ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
TRẦN KHÁNH DUY
ĐÁNH GIÁ ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA CƠ THỂ TRÊN NGƯỜI TIÊM VACCINE VÀ NGƯỜI NHIỄM COVID – 19
BẰNG ELISA PHÁT HIỆN KHÁNG THỂ TRUNG HOÀ
Chuyên ngành : Công Nghệ Sinh Học
Mã số : 8420201
LUẬN VĂN THẠC SĨ
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, Tháng 7 năm 2023
Trang 2CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠITRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA –ĐHQG -HCM Cán bộ hướng dẫn khoa học :
TS BS PHẠM HÙNG VÂN PGS TS NGUYỄN THUÝ HƯƠNG Cán bộ chấm nhận xét 1 :
TS PHẠM THỊ KIM TRÂM Cán bộ chấm nhận xét 2 :
TS HOÀNG MỸ DUNG
Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM ngày 17 tháng 7 năm 2023
Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:
1 PGS TS NGUYỄN TIẾN THẮNG - Chủ tịch Hội đồng2 TS PHẠM THỊ KIM TRÂM - Phản biện 1
3 TS HOÀNG MỸ DUNG - Phản biện 24 PGS TS NGUYỄN THUÝ HƯƠNG - Uỷ viên5 TS HUỲNH NGỌC OANH - Thư ký
Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)
Trang 3NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ tên học viên: TRẦN KHÁNH DUY MSHV: 2070073Ngày, tháng, năm sinh: 24/ 04/1992 Nơi sinh: Vĩnh Long Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 8420201
I TÊN ĐỀ TÀI: Đánh giá đáp ứng miễn dịch của cơ thể trên người tiêm vaccine
và người nhiễm covid – 19 bằng ELISA phát hiện kháng thể trung hoà (Evaluation of The Immune Response in Vaccinated And Sars – Cov – 2 Infected People by Detection of Neutralizing Antibody Using Elisa)
NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:
Nhiệm vụ:
• Phân tích tương quan giữa đáp ứng miễn dịch kháng thể trung hoà và khángthể kháng protein gai (Spike)
• Đánh giá đáp ứng miễn dịch kháng thể trung hồ trên nhóm đối tượng sautiêm chủng với các nhóm vaccine được áp dụng ở Việt Nam Hiệu quả củamũi tiêm tăng cường.
• Đánh giá đáp ứng miễn dịch kháng thể trung hoà trên đối tượng nhiễm tựnhiên virus SARS – CoV – 2 với trạng thái tiêm chủng khác nhau
Nội dung:
• Xây dựng phương pháp nghiên cứu• Thu thập mẫu và tiến hành xử lý
• Phân tích mối tương quan giữa mức độ kháng thể trung hoà và kháng thểkháng protein gai
o Thu nhận mẫu và xử lý mẫu
o Thực hiện thử nghiệm ELISA phát hiện kháng thể trung hoà và thửnghiệm ELISA định lượng kháng kháng protein gai
o Thống kê phân tích tương quan Pearson, hồi quy tuyến tính
• Đánh giá đáp ứng miễn dịch kháng thể trung hồ trên các nhóm tiêm vaccinekhác nhau Hiệu quả mũi tiêm tăng cường
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM
Trang 4o Thực hiện thử nghiệm ELISA phát hiện kháng thể trung hoào Thống kê mơ tả mức độ kháng thể trung hồ theo từng nhómo Phân tích khác biệt trung bình (ANOVA) giữa các nhóm
o Phân tích tác động của các biến số giới tính, độ tuổi, khoảng thời giansau tiêm và khoảng cách mũi tiêm đến mức độ kháng thể trung hồ(Independent T – test)
• Đánh giá đáp ứng miễn dịch kháng thể trung hoà trên đối tượng nhiễm virusSARS – CoV – 2 với các trạng thái tiêm chủng khác nhau
o Thực hiện thử nghiệm ELISA phát hiện kháng thể trung hồo Thống kê mơ tả mức độ kháng thể trung hồ theo từng nhómo Phân tích khác biệt trung bình (ANOVA) giữa các nhóm
II NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 06/02/2023III NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ:
IV NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS BS Phạm Hùng Vân
PGS TS Nguyễn Thuý Hương
Tp Hồ Chí Minh, ngày … tháng … năm 2023
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN 1
(Họ tên và chữ ký)
TS BS PHẠM HÙNG VÂN
CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO
(Họ tên và chữ ký)
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN 2
(Họ tên và chữ ký)
PGS TS NGUYỄN THUÝ HƯƠNG
Trang 5i
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên tôi muốn được bày tỏ là lòng biết ơn sâu sắc nhất tới Thầy Phạm Hùng Vân, là người hướng dẫn khoa học, người thầy đã quan tâm tạo điều kiện tốt nhất để tơi hồn thành đề tài này
Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới cô Nguyễn Thuý Hương, là giảng viên đồng hướng dẫn đề tài, người đã ân cần hướng dẫn hỗ trợ tơi hồn thành đề tài này cũng như quý thầy cô bộ môn Công Nghệ Sinh Học, trường Đại Học Bách Khoa Thành Phố Hồ Chí Minh, đã hết lịng truyền đạt những kiến thức q báu dẫn dắt tôi đến với con đường khoa học và giáo dục tôi trưởng thành hơn về mọi mặt
Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn trân trọng tới Ban lãnh đạo công ty Nam Khoa đã tạo điều kiện thuận lợi cho tơi được học tập và hồn thành nghiên cứu
Bằng tình yêu mến và lời cảm ơn chân thành, tôi xin được gửi đến các anh chị em phịng RD, phịng DV cơng ty Nam Khoa những người đã tận tình giúp đỡ và hỗ trợ để tơi hồn thành luận văn ngày hơm nay
Xin cảm ơn tất cả những người bạn thân đã luôn gắn bó, san sẻ, động viên tơi trong suốt thời gian học tập tại trường cũng như thời gian tôi thực hiện đề tài
