 14 – 15 kDal, liên kết trực tiếp với vật chất di truyền của virus Đây là một trong 3 protein chiếm tỉ lệ lớn nhất bên cạnh matrix protein và GP5 Capsid protein có chiều dài khoảng 123 – 128 amino acid, có đặc tính kháng nguyên cao, tuy nhiên protein này không có vai trò trong việc tạo miễn dịch bảo hộ trên lợn đối với sự tấn công của PRRSV(Dokland, 2010)

GP2: là một trong những glycoprotein nhỏ nằm trên màng của virus, có khối lượng khoảng 29 – 30 kDal GP2 có chiều dài khoảng 253 – 256 amino acid, bao gồm 2 vị trí glycosyl hóa khá bảo thủ ở mỗi genotype khác nhau: vị trí

173 và 179 ở type I và 171 và 178 ở type II Tuy nhiên, các vị trí glycosyl hóa này không có vai trò trong sự xâm nhiễm của virus vào trong tế bào (Dokland, 2010) Mức độ tương đồng về trình tự amino acid giữa 2 type khoảng 62%

E protein: đây là 1 protein cấu trúc không glycosyl hóa của PRRSV, khối lượng

phân tử khoảng 10 kDal, dài khoảng 73 amino acid(Lee and Yoo, 2006; Wissink et

al., 2005) E protein có vai trò quan trọng trong việc xâm nhiễm của virus vào tế bào chủ, nhưng không ảnh hưởng đến quá trình lắp ráp của hạt virus (Lee and Yoo, 2006) GP3: có chiều dài 254 –265 amino acid, bao gồm 6 vị trí glycosyl hóa: 29

42, 50, 131, 150, 160 ở type II và 27, 42, 50, 130, 151, 159 ở type I Kết quả phân tích khối phổ cho thấy, cả 6 vị trí này đều được glycosyl hóa Mức độ tương đồng về trình tự GP3 của 2 genotype khoảng 58% (Dokland, 2010) Ngoài ra, GP3 có chứa 1 vị trí epitope trung hòa

GP4: có chiều dài khoảng 178 – 183 amino acid bao gồm 4 vị trí glycosyl hóa: 37, 84, 120, 130(Dokland, 2010) Bên cạnh đó, GP4 có chứa 1 vị trí quyết định kháng thể trung hòa nằm ở vị trí từ 39 – 79 Mức độ tương đồng về trình tự amino acid giữa 2 genotype vào khoảng 67%

GP2, GP3, GP4 cùng với protein E cấu tạo nên phức hợp đóng vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm lên tế bào kí chủ thông qua thụ thể CD163(Dokland, 2010) (Hình 2.4.)

ORF5a: đây là protein mới được xác định có mặt ở PRRSV nói riêng và các virus thuộc chi Arterivirus nói chung ORF5a có chiều dài 51 amino acid, khối lượng phân tử khoảng 10 kDal, và có các vị trí được cải biến sau dịch mã

(Johnson et al., 2011) Theo nghiên cứu của Sun et al (2013), ORF5a được cho

là có ảnh hưởng đến sức sống của virus

Hình 2.4 Tương tác giữa protein cấu trúc của virus với thụ thể

GP5: glycoprotein 5 là một protein cấu trúc chính trên vỏ của virus, đóng vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhập của virus vào tế bào của vật chủ, đồng thời chứa nhiều epitope kích thích hệ thống miễn dịch của cơ thể chống lại virus

(Dea et al., 2000; Meulenberg, 2000).GP5 có chiều dài khoảng 200 amino acid

(type II) và 201 amino acid (type I), đây cũng là protein có mức độ biến động lớn nhất, không chỉ giữa 2 type, mà còn trong các subtype Mức độ tương đồng về trình tự giữa type I và type II dao động trong khoảng 51 – 55%(Dokland, 2010) Mức độ đa dạng về trình tự GP5 có thể liên quan đến việc không có bảo hộ chéo giữa 2 type virus Nhiều nghiên cứu cho thấy, vị trí glycosyl hóa ở GP5 đóng vai trò quan trọng trong việc lẩn tránh các đáp ứng miễn dịch dịch thể của kí chủ

(Ansari et al., 2006; Li et al., 2015)

Matrix protein: có chiều dài khoảng 173-174 amino acid, không chứa vị trí glycosyl hóa Đây là protein bảo thủ nhất của PRRSV(Dokland, 2010) Protein M được cho là có vai trò trong quá trình lắp ráp và giải phóng virus ra khỏi tế bào kí chủ (Snijder and Meulenberg, 1998) Bên cạnh đó, protein M còn mang vị trí

nhận biết của kháng thể trung hòa (Trible et al., 2015; Yang et al., 2000)

GP5 và protein Mliên kết với nhau bởi liên kết di-sulfite, cấu tạo nên phần lớn protein trên bề mặt virus Phức hợp protein GP5/M đóng vai trò quan trọng trong trong quá trình nảy tạo hạt virus hoàn chỉnh Bên cạnh đó, phức hợp này cũng đóng vai trò quan trọng trong việc xâm nhập của virus vào trong tế bào,

thông qua tương tác với herapan sulphate và tiếp theo là sialoadhesin (Delputte

2.2.3 Tổ chức bộ gene

Bộ gene của PRRS là RNA sợi đơn dương, có kích thước vào khoảng 15 kilobase pair, với đầu mũ 5’ và đuôi polyA.bao gồm 10 ORF, trong đó ORF1a và ORF1b chiếm đến 75% kích thước bộ gene, tiếp đến là các ORF2a, ORF2b, ORF3, ORF4, ORF5a, ORF5, ORF6 và ORF7(Han and Yoo, 2014)

ORF1a và ORF1b mã hóa cho các polyprotein pp1a và pp1ab, trong đó pp1ab được biểu hiện muộn hơn do cơ chế dịch 1 khung đọc tại vùng chồng lấn giữa ORF1a và ORF1b Quá trình xử lý sau dịch mã của các polyprotein này tạo

ra 14 protein phi cấu trúc (Non-structure protein: Nsp), tham gia vào quá trình nhân lên và lắp ráp của virus Quá trình xử lý sau dịch mã này bao gồm quá trình

tự cắt nhằm giải phóng ra 3 Nsp ở đầu N của polyprotein: Nsp1α, Nsp1β và

Nsp2, có đặc tính tương tự các papain protease Quá trình xử lý sau đó được thực hiện thông qua Nsp4, có hoạt tính serine protease, giải phóng ra 14 Nsp có chức năng, vai trò khác nhau (Han and Yoo, 2014) (Hình 2.5.)

Hình 2.5 Sơ đồ tổ chức genome và các quá trình dịch mã của PRRSV

A: tổ chức bộ gene của virus, B: quá trình dịch mã của virus

Nguồn: (Han and Yoo, 2014)

Bên cạnh đó, trong quá trình xâm nhiễm, virus còn tạo ra 6bộ gene phụ

mã hóa cho các protein ở đầu 3’ của genome Các mRNA này cùng có 1 trình

tự đầu dẫn 5’ giống với trình tự trên genome virus và có vai trò tín hiệu điều hòa dịch mã Thông qua 6 bộ gene phụ này, 8 ORF mã hóa cho các protein cấu trúc của virus được dịch mã, tạo nguyên liệu cho quá trình lắp ráp cấu thành nên hạt virion hoàn chỉnh

2.3 SỰ BIẾN ĐỔI CÁC ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN CỦA VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN

Tuy mới chỉ xuất hiện và gây hại kể từ những năm cuối thập kỉ 80 của thế

kỉ XX, các nghiên cứu về di truyền và tiến hóa bằng các công cụ tin sinh học đã cho thấy PRRSV đã xuất hiện từ trước đó khá lâu Phần lớn các nghiên cứu về sự tiến hóa của PRRSV đều tập trung trên trình tự gene ORF5.Nghiên cứu tiến hóa của các chủng PRRSV type 1 dựa trên trình tự ORF5 trên toàn thế giới cho thấy,

chúng có cùng 1 tổ tiên chung xuất hiện ở châu Âu cách đây khoảng trên 100

năm (Nguyen et al., 2014) Tương tự như vậy, PRRSV type 2 có thể đã xuất hiện trong khoảng cuối những năm 1970 (Shi et al., 2010) Hơn nữa, các mẫu dương