Cảm ơn vợ và hai con đã luôn bên cạnh động viên và là động lực to lớn để tơi hồn thành đề tài này
Cuối cùng, con xin ghi nhớ công ơn sinh thành, nuôi dưỡng và tình yêu thương của Cha mẹ đã dành cho con, người đã dành cả cuộc đời mình để lo lắng dìu bước con trong cuộc sống này, người đã luôn ở bên con, là chỗ dựa vững chắc để con yên tâm học tập và hồn thành luận văn này
Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2023
Trang 6ii
TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ
Đề tài “Đánh giá đáp ứng miễn dịch của cơ thể trên người tiêm vaccine và người nhiễm covid – 19 bằng ELISA phát hiện kháng thể trung hoà” thực hiện nhằm mục tiêu làm rõ đáp ứng miễn dịch cơ thể sau tiêm chủng, miễn dịch hậu nhiễm, cung cấp các bằng chứng khoa học về hiệu quả tiêm chủng trên các loại vaccine triển khai phổ biến ở Việt Nam cũng như chiến lược đa dạng hoá đáp ứng miễn dịch cộng đồng Bằng các thử nghiệm ELISA phát hiện kháng thể trung hoà, định lượng kháng thể đặc hiệu kháng protein gai (Spike) kết hợp với các phương pháp phân tích thống kê liên quan, đề tài đã thu được một số kết quả như sau:
- Ghi nhận sự tương quan giữa nồng độ kháng thể kháng protein S và mức độ biểu hiện kháng thể trung hoà (r (Pearson) = 0.501, p < 0.0001) và tính khả thi của sử dụng thử nghiệm ELISA phát hiện kháng thể trung hoà trong đánh giá đáp ứng miễn dịch với SARS – CoV – 2
Trang 7iii
tính ở nhóm tiêm vaccine VC – VC (p = 0.02), không ghi nhận khác biệt ở các nhóm cịn lại
- Mũi tiêm tăng cường được báo cáo làm gia tăng đáng kể kháng thể trung hồ các nhóm tiêm so với kết quả tiêm hai mũi trước đó, hiệu quả của mũi tiêm tăng cường bằng vaccine PF là cao hơn so với mũi tiêm vaccine AZ, kết quả trung bình tương ứng đạt 84.77% và 66.35% (p < 0.0001) Chi tiết kết quả nổi bật ở nhóm AZ – AZ – PF đạt 79.95%, VC – VC – PF đạt 91.02% hay nhóm tiêm trộn AZ – MD – PF cho kết quả 93.37%, AZ – PF – PF đạt 85.39% cao hơn nhóm tiêm thuần AZ – AZ -AZ với kết quả 64.32% hay so với nhóm tiêm AZ – MD – AZ đạt 67.49% và nhóm tiêm AZ – PF – AZ đạt 63.4%
- Mức độ kháng thể trung hoà ở người nhiễm virus nhưng chưa từng tiêm chủng ở mức thấp đạt 40.42%, có sự khác biệt mạnh mẽ khi người nhiễm có tiền sử tiêm chủng ít nhất một mũi hoặc hai mũi vaccine tương ứng đạt 84.03% (p < 0.0001) và 86.65% (p < 0.0001) Không cần tiêm mũi bổ sung cho đối tượng đã nhiễm và đã tiêm chủng trước đó
Trang 8iv
ABSTRACT
The study " Evaluation of the immune response in vaccinated and SARS – CoV – 2 infected individuals by detection of neutralizing antibody using ELISA" was conducted with the aim of investigating immune response after vaccination and natural infection by measuring the level of neutralizing antibody against SARS – CoV – 2 Additionally, the findings from this research may offer valuable insights into the effectiveness of commonly used vaccines in Vietnam and inform strategies for enhancing immune response to achieve herd - immunity By performing ELISA assays to detect the potential presence of neutralizing antibodies and quantify Spike-specific antibody proteins followed by statistical analysis methods, our study has obtained the following results:
- Significant correlation was observed between the levels of anti-protein S antibody and neutralizing antibody (r (Pearson) = 0.501, p < 0.0001), which offers supportive evidence for the feasibility of using ELISA test to detect neutralizing antibodies in evaluating the immune response to SARS-CoV-2 - Neutralizing antibody level response in individuals receiving two doses of
Trang 9v
with the duration after injection in the AZ-AZ, PF–PF group and the
combined group of the two vaccines (p (AZ-AZ) < 0.001, p (PF-PF) = 0.015, p (AZ-PF) < 0.001) The difference in the level of neutralizing antibodies was significantly influenced by the gender of individuals receiving VC - VC (p = 0.02), while no such difference was observed in the remaining groups - A booster shot was reported to significantly increase neutralizing antibodies
compared to the previous two doses We observed a substantial rise in neutralizing antibody capacity among participants who received PF as booster vaccine, with a mean antibody level of 84.77%, compared to those receiving AZ vaccine, with a mean level of 66.35% (p < 0.0001) In detail, the results were outstanding in the AZ-AZ-PF group, exhibiting the median of neutralizing antibody level of 79.95%, and the VC-VC-PF group, which displayed a level of 91.02% The mixed group of AZ-MD-PF achieved a value of 93.37% and AZ-PF-PF reached 85.39%, both surpassing the homologous booster AZ-AZ-AZ (64.32%), as well as the group injected with AZ-MD-AZ (67.49%) or AZ-PF-AZ group (63.4%)
Trang 10vi
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan luận văn tốt nghiệp “Đánh giá đáp ứng miễn dịch của cơ thể trên người tiêm vaccine và người nhiễm covid – 19 bằng ELISA phát hiện kháng thể trung hồ” là cơng trình nghiên cứu do chính tơi thực hiện Các số liệu thu thập, kết quả nghiên cứu và các kết luận trong luận văn là trung thực, không sao chép từ bất cứ đề tài nghiên cứu nào và dưới bất kỳ hình thức nào Việc tham khảo các nguồn tài liệu đã được thực hiện trích dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo đúng quy định