tính huyết thanh học với PRRSV đã được phát hiện trong năm 1979 tại Canada

đã củng cố cho giả thuyết này (Zimmerman, 2003).Tuy nhiên, khi mở rộng phạm

vi nghiên cứu trên các trình tự gene khác của PRRSV, sự xuất hiện của tổ tiên chung của cả 2 type cũng như sự phân nhánh của chúng đã có sự khác biệt Kết quả nghiên cứu dựa trên trình tự gene ORF5 – ORF7 cho thấy, tổ tiên chung của PRRSV type 1 và type 2 đã xuất hiện cách đây gần 500 năm, và sự phân nhóm các genotype đối với PRRSV type 1 và type 2 lần lượt diễn ra tương ứng cách

đây khoảng 63 và 59 năm(Yoon et al., 2012) Tuy nhiên, khi nghiên cứu trên

toàn bộ các gene mã hóa của PRRSV, cả 2 type đã có chung 1 tổ tiên cách đây gần 800 năm và quá trình phân nhóm đối với mỗi type là 179 năm (type 2) và

115 năm (type 1) (Yoon et al., 2013) Sự khác biệt này có thể đến từ số lượng

trình tự được sử dụng trong mỗi nghiên cứu là khác nhau, cũng như tốc độ tiến hóa trên từng gene có sự khác biệt

Đi sâu vào phân loại các genotype của từng type, hiện nay, các nghiên cứu

phần nhiều đều tập trung dựa vào gene ORF5(Kim et al., 2009; Nilubol et al., 2013) Shi et al (2010) đã chia các chủng PRRSV type 2 thành 9 genotype, mỗi

genotype lại có nhiều lineage khác nhau Phân tích cây phả hệ dựa trên thuật toán Bayesian cho thấy các chủng PRRSV type 1 có thể được chia làm 4 subtype:

Russian subtype 1, EU type 1, EU type 2, EU type 3 (Nguyen et al., 2014; Shi et

al., 2010), trong đó EU type 1 đã và đang lây lan ra nhiều nước ở các khu vực khác nhau

Bên cạnh các nghiên cứu về sự tiến hóa của PRRSV, nhiều nghiên cứu hiện nay tập trung nhiều hơn đến sự thay đổi về trình tự amino acid của virus, đặc biệt

là các protein cấu trúc đóng vai trò quan trọng trong đáp ứng miễn dịch của kí chủ GP5 là một trong các protein có sự biến đổi mạnh nhất trong các protein cấu trúc của PRRSV Bên cạnh đó, GP5 đóng vai trò quan trọng trong sự cấu thành hạt virus hoàn chỉnh, tham gia vào quá trình xâm nhiễm của virus vào tế bào

cũng như chứa các epitope hình thành nên phản ứng miễn dịch của cơ thể(Dea et

al , 2000; Faaberg et al., 2006; Gonin et al., 1999; Meulenberg, 2000; Plagemann, 2004; Yang et al., 2000) Đặc biệt, quá trình glycosyl hóa tại một số

amino acid trên trình tự GP5 đóng vai trò quan trọng trong quá trình lẩn tránh

đáp ứng miễn dịch của kí chủ(Li et al., 2015).Các đột biến làm thay đổi vị trí

glycosyl hóa tại vị trí N33 – N35 làm thay đổi hiệu giá trung hòa của kháng thể kháng virus PRRSV chủng FL-12 theo hướng tăng dần từ vị trí N33 – N35 (Misra, 2012) Hơn nữa, trình tự GP5 có chứa nhiều vị trí chịu tác động chọc lọc Nhiều nghiên cứu phân tích vị trí chịu áp lực chọn lọc đa dạng trên trình tự GP5

của chủng HP-PRRSV đã chỉ ra các vị trí 9, 13, 32-35, 58, 59, 94, 102(Mu et al., 2013; Song et al., 2010; Xu et al., 2010)

2.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC VÀ TRÊN THẾ GIỚI 2.4.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Ở nước ta, đã có một số nghiên cứu về mức độ đa dạng về trình tự gene ORF5 của PRRSV Kết quả cho thấy, các chủng ở Việt Nam đều có mối quan hệ

gần gũi với chủng độc lực cao xảy ra ở Trung Quốc kể từ năm 2006 (Nguyen et

al , 2013; Tung et al., 2011)