Học viên
Trang 11vii
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN i
TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ ii
ABSTRACT iv
LỜI CAM ĐOAN vi
MỤC LỤC vii
DANH MỤC HÌNH ẢNH ix
DANH MỤC BẢNG BIỂU x
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT xi
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5
1.1 SARS – CoV – 2 5
1.1.1 Phân loại 6
1.1.2 Cấu trúc và chức năng gen 9
1.2 Đáp ứng miễn dịch chống SARS – CoV – 2 10
1.3 Các loại vaccine ngừa COVID – 19 12
1.4 Giải pháp xét nghiệm định lượng hiệu quả vaccine 14
1.5 Mục tiêu nghiên cứu và định hướng đề tài 16
CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 18
2.1 Vật liệu nghiên cứu 18
2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 18
2.1.2 Hoá chất 19
2.1.3 Thiết bị và dụng cụ 20
2.2 Phương pháp nghiên cứu 22
2.2.1 Sơ đồ quy trình thực hiện 22
2.2.2 Thống kê kết quả 29
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 31
3.1 Kết quả phân tích tương quan giữa mức độ kháng thể trung hoà và tải lượng kháng thể kháng protein S 31
3.2 Đáp ứng kháng thể trung hồ trên những người đã chích 2 mũi vaccine 33
3.2.1 Phân tích tương quan mức độ biểu hiện kháng thể trung hoà và độ tuổi 38
3.2.2 Phân tích tương quan mức độ biểu hiện kháng thể trung hoà và khoảng cách hai mũi tiêm 40
Trang 12viii
3.2.4 Phân tích tương quan mức độ biểu hiện kháng thể trung hoà và giới tính 42
3.3 Đáp ứng kháng thể trung hoà trên những người tiêm mũi tăng cường 44
3.4 Đáp ứng kháng thể trung trên những người nhiễm SARS – CoV – 2 51
3.5 Theo dõi động học của đáp ứng kháng thể trung hoà 54
3.6 Đáp ứng kháng thể trung hoà sau khi nhiễm biến chủng Omicron 57
CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 61
4.1 Kết luận 61
4.2 Kiến nghị 62
TÀI LIỆU THAM KHẢO 63
PHỤ LỤC 71
Trang 13ix
DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1 Cấu trúc phân tử của virus và so sánh hệ gen của SARS - CoV - 2 với các chủng coronavirus trước đó
Trang 14x
DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1.1 Nguồn gốc các biến thể và tốc độ lây lan so với dòng ban đầu
(https://www.who.int/activities/tracking-SARS-CoV-2-variants) 8 Bảng 1.2 Các đột biến trên gen S và trên vùng RDB của gen S ở trên biến thể
Trang 15xi
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
ACE2 Angiotensin-converting enzyme 2
AZ AstraZeneca (ChAdOx1 )
ECDC The European Centre for Disease Prevention and Control
ELISA Enzyme – Linked Immunosorbent Assay
MD Moderna (mRNA - 1273)
mRNA Messenger RNA
NN Nanocovax
NSP nonstructural proteinORF Open reading frame
PF Pfizer (BNT162b2)
RNA Ribonucleic acid
VC VeroCell (BBIBP-CorV)
Trang 161
MỞ ĐẦU
1.Đặt vấn đề
Năm 2019, SARS – CoV – 2 được xác định là tác nhân lây nhiễm khẩn cấp mới trên toàn cầu đánh dấu hơn 100 năm kể từ sau đại dịch cúm năm 1918, thế giới lại đang phải đối mặt với tình trạng tương tự Tại thời điểm ngày 11 tháng 3 năm 2021, hơn 100.000 người bị lây nhiễm ở hơn 100 quốc gia đã được ghi với trường hợp tử vong hơn 4000 người [1], WHO đã chính thức cơng bố tình trạng “đại dịch” gây ra bởi coronavirus Các ca nhiễm trùng từ đó đã phát triển theo cấp số nhân trên khắp các quốc gia và lục địa Khả năng kiểm sốt nhanh chóng đại dịch đã bị hạn chế bởi nhiều yếu tố, bao gồm thiếu kiến thức sinh học chi tiết về SARS-CoV-2 và các phản ứng miễn dịch của vật chủ, thiếu công cụ chẩn đốn nhanh chóng và xác định ca bệnh, cũng như thiếu các phương pháp điều trị hiệu quả Những trở ngại này cũng là động lực cho cộng đồng y tế và khoa học đã tạo ra kiến thức và thơng tin với tốc độ chóng mặt và tham gia vào mức độ chia sẻ chưa từng có trên các nền tảng công bố khoa học đa dạng nhất về SARS – CoV – 2 [2]
SARS-CoV-2 gây nhiễm trùng đường hô hấp trên và dưới, thường đi kèm với sốt, ho, mất khứu giác và vị giác Hầu hết các trường hợp nhiễm trùng vẫn ở mức độ nhẹ, có tới 20–40% bệnh nhân khơng có triệu chứng Tuy nhiên, một số bệnh nhân có diễn biến tăng nặng và phát triển viêm toàn thân, tổn thương mơ, suy hơ hấp cấp tính, biến chứng huyết khối tắc mạch, tổn thương tim và / hoặc cơn bão cytokine, dẫn đến tử vong Nguy cơ mắc bệnh COVID-19 mức độ nghiêm trọng còn phụ thuộc vào các bệnh đi kèm (ví dụ, tiểu đường, cao huyết áp và béo phì), tuổi tác, dân tộc, các yếu tố di truyền, tình trạng tiêm chủng và các tình trạng khác làm cho việc hiểu cơ chế bệnh cơ bản trở nên quan trọng đối với phân tầng nguy cơ và phân loại lâm sàng [3]
Trang 172
SARS-CoV-2 từ nhiều nền tảng (mRNA được bao bọc bởi hạt nano lipid, vắc-xin virion bất hoạt hoặc vaccine vector virus) đã được cấp phép sử dụng khẩn cấp (EUA) hoặc phê duyệt và được triển khai cho hàng tỷ người trên tồn thế giới Ở các quốc gia có tỷ lệ tiêm chủng cao, số ca nhiễm trùng, nhập viện và tử vong đã giảm rõ rệt, mặc dù sự thành công của việc tiêm chủng đã bị đe dọa bởi sự xuất hiện của các biến thể bao gồm B.1.351 (Beta), B.1.1.28 (Gamma), B.1.617.2 (Delta) và B.1.1.529 (Omicron) mới nhất cũng như sự chần chừ của bộ phận cá nhân anti-vaccine Với việc diễn tiến biến chủng mới ngày một đa dạng, các sản phẩm vaccine mới cũng như điều kiện tiếp cận vaccine khác nhau của các quốc gia đã đặt ra câu hỏi về mức độ hiệu quả của đáp ứng miễn dịch vaccine, miễn dịch hậu nhiễm hay chiến lược đa dạng hoá trạng thái đáp ứng miễn dịch cộng đồng Để giải đáp các trở ngại trên, công cụ đo lường miễn dịch là một trong những giải pháp khả thi nhằm cung cấp góc nhìn khoa học, thực tế và có ý nghĩa nhất với việc đánh giá mức độ miễn dịch cá thể trong tổng hợp các giải pháp phòng chống SARS- CoV-2 Đề tài
“ĐÁNH GIÁ ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA CƠ THỂ TRÊN NGƯỜI TIÊM VACCINE VÀ NGƯỜI NHIỄM COVID – 19 BẰNG ELISA PHÁT HIỆN KHÁNG THỂ TRUNG HOÀ” được thực hiện với mong muốn đóng góp thơng tin
khoa học cơ bản về miễn dịch hậu nhiễm, miễn dịch nhân tạo do vaccine cũng như những sự lựa chọn tối ưu trong năng lực quốc gia về triển khai tiêm chủng toàn dân ứng phó với đại dịch Covid – 19
2 Nội dung nghiên cứu
• Sử dụng kit ELISA phát hiện kháng thể đặc hiệu protein S và kit ELISA phát hiện kháng thể trung hòa trong mẫu huyết thanh/huyết tương của cá thể được tiêm chủng 1 mũi, 1 liệu trình, tiêm tăng cường và cá thể đã nhiễm tự nhiên SARS-CoV-2 Từ đó đánh giá
o Hiệu quả các loại vaccine khác nhau, bao gồm các hình thức tiêm thuần và tiêm trộn các vaccine
Trang 183 o Hiệu quả của mũi tiêm tăng cường
o Mức độ miễn dịch ở đối tượng đã nhiễm cùng với lịch sử tiêm chủng tương ứng
3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
Đối tượng mẫu:
• Huyết thanh/ huyết tương của cá thể đã thực hiện tiêm chủng: 1 mũi, 1 liệu trình, tiêm tăng cường
• Huyết thanh/ huyết tương của cá thể đã nhiễm tự nhiên SARS – CoV - 2
4 Cách tiếp cận và phương pháp nghiên cứu
Mẫu thử được thu nhận từ các tình nguyện viên theo từng giai đoạn:
• Giai đoạn 1: nhóm đối tượng đã tiêm vaccine mũi đầu tiên hoặc / và hồn tất 1 liệu trình, cá nhân đã nhiễm SARS – CoV – 2 nhưng chưa tham gia tiêm vaccine
• Giai đoạn 2: nhóm đối tượng đã hồn tất liệu trình tiêm chủng, một số cá thể nhiễm mới sau tiêm hoặc tiêm tăng cường sau khi nhiễm, cá thể đã tiêm mũi tăng cường
• Giai đoạn 3: theo dõi cá nhân tiêm mũi tăng cường, mũi phối hợp, các nhân nhiễm mới hoặc tái nhiễm do biến chủng mới
Các đánh giá dựa trên định lượng kháng thể trung hoà thông qua kỹ thuật ELISA với tên gọi thử nghiệm trung hoà thay thế (surrogate virus neutralization test)
5 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
• Cung cấp thông tin cơ bản về đáp ứng miễn dịch cá thể hình thành thơng qua tự nhiễm hay miễn dịch nhân tạo bằng vaccine chống lại SARS – CoV – 2 • Đánh giá sơ bộ, riêng rẽ mức độ hình thành năng lực miễn dịch ở các ứng
Trang 194
Trang 205
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 SARS – CoV – 2
Trang 216
1.1.1 Phân loại
1.1.1.1 Giả thuyết nguồn gốc
Nhờ vào việc nhanh chóng xác định trình tự bộ gen và phân tích phát sinh loài của coronavirus mới SARS-CoV-2 đã chỉ ra rằng nó tương tự về mặt di truyền với coronavirus SARS-CoV đã biết trước đây và đó cũng là lý do nó được xếp vào họ
Coronaviridae Coronavirus chứa RNA sợi đơn dương (+ ve ssRNA) làm vật liệu di
truyền của nó, có chiều dài khoảng 30 kb được bọc kín bởi một lớp vỏ và phủ bên ngoài màng acid béo giúp virus tránh được phản ứng miễn dịch của vật chủ và hỗ
trợ xâm nhập của nó bên trong tế bào chủ [5] Phân họ Coronavirinae được chia
nhỏ thành bốn chi, cụ thể là alpha-, beta-, gamma- và delta- coronavirus (α-CoV, β-CoV, γ-CoV và δ-CoV) Các virus có khả năng lây nhiễm sang người được xếp vào chi α-CoV và β-CoV (SARS-CoV & MERS-CoV), trong khi virus thuộc các chi γ-CoV và δ-γ-CoV chủ yếu được biết là lây nhiễm cho lợn và chim SARS-γ-CoV-2 thuộc giống β-CoV, vì nó có 88% nhận dạng trình tự với coronavirus từ dơi nhưng chỉ giống 79% với SARS-CoV và 50% giống với MERS-CoV Giả thuyết ban đầu được xây dựng rằng vật chủ trực tiếp của virus này có thể là một con dơi, sau đó truyền nó sang một số vật chủ trung gian không xác định đóng vai trị là nguồn truyền virus cho người
1.1.1.2 Biến thể SARS – CoV – 2 (Variants)
Trang 227
Trang 238
Bảng 1.1 Nguồn gốc các biến thể và tốc độ lây lan so với dòng ban đầu (https://www.who.int/activities/tracking-SARS-CoV-2-variants)
Biến thể Tên khác Nguồn gốc Thời gian phát hiện Tốc độ lây VOCVariant of Concern Alpha B.1.1.7 UK Dec 2020 82%
Beta B.1.351 South Africa Jan 2021 50%
Gamma P.1 Brazil Jan 2021 161%
Delta B.1.617.2 India Oct 2020 191%
Omicron B.1.1529 South Afica Nov 2021 500%
VUIVariant underInvestigation Epsilon B.1.429 B.1.427 USA Mar 2020 20%
Kappa B.1.617.1 India Oct 2020 ?
Eta B.1.525 Nigeria Dec 2020 ?
Iota B.1.526 USA Nov 2020 ?