Trần Thị Thanh Hàvà cs (2012) và cộng sự đã xây dựng quy trình đánh giá hiệu giá kháng thể trung hòa đối với PRRSV Đồng thời, nhóm tác giả cũng cho rằng phương pháp này hiệu quả hơn trong việc đánh giá đáp ứng miễn dịch của lợn đối với các chủng thực địa

Một số nghiên cứu ở Việt Nam tập trung vào khía cạnh chẩn đoán PRRSV bằng các kĩ thuật sinh học phân tử Nguyễn Ngọc Hảivà cs (2008) đã phát triển phương pháp sử dụng kĩ thuật RT-PCR nhằm xác định sự có mặt của kháng nguyên PRRSV Võ Khánh Hưngvà cs (2012) đã phát triển kĩ thuật realtime RT-PCR để định lượng và định type các chủng PRRSV đang lưu hành

2.4.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Gần đây, ngày càng nhiều nghiên cứu quan tâm đến mối quan hệ di truyền, tiến hóa và vị trí chịu áp lực đột biến trên trình tự gene ORF5 của virus PRRSV Nghiên cứu tiến hóa dựa trên trình tự ORF5 đã chia thành PRRSV type 2 thành 9 genotype khác nhau, trong đó các genotype lại có nhiều subtype nhỏ như genotype 1 có 9 subtype, genotype 8 có 9 subtype và genotype 9 có đến 17

subtype (Shiet al., 2010)

Phân tích so sánh tốc độ tiến hóa của các chủng độc lực cao và các chủng

cổ điển cho thấy: các gene ORF3, ORF5, ORF6 ở các chủng độc lực cao và các chủng cổ điển, đồng thời các vị trí chịu áp lực chọn lọc giữa 2 nhóm chủng cũng

có sự khác biệt (Nguyen et al., 2015)

Trình tự ORF5 được cho là có chứa đến 17 vị trí chịu áp lực chọn lọc

(Hanada et al., 2005) Nhiều nghiên cứu phân tích vị trí chịu áp lực chọn lọc trên

trình tự GP5 của chủng HP-PRRSV đã chỉ ra các vị trí 9, 13, 32-35, 58, 59, 94,

102, 104 (Mu et al., 2013; Song et al., 2010; Xu et al., 2010) Trong đó, một số

vị trí đã được chứng minh có liên quan đến khả năng phòng thủ của virus trước

sự tấn công của hệ miễn dịch (Fan et al., 2015; Misra, 2012)

Hướng tiếp cận trên toàn bộ trình tự genome của PRRSV cũng đang được tập trung nghiên cứu Ngày càng nhiều chủng PRRSV đã được giải trình tự toàn

bộ genome (Allende et al., 2000; Bálint et al., 2015; Kvisgaard et al., 2013; Martín-Valls et al., 2014; Jiajun Wu et al., 2012; Sook Hee Yoon et al., 2013)

Từ đó, vai trò của các gene mã hóa cũng như các đặc tính sinh học của PRRSV dần được làm sáng tỏ

PHẦN 3.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

Đề tài được thực hiện tại phòng R&D Lab thuộc Công ty Trách nhiệm hữu hạn một thành viên vaccine RTD và Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Vi sinh – Khoa Công nghệ Sinh học

3.2 THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

Đề tài được thực hiện trong thời gian từ tháng 2 năm 2014 đến tháng 12 năm 2015

Số liệu thu thập về trình tự gene ORF5 của các chủng PRRSV lưu hành tại Việt Nam xảy ra trong thời gian từ năm 2007 - 2014

3.3 ĐỐI TƯỢNG – VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

3.3.1 Đối tượng nghiên cứu

- Các mẫu bệnh phẩm của lợn dương tính với virusPRRS được thu thập tại phòng R&D Lab, Công ty Trách nhiệm hữu hạn một thành viên vaccine RTD (Bảng 3.1)

Bảng 3.1 Thông tin các chủng virus PRRS được sử dụng trong đề tài

STT Tên chủng Địa phương Năm phân lập

- Trình tự của các chủng PRRSV lưu hành tại Việt Nam tại các năm từ 2007 -

2014 và các địa phương khác nhau được công bố trên ngân hàng gene (Phụ lục 1)