SARS – CoV – 2 Variant Classification and Definition Bảng 1.2 Các đột biến trên gen S và trên vùng RDB của gen S ở trên biến thể
Omicron
Biến thể Đột biến Đột biến quan ngại
Alpha 10 (+3) 1 (+2) ở vùng RBD, 1 (+1) giảm hiệu quả moAb, 1 gần cleavage site, có D614G
Beta 10 1 ở vùng RBD, 2 giảm hiệu quả moAb, có D614G
Gamma 11 3 ở vùng RBD, 2 giảm hiệu quả moAb, 1 gần cleavage site, có D614G
Delta 10 2 ở vùng RBD, 1 gần cleavage site, có D614G
Trang 249
1.1.2 Cấu trúc và chức năng gen
Bộ gen SARS-CoV-2 bao gồm 12 khung đọc mở (ORF) Đầu kết thúc 5 ′ của bộ gen virus, có mặt các ORF chồng lấn 1a và 1b mã hóa RNA polymerase và các protein không cấu trúc khác của virus và chiếm khoảng 2/3 bộ gen Các gen mã hóa các protein cấu trúc như gai (S), màng (M), vỏ (E) và nucleocapsid (N), có mặt trong một phần ba bộ gen cịn lại của nó kéo dài từ đầu 5' đến đầu 3', cùng với một số gen mã hóa protein khơng cấu trúc (NSP) và protein phụ nằm rải rác ở giữa (Hình 1.1) Như đã mơ tả ở nội dụng trên một số thay thế axit amin đã xảy ra trong các gen coronavirus mới mã hóa protein S, NSP2, NSP3 và miền liên kết thụ thể (RBD) Những đột biến này trong NSP2 & NSP3 cũng được cho là mang lại khả năng lây nhiễm nâng cao của coronavirus mới
Trang 2510
1.2 Đáp ứng miễn dịch chống SARS – CoV – 2
Một khi virus xâm nhập vào bên trong tế bào đích, hệ thống miễn dịch của vật chủ sẽ nhận diện toàn bộ virus hoặc các yếu tố kháng nguyên (Epitopes), tạo ra phản ứng miễn dịch tự nhiên (Innate) hoặc thích ứng (Adaptive) Các thụ thể nhận dạng mầm bệnh (PRR – Pathogen recognition receptors) hiện diện trên các tế bào miễn dịch, chủ yếu là các thụ thể Toll-like 3, 7 và 8 nhận dạng đầu tiên virus, dẫn đến việc tăng cường sản xuất interferon (IFN) Chức năng của các tế bào miễn dịch bẩm sinh của vật chủ bị suy giảm trong quá trình nhiễm trùng SARS-CoV và MERS-CoV bởi các protein không cấu trúc của chúng ảnh hưởng đến việc sản xuất cytokine [11] Phản ứng miễn dịch dịch thể đối với SARS-CoV-2 đã được ghi nhận là tương tự như đối với các bệnh nhiễm trùng coronavirus khác, liên quan đến việc sản xuất IgG (Immunoglobulin G) và IgM (Immunoglobulin M) đặc trưng Khi bắt đầu nhiễm SARS-CoV, các tế bào B tạo ra phản ứng sớm chống lại protein N, trong
Hình 1.1 Cấu trúc phân tử của virus và so sánh hệ gen của SARS - CoV - 2 với các chủng coronavirus trước đó
Trang 2611
khi các kháng thể chống lại protein S có thể được phát hiện sau 4-8 ngày kể từ khi xuất hiện các triệu chứng ban đầu Mặc dù protein N nhỏ hơn protein S, nhưng nó có tính sinh miễn dịch cao Các kháng thể IgA (Immunoglobulin A), IgG và IgM đặc hiệu với SARS-CoV được phát hiện sau khi bắt đầu xuất hiện các triệu chứng tại các thời điểm khác nhau ở những bệnh nhân bị nhiễm bệnh IgG được phát hiện duy trì bền vững trong một thời gian dài, trong khi mức IgM bắt đầu giảm sau 3 tháng [12] Kháng thể IgM và IgA được phát hiện 5 ngày sau khi xuất hiện các triệu chứng ban đầu, trong khi IgG được phát hiện sau 14 ngày Một nghiên về sự nhân lên virus và hiện diện kháng thể đã ghi nhận sự hiện diện của hiệu giá kháng thể IgG và IgM cao hơn ở những bệnh nhân nặng Họ cũng quan sát thấy rằng những người phản ứng yếu với kháng thể IgG có tốc độ đào thải virus nhanh hơn những người phản ứng mạnh Quan sát này cho thấy rằng phản ứng kháng thể mạnh mẽ dẫn đến mức độ nghiêm trọng của bệnh trong khi phản ứng yếu ớt có liên quan đến việc đào thải virus [13]
1.2.1.1 Đáp ứng miễn dịch hậu nhiễm (nhiễm trùng tự nhiên)
Trang 2712
1.2.1.2 Miễn dịch do vaccine
Việc đánh giá các phản ứng miễn dịch do tiêm chủng chủ yếu tập trung vào sự gia tăng của các kháng thể nhắm vào vùng S1 của protein gai SARS-CoV-2 Ưu điểm chính của vaccine là hiệu giá IgG kháng S (Spike) cao hơn so với nhiễm trùng tự nhiên, với huyết thanh của những người được tiêm chủng cho thấy khả năng trung hòa tốt hơn virus SARS-CoV-2 so trong ống nghiệm [15]
1.3 Các loại vaccine ngừa COVID – 19
Cho đến hiện nay, đã có nhiều loại vaccine được các các hãng dược phẩm nghiên cứu, cho ra đời và sử dụng để ngừa COVID-19, chủ yếu dựa trên 4 công nghệ sau [16]
Vaccine bất hoạt: là công nghệ sử dụng chính virus SARS-COV-2 ni cấy trên tế
Trang 2813
Vaccine tiểu đơn vị: là công nghệ sản xuất vaccine protein gai của SARS-COV-2 từ
các tế bào ni cấy Hiện nay có hai loại vaccine sử dụng công nghệ này Vaccine Novavac (Mỹ) được sản xuất từ các tế bào bướm đêm cho nhiễm baculovirus đã được tái tổ hợp gen S của SARS-COV-2 rồi nuôi cấy để gặt lấy các tiểu đơn vị protein S làm vaccine Vaccine Nanocovax (Nanogen, Việt Nam) được sản xuất từ các tế bào CHO (Chinese Hamster Ovary) đã được chèn gen S của SARS-COV-2 rồi nuôi cấy để thu lấy các tiểu đơn vị protein S làm vaccine Vaccine Nanocovac đã qua thử nghiệm lâm sàng giai đoạn 3
Vaccine DNA vector: là công nghệ sản xuất vaccine bằng cách sử dụng adenovirus