3.3.2 Vật liệu

3.3.2.1.Dụng cụ nghiên cứu:

- Chai nuôi tế bào T25, T75

- Đĩa nuôi cấy tế bào 96 giếng

- Đĩa nuôi cấy tế bào 6 giếng

- Kính hiển vi soi ngược

- Box cấy vô trùng

- Cân kĩ thuật, cân phân tích

- GoTaq Green Master Mix (Promega)

- First strand cDNA synthesis kit (Fermentas)

- Môi trường DMEM dạng bột (Gibco)

- Sodium bicarbonate (Merck)

3.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Phâp lập các chủng virus PRRS từ các mẫu bệnh phẩm của lợn mắc bệnh tai xanh

- Xác định mối quan hệ di truyền giữa các chủng virus PRRS đã và đang lưu hành tại Việt Nam

- Nghiên cứu sự thay đổi về vị trí glycosyl hóa trên trình tự gene ORF5

- Nghiên cứu vị trí chịu áp lực chọn lọc trên trình tự gene ORF5

3.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.5.1 Phương pháp nuôi cấy virus trên dòng tế bào Marc-145

Tế bào Marc-145 được nuôi cấy trong môi trường DMEM (Dulbecco ified Eagle Medium) có bổ sung 5% huyết thanh và được dùng để phân lập virus PRRS Trong nghiên cứu này, mẫu bệnh phẩm dương tính PRRS được dùng để phân lập virus PRRS Mẫu bệnh phẩm được nghiền trong cối chày sứ, được đồng nhất, và được hòa thành huyễn dịch 5% trong môi trường DMEM Huyễn dịch trên được ly tâm 4000vòng/phút trong 10 phút, ở điều kiện 40C Dịch ly tâm sau

Mod-đó được lọc qua màng lọc vi khuẩn (đường kính lỗ lọc 0.45µm) rồi đem gây nhiễm vào tế bào Marc-145 Tế bào sau khi được gây nhiễm virus sẽ được nuôi cấy trong tủ ấm 370C với 5% CO2, nuôi cấy trong 4 ngày và hàng ngày kiểm tra bệnh tích tế bào (CPE) Sau 3 ngày gây nhiễm virus, tế bào gây nhiễm virus được đông tan 3 lần và được ly tâm 3000vòng/phút trong 10 phút, ở điều kiện 40C Huyễn dịch sau khi ly tâm sẽ được cấy truyền đời tiếp trên môi trường tế bào Marc-145 Thường trong những lần cấy chuyển đầu tiên sẽ không quan sát được bệnh tích tế bào Sau 5 đời cấy truyền trên môi trường tế bào, virus PRRS sẽ được chẩn đoán bằng kỹ thuật RT-PCR

3.5.2 Phương pháp chuẩn độ virus

TCID50 (50% Tissue Culture Infectious Dose) là phương pháp xác định hiệu giá virus dựa trên điểm tới hạn (end point) cho biết liều virus tại đó gây bệnh tích

ở 50% số giếng tế bào (Karber Formula) Để tính hiệu giá các chủng PRRSV phân lập được ta tiến hành chuẩn độ như sau:

3.5.2.1 Chuẩn bị tế bào Marc-145

Nuôi cấy tế bào ở đĩa 96 giếng trong tủ ấm 37°C, 5% CO2 Sau 24h tế bào phủ đáy lớp đơn sẽ được sử dụng để xác định hiệu giá virus

3.5.2.2 Chuẩn bị dịch virus cần xác định hiệu giá

Tiến hành pha loãng dịch mẫu virus theo cơ số 10 (10-1 đến 10-10) như sau:

- Cho vào 10 ống eppendorf, mỗi ống 900µl môi trường DMEM 5% FBS

- Bổ sung 100µl dịch virus vào ống eppendorf số 1 Dùng pipette và vortex đảo trộn đều ta được dịch pha loãng 10-1rồi hút 100µl chuyển sang ống eppendorf

số 2 ta được độ pha loãng 10-2 Pha loãng lần lượt cho đến độ pha loãng 10-10

3.5.2.3 Thực hiện TCID 50

- Loại bỏ môi trường nuôi cấy ở các giếng trong đĩa tế bào

- Dùngpipette đa kênh cho vào mỗi giếng 100µl PBS1x rồi lắc nhẹ đĩa để rửa tế bào Sau đó loại bỏ PBS 1x

- Bắt đầu gây nhiễm tế bào với mẫu virus có độ pha loãng từ cao tới thấp

10-10 – 10-1 Mỗi độ pha loãng dùng 4 giếng, mỗi giếng 100µl Ở các giếng đối chứng chỉ cho 100µl môi trường DMEM 5% FBS

- Bố trí thí nghiệm như sau:

- Nuôi trong tủ ấm 37°C, 5% CO2 Theo dõi bệnh tích tế bào (CPE) hàng ngày

- Sau 72h, xác định sự có mặt của virus trong các giếng bằng cách quan sát CPE dưới kính hiển vi: các tế bào co cụm lại với nhau, chồi lên khỏi bề mặt nuôi cấy, khi tế bào bị virus phá hủy hoàn toàn thì bong khỏi đáy giếng

- Đọc kết quả và tính TCID50 theo phương pháp Spearman-Karber

Trong đó:

E : Độ pha loãng cao nhất (E=10)

d : Khoảng cách giữa các độ pha loãng (d=1)

N : Tổng số giếng ở mỗi độ pha loãng (N=4)

Log TCID50= E + d x(0,5 - 1 xr) (TCID50/0,1ml)

N

3.5.3 Phương pháp tách chiết RNA của virus PRRS

Trizol (Invitrogen) được dùng để tách chiết RNA của virus PRRS, các bước được tiến hành theo sự chỉ dẫn của Kit Cụ thể bổ sung 800µl dung dịch Trizol vào 200µl huyễn dịch virus PRRS, vortex và sau đó bổ sung tiếp 200µl dung dịch Chloroform, vortex mạnh trong 15 giây, ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút Huyễn dịch trên được ly tâm 12000 vòng/phút, trong 10 phút ở 4oC Sau khi ly tâm, chuyển pha trên có chứa RNA vào một ống Eppendorf mới (với lượng khoảng 500µl) Tủa RNA của virus PRRS bằng cách bổ sung 500 µl dung dịch Isopropanol, ly tâm 12000 vòng/phút, trong 10 phút ở 4oC Rửa tủa RNA bằng 1

RNA trong 30 µl nước vô trùng đã loại RNase và bảo quản ở -20oC

3.5.4 Phương pháp tổng hợp cDNA

cDNA được tổng hợp từ RNA đã được tách chiết nhờ enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase) Để tạo cDNA chúng tôi dùng bộ kit First strand cDNA synthesis (Fermentas) sử dụng mồi Oligo dT với trình tự 5’- CTGTGAATGCTGCGACTAC GATTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’ Thành phần phản ứng và điều kiện tổng hợp cDNA như sau: 5µl RNA tinh sạch, 4.5µl nước

đã loại RNase, 3µl dNTPs (2.5mM mỗi loại), 2µl mồi oligo dT (200pM/µl), 1µl reverse transcriptase (200U/µl), 0.5µl RNase inhibitor (10U/µl) và 4µl 5x first strand buffer Phản ứng tổng hợp cDNA được thực hiện ở 37°C trong 60 phút và sau đó 94°C trong vòng 5 phút

3.5.5 Phương pháp PCR và giải trình tự gen (sequencing)

cDNA được tổng hợp ở trên được bổ sung trực tiếp vào ống phản ứng PCR

sử dụng kit GoTaq Green Master mix Kit này chứa DNA taq-polymerase và các thành phần cần thiết cho quá trình khuếch đại DNA Mồi (primer) được sử dụng

trong nghiên cứu này là các cặp mồi đã được công bố trước đây (Feng et al., 2008; Han et al., 2009) Phản ứng PCR được thực hiện theo chương trình như sau: 40

chu kỳ (94°C - 1 phút, 54°C - 1 phút, 72°C - 1 phút) và cuối cùng 8 phút ở 72°C Sản phẩm PCR sẽ được kiểm tra trên gel agarose và được gửi sang công ty Macrogen của Hàn Quốc để giải trình tự gen bằng kĩ thuật Sanger Trình tự DNA thu được sẽ được phân tích vàso sánh với các trình tự được công bố trước đây bằng phần mềm BioEdit để thu được vùng mã hóa