đã được chèn gen S của SARS-COV-2 làm vector chuyển gen S vào tế bào người được chích vaccine để tế bào người sản xuất ra protein S, nhờ vậy mà kích hoạt được hệ thống miễn dịch của cơ thể sinh ra các miễn dịch đặc hiệu chống lại protein S [6] Hiện có 4 loại vaccine sử dụng công nghệ này Hãng AstraZeneca phối hợp với đại học Oxford sử dụng DNA vector là adenovirus của tinh tinh (chimpanzee) Gameleya của Nga thì sử dụng adenovirus type 5 và type 26 của người làm DNA vector Johnson&Johnson (Mỹ) sử dụng adenovirus type 26 và Cansino (Trung Quốc) thì sử dụng adenovirus type 5 của người để làm vaccine DNA vector
Vaccine mRNA: là công nghệ tổng hợp hoàn toàn trong ống nghiệm các chuỗi
Trang 2914
thành phần của chuỗi mRNA, và cuối cùng là phải bọc được mRNA vào trong các hạt nanolipid Công nghệ sản xuất vaccine mRNA được cho là công nghệ sản xuất vaccine tiên tiến và cách mạng nhất hiện nay vì đây là công nghệ sản xuất nhanh, linh hoạt và hiệu quả nhất Nhanh là vì qui trình sản xuất rất nhanh với thời gian cho mỗi mẻ sản xuất là không quá 12 giờ; Linh hoạt là có thể thay đổi trình tự mRNA khá dễ dàng theo sự thay đổi do đột biến của tác nhân gây dịch; và hiệu quả là vì đáp ứng miễn dịch của cơ thể sau khi được chích vaccine loại này cũng được cơng nhận là mạnh nhất Hiện có hai nhà sản xuất đang làm chủ cơng nghệ sản xuất vaccine mRNA, đó là Pfizer/BioNtech (Mỹ) và Moderna (Mỹ) Ngồi ra cịn có một nhà sản xuất nữa là Arcturus (Mỹ) cho ra đời một loại vaccine mRNA tự nhân bản dành cho COVID-19 và đang chuyển giao công nghệ cho công ty Vin-Biocare
1.4 Giải pháp xét nghiệm định lượng hiệu quả vaccine
Định lượng hiệu quả của vaccine bao gồm định lượng hiệu quả của đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể và đáp ứng miễn dịch tế bào
Đối với đáp ứng miễn dịch tế bào, hiện nay các nhà nghiên cứu có thể định lượng
đáp ứng này bằng phương pháp định lượng interferon gamma từ tế bào lympho T tiết ra khi gặp kháng nguyên protein S của SARS-COV-2 Tuy nhiên trên thực tế thì rất khó để có thể thực hiện kỹ thuật này trong các phịng thí nghiệm chẩn đốn, do vậy mà có thể nói chúng ta chưa có xét nghiệm định lượng đáp ứng miễn dịch tế bào áp dụng được tại các cơ sở xét nghiệm [16]
Đối với đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể, thì lý tưởng nhất là phải định lượng
Trang 3015
hiệu quả bảo vệ của đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể có trong huyết thanh của người được chích ngừa [19], tuy nhiên PRNT chỉ có thể thực hiện được trong phịng thí nghiệm có đủ chuẩn an tồn sinh học cấp III (BSIII) vì phải thao tác ni cấy SARS-COV-2, chính vì vậy PRNT khơng thể thực hiện tại các phịng xét nghiệm chẩn đốn
Như vậy thì có giải pháp xét nghiệm nào có thể thực hiện được trong các phịng xét nghiệm chẩn đốn để định lượng được hiệu quả của đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể trung hịa SARS-COV-2 trên người được chích vaccine? Hiện đã có những xét nghiệm huyết thanh học thực hiện trên các thiết bị miễn dịch tự động để định lượng được kháng thể đặc hiệu protein S (Roche, với đơn vị định lượng là IU) hay định lượng kháng thể đặc hiệu RBD (Abbott, với đơn vị định lượng là BAU: Binding Antibody Unit) Câu hỏi được đặt ra là liệu các xét nghiệm này có phản ánh được lượng kháng thể trung hịa có trong huyết thanh người thử hay không? Chúng ta cũng biết là protein S có rất nhiều loại đặc hiệu kháng nguyên (gọi là epitope) và chỉ có một số ít là kích hoạt tạo ra kháng thể trung hịa, cịn đa số thì khơng liên quan Chính vậy định lượng kháng thể đặc hiệu protein S là định lượng tất cả các kháng thể đặc hiệu cho vô số các loại epitope kháng nguyên trên protein S, trong đó chỉ có một số rất ít là thật sự có vai trị kháng thể trung hòa RBD là vùng gắn thụ thể ACE2 của protein S và kháng thể đặc hiệu RBD có thể bao gồm cả kháng thể trung hòa lẫn kháng thể nhận diện RBD chứ khơng có vai trị trung hịa (hình 8) Chính vậy định lượng kháng thể đặc hiệu RBD cũng khơng phản ảnh được lượng kháng thể trung hịa
Trang 3116
% kháng thể có trong huyết thanh người thử cạnh tranh được với RBD không cho gắn lên ACE2
1.5 Mục tiêu nghiên cứu và định hướng đề tài
Mục tiêu 1: Xem xét mức độ hiệu quả của việc đáp ứng miễn dịch ở các chủng loại vaccine được sử dụng ở Việt Nam
Ở giai đoạn 1, tiến hành thu nhận mẫu từ 330 cá thể từ giữa tháng 10/2021 đến cuối tháng 11/2021, cá nhân tham gia tập trung vào các cá nhân hoàn thành tiêm chủng mũi 2 ở các loại vaccine khảo sát Thực hiện đồng thời, đo mức độ sinh kháng thể trung hoà ở từng loại vaccine, định lượng đồng thời kháng thể kháng protein S trên 188 đối tượng để tìm mối tương quan (nếu có) giữa định lượng kháng thể kháng S và kháng thể trung hoà
Kết quả giai đoạn 1 sẽ tập trung trả lời về mức độ đáp ứng miễn dịch thơng qua giá trị kháng thể trung hồ ở từng loại vaccine khác nhau, cùng với đó là phân tích sự ảnh hưởng của các yếu tố độ tuổi, giới tính, khoảng cách mũi tiêm, thời gian sau tiêm đến mức độ đáp ứng kháng thể trung hoà; đánh giá đáp ứng miễn dịch ở các nhóm vaccine và sự khác biệt dựa trên bản chất công nghệ sản xuất vaccine; đánh giá hiệu quả của hình thức tiêm trộn vaccine ở Việt Nam
Mục tiêu 2: Đánh giá mức độ thay đổi đáp ứng miễn dịch ở cá nhân tiêm tăng cường mũi 3, sự khác biệt giữa phối hợp vaccine cũng như phương án tiêm phối hợp ý nghĩa nhất
Nghiên cứu thu nhận được 339 cá nhân đã hoàn thành tiêm mũi tăng cường Giai đoạn này chỉ thực hiện đo kháng thể trung hoà, so sánh sự khác biệt ở các thời điểm cũng như xếp hạng các tình huống tiêm tăng cường bằng mũi vaccine phối hợp
Mục tiêu 3: Đánh giá mức đáp ứng miễn dịch ở cá nhân các cá nhân nhiễm virus SARS – CoV – 2 cùng với lịch sử tiêm chủng
Trang 3217
với tình trạng tiêm chủng bao gồm chưa tiêm, đã nhận ít nhất một mũi tiêm, đã nhận ít nhất 2/3 mũi tiêm, các cá nhân đã tiêm và nhiễm và tiếp tục nhận mũi bổ sung Trong phạm vi đề tài, có 331 cá thể phù hợp đã tham gia thử nghiệm Kết quả trong nội dung này gợi ý về vai trò việc tiêm phủ vaccine cũng như sự cần thiết của mũi tiêm bổ sung hậu nhiễm
Mục tiêu 4: Theo dõi động lực học của mức độ đáp ứng miễn dịch kháng thể trung hoà ở một số đối tượng tham gia tái đánh giá
Thông qua việc phân tích sự thay đổi mức độ kháng thể trung hoà trên các đối tượng tái đánh giá, ghi nhận các tác động có thể diễn ra đến sự gia tăng/ suy giảm miễn dịch ngồi thực địa có bao gồm yếu tố dịch tễ đặc thù ở Việt Nam qua từng giai đoạn lây lan dịch
Mục tiêu 5: Đánh giá mức đáp ứng miễn dịch các cá nhân nhiễm biến chủng Omicron mới với lịch sử đã tiêm chủng
Trang 3318
CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
2.1 Vật liệu nghiên cứu
2.1.1 Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng:
• Huyết thanh/ huyết tương của cá thể đã thực hiện tiêm chủng: 1 mũi, 1 liệu trình, tiêm tăng cường
• Huyết thanh/ huyết tương của cá thể đã nhiễm trùng SARS – CoV – 2
• Cá nhân tình nguyện tham gia khảo sát, đồng ý cung cấp thông tin cá nhân, thông tin tiêm chủng và nhiễm trùng SARS – CoV – 2 Đối tượng được định hướng theo từng giai đoạn thực hiện đề tài
Thời gian thực hiện đề tài dự kiến từ tháng 11/2021 đến tháng 11/2022
Số lượng mẫu thử thực hiện: Mẫu thử được thu nhận theo từng giai đoạn đề tài,
tổng số mẫu thử trong đề tài đạt 1017 Thông tin chi tiết mô tả trong bảng bên dưới Bảng 2.1 Thông tin đối tượng tham gia thử nghiệm phát hiện kháng thể trung hoà
Đối tượng mẫu Cỡ mẫu (N) Tuổi
Tiêm chủng 2 mũi cơ bản
Nam 127 42.1 ± 13.56
Nữ 203 40.71 ± 17.14
Tổng 330 41.25 ± 15.85
Tiêm chủng 3 mũi (mũi tăng cường)
Nam 147 45.1 ± 18.46
Nữ 192 45.89 ± 18.73
Tổng 339 45.55 ± 18.59
Đối tượng nhiễm SARS – CoV - 2
Nam 125 39.26 ± 13.70
Nữ 206 37.36 ± 13.83
Tổng 331 38.08 ± 13.79
Trang 3419
Đơn vị thực hiện: Mẫu thử được thu nhận trực tiếp tại NAM KHOA LAB hoặc
được thu ở các đơn vị y tế liên kết rồi chuyển về NAM KHOA LAB để tiến hành thử nghiệm miễn dịch
2.1.2 Hoá chất
2.1.2.1 Hố chất phát hiện kháng thể trung hồ
Sinh phẩm sử dụng từ nhà sản xuất ThermoFisher: Invitrogen SARS-CoV-2 Neutralizing Antibody ELISA Kit
Bảng 2.2 Thành phần Invitrogen SARS-CoV-2 Neutralizing Antibody ELISA Kit
Thành phần Cat No
BMS2326 SARS-CoV-2 Neutralizing Ab Control, lyophilized 2 vials SARS-CoV-2 Neutralizing Ab Coated Plate 1 plate SARS-CoV-2 Neutralizing Ab Biotin Conjugate
(100X), lyophilized
1 vial
Assay Buffer Concentrate (20X) 5 mL
Streptavidin-HRP Conjugate (100X) 0.150 mL
Wash Buffer Concentrate (20X) 50 mL
Stabilized Chromogen (Tetramethylbenzidine) 15 mL
Stop Solution 15 mL
Trang 3520
2.1.2.2 Hoá chất phát hiện kháng thể đặc hiệu protein S
Sinh phẩm sử dụng từ nhà sản xuất ThermoFisher: Invitrogen Human SARS-CoV-2 Spike (trimer) Ig Total ELISA Kit
Bảng 2.3 Thành phần Invitrogen Human SARS-CoV-2 Spike (trimer) Ig Total ELISA Kit
Thành phần Cat No
BMS2326 Human SARS-CoV-2 Ig total High Control, lyophilized 1 vial Human SARS-CoV-2 Ig total Calibrator, lyophilized 1 vial Human SARS-CoV-2 Ig total Low Control, lyophilized 1 vial Human SARS-CoV-2 Spike (trimer) Coated Plate 1 plate Human SARS-CoV-2 Ig total HRP Conjugate (100X) 0.120 mL
Assay Buffer (20X) 50 mL
Wash Buffer Concentrate (20X) 50 mL
Stabilized Chromogen (Tetramethylbenzidine) 15 mL
Stop Solution 15 mL
Plate Covers, adhesive 2
2.1.3 Thiết bị và dụng cụ
2.1.3.1 Thiết bị
Các thiết bị hỗ trợ việc nghiên cứu được thể hiện trong bảng bên dưới Bảng 2.4 Thông tin các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
THIẾT BỊ MODEL HÃNG QUỐC GIA
Tủ Clean Bench vô trùng cấp II -Shinsaeng
Trang 3621
THIẾT BỊ MODEL HÃNG QUỐC GIA
Thiết bị vortex SA8 Biby-Science Anh
Tủ lạnh sâu ESCO UUS– 668A - 1 ESCO Mỹ
Máy mini-spin DLAB D1008 DLAB Trung Quốc
Máy ly tâm-Hitachi CT15E Hitachi Nhật
Máy lắc ngang
IKA TTS 3 digital Yellow Line
TTS3 IKA WORKS Mỹ