3.5.6 Phương pháp xác định trình tự amino acid suy biến

Trình tự mã hóa sẽ được dịch mã sang trình tự protein sử dụng công cụ Transeq, sử dụng bộ ba mã hóa tiêu chuẩn, dịch mã trên khung đọc đầu tiên, được cung cấp tại địa chỉ http://www.ebi.ac.uk/Tools/st/emboss_transeq/ Kết quả truy xuất được định dạng dưới dạng Fasta

3.5.7 Phương pháp căn trình tự

Trình tự nucleotide vùng mã hóa và trình tự amino acid suy biến của các chủng đã được giải trình tự và trình tự các chủng tham chiếu được căn trình tự sử dụng công cụ ClustalX, được cung cấp trong bộ phần mềm BioEdit Kết quả được lưu dưới định dạng Fasta

3.5.8 Phương pháp xây dựng cây phả hệ nhằm định genotype các chủng ở Việt Nam

Trình tự tham chiếu được cung cấp bởi tiến sĩ Leung, cùng với trình tự một số chủng thuộc nhóm độc lực cao được thu thập trên GenBank Cây phả hệ được xây

dựng bằng phần mềm Iq-Tree (Nguyen et al., 2015), giá trị Bootstrap được thực hiện bằng phương pháp Ultra fast bootstrap (Minh et al., 2013) Phần mềm được

cung cấp tại địa chỉ http://iqtree.cibiv.univie.ac.at/ Mô hình thay thế được là mô

hình GTR + gammar + Inversion (Shi et al., 2010) Cây phả hệ thu được được đọc

bằng phần mềm Figtree v1.3.1

3.5.9 Phương pháp phân tích vị trí N-glycosyl hóa

Trình tự amino acid suy diễn thu được được dự đoán vị trí N-glycosyl hóa sử dụng công cụ Net2GlyC được cung cấp tại địa chỉhttp://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/ Các tham số đầu vào được lựa chọn mặc định

3.5.10 Phương pháp đánh giá sự thay đổi đặc điểm di truyền của các chủng virus PRRS tại Việt Nam

Kết quả căn trình tự nucleotide được sử dụng để xây dựng cây phả hệ sử

dụng phần mềm BEAST 1.8.2 (Drummond and Rambaut, 2007; Drummond et

al., 2012) Mô hình thay thế nucleotide được lựa chọn là mô hình SRD06 đã

được mô tả trước đây(Nguyen et al., 2015) kết hợp với 1 trong 5 mô hình đồng

hồ phân tử và 1 trong 14 mô hình cây tiến hóa Chuỗi Markov Monte Calor được thực hiện với 100000000 lần lặp và lấy mẫu sau mỗi 1000 lần Mô hình tiến hóa phù hợp nhất được so sánh sử dụng công cụ Model comparison sử dụng thuật

toán AICM (Baele et al., 2012)với các tham số mặc định Cây phả hệ phù hợp

nhất được lựa chọn sử dụng phần mềm TreeAnotation, loại bỏ 10% số lượng cây

vàsử dụng các tham số mặc định

3.5.11 Phương pháp đánh giá vị trí chịu áp lực chọn lọc

Kết quả căn trình tự Nucleotide dưới dạng fasta sẽ được đưa lên và phân tích vị trí chịu áp lực chọn lọc tại địa chỉ http://www.datamonkey.org/ 6 phương pháp đánh giá vị trí chịu áp lực chọn lọc IFEL, FEL, MEME, FURBA, REL, SLAC được tiến hành độc lập để đánh giá vị trí chịu áp lực chọn lọc với mức ý nghĩa P<0.1 đối với các phương pháp IFEL, FEL, MEME, REL, SLAC, và chỉ số posterior probability > 0.9 đối với phương pháp FURBA Chỉ những vị trí được lựa chọn bởi ít nhất 3 phương pháp sẽ được ghi nhận là vị trí chịu áp lực chọn lọc

đa dạng hoặc chọn lọc thuần