Microplate Washer 888 ThermoFisher
SCIENTIFIC
Phần Lan
Microplate reader 357 ThermoFisher
SCIENTIFIC
Phần Lan
2.1.3.2 Dụng cụ
• Pipette các thể tích: 0.5 – 10 µl, 2 – 20 µl, 20 – 200 µl, 100 – 1000 µl • Microplate
• Đầu tip vô trùng cho các mức thể tích pipette • Ống fancol: 50 ml
Trang 3722
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Sơ đồ quy trình thực hiện
2.2.1.1 Sơ đồ
Bổ sung dung dịch STOP kết thúc quá trình hiện màu
Thống kê kết quả nghiên cứu
Đọc OD ở bước sóng 450 nm Đọc OD ở bước sóng 450 nm
Phân tích kết quả Phân tích kết quả
Chuẩn bị trước thử nghiệm Chuẩn bị trước thử nghiệm
Mẫu
Xử lý mẫu
Thử nghiệm định lượng kháng thể đặc hiệu protein S Thử nghiệm kháng thể trung hoà
Lai kháng thể Lai kháng thể
Lai với cộng hợp Biotin Lai với cộng hợp HRP
Lai với cộng hợp Streptavidine - HRP
Hiện màu bằng cơ chất Hiện màu bằng cơ chất
Bổ sung dung dịch STOP kết thúc quá trình hiện màu
Trang 3823
2.2.1.2 Thuyết minh quy trình
• Mẫu
Mẫu thử là huyết tương tách từ máu được kháng đông bằng EDTA (sử dụng tube lấy máu vaccutainer của BD có kháng đơng EDTA) lấy từ các đối tượng nghiên cứu
• Xử lý mẫu
Đối với mẫu thử ban đầu là máu toàn phần thu từ cá nhân tham gia nghiên cứu, tube kháng đông EDTA được ly tâm trong 15’ ở 2500 rpm để phân tách hồng cầu và huyết tương Hút chuyển phần huyết tương sang tube vô trùng low-binding Các mẫu huyết tương được tách ngay sau khi lấy máu rồi giữ ở -40oC cho đến khi thực hiện xét nghiệm
• Quy trình thử nghiệm kháng thể trung hoà
Nguyên tắc: SAR – CoV – 2 Neutralizing Antibody ELISA kit là một phản ứng
ELISA cạnh tranh được thiết kế để phát hiện mức độ (level) của kháng thể trung hoà SARS – CoV – 2 trong huyết thanh hoặc huyết tương Đĩa nhựa 96 giếng được phủ bởi kháng nguyên SARS – CoV – 2 Receptor Binding Domain (RBD), mẫu thử mang kháng thể trung hoà sẽ cạnh tranh với lượng ACE2 được gắn biotin Bất kỳ ACE2 nào liên kết với RBD sẽ cho xuất hiện tín hiệu Tín hiệu này sau đó được quy đổi ngược về tỷ trọng phần trăm của kháng thể trung hoà
Chuẩn bị trước thử nghiệm
Chuẩn bị Wash Buffer 1X: Pha loãng 25 ml dung dịch Wash Buffer Concentrate
(20X) với 475 ml nước vô trùng hoặc nước khử ion Dung dịch Wash Buffer 1X được lưu giữ trong tủ lạnh và sử dụng trong 30 ngày
Chuẩn bị Assay Buffer 1X: Pha loãng 5 ml dung dịch Assay Buffer (20X) với 95
Trang 3924
Chuẩn bị mẫu: Mẫu thử huyết thanh/ huyết tương được pha loãng 1:50 với Assay
Buffer 1X (ví dụ, 5 µl mẫu + 245 µl Assau Buffer 1X)
Hoàn nguyên chứng chuẩn: Neutralizing Ab Control được dung làm chuẩn dương
của phản ưng Hoàn nguyên chứng chuẩn đông khô bằng Assay Buffer 1X Vortex nhẹ và ủ khoảng 10 phút, sử dụng chứng chuẩn trong vịng 15 phút sau khi hồn ngun
Chuẩn bị cộng hợp Biotin 1X: Cộng hợp được hoàn nguyên 15 phút trước khi sử
dụng Hoàn nguyên cộng hợp Biotin (100X) với Assay Buffer 1X Pha loãng 0.12 ml dung dịch cộng hợp 100X với 11.88 ml dung dịch Assay buffer 1X Trộn đều
Chuẩn bị cộng hợp Streptavidin – HRP: Cộng hợp Streptavidin – HRP được sử
dụng trong vòng 15 phút sau khi pha loãng Trộn 0.12 ml cộng hợp Streptavidin – HRP 100 X với 11.88 ml dung dịch Assay Buffer 1X Trộn đều
Tiến trình thử nghiệm
1 Gắn kết phức hợp kháng nguyên – kháng thể
• Rửa giếng nhựa 2 lần với Wash Buffer 1X
• Bổ sung 100 µl chứng chuẩn và các mẫu đã pha loãng ở bước trên vào các giếng tương ứng để lai
ã B sung 100 àl dung dch Assay Buffer vào một giếng cố định như là chứng âm
• Phủ đĩa nhựa với màng seal và ủ trong 30 phút ở nhiệt độ phòng trên máy lắc
• Hút bỏ dung dịch đã ủ lai và rửa lại 3 lần với Wash Buffer 1X Ở mỗi bước rửa, giữ yên trong 10 – 15 giây trước khi hút bỏ
2 Bổ sung cộng hợp Biotin
• Bổ sung 100 µl dung dịch cộng hợp Biotin 1X vào các giếng
Trang 4025
• Hút bỏ dung dịch đã ủ lai và rửa lại 3 lần với Wash Buffer 1X Ở mỗi bước rửa, giữ yên trong 10 – 15 giây trước khi hút bỏ
3 Bổ sung cộng hợp Streptavidin – HRP 1X
• Bổ sung 100 µl dung dịch cộng hợp Streptavidin – HRP 1X vào các giếng
• Phủ đĩa bởi seal và tiếp tục ủ trong 15 phút ở nhiệt độ phòng trên máy lắc
• Hút bỏ dung dịch đã ủ lai và rửa lại 3 lần với Wash Buffer 1X Ở mỗi bước rửa, giữ yên trong 10 – 15 giây trước khi hút bỏ
4 Bổ sung dung dịch cơ chất
• Bổ sung 100 µl dung dịch cơ chất (Substrate) vào các giếng Dung dịch sẽ chuyển sang màu xanh lam
• Ủ trong 15 phút ở nhiệt độ phòng
Lưu ý: TMB (Substrate) khơng thể dính vào các màng bọc nhơm hay kim loại (nên sử dụng màng seal nhựa 5 Bổ sung dung dịch
kết thúc phản ứng
• Bổ sung 100 µl dung dịch STOP vào các giếng để kết thúc quá trình hiên màu Gõ nhẹ vào bên hông đĩa nhựa để phản ứng diễn ra đồng đều Dung dịch sẽ chuyển từ màu lanh sang vàng
Đọc OD và phân tích kết quả
o Đọc mức độ hấp thu bằng máy đo quang phổ ở bước sóng 450 nm như là bước sóng cơ bản (bước sóng 620 nm có thể được sử dụng như bước sóng tham chiếu) Đọc đĩa ngay sau khi bổ sung STOP
o Tỷ trọng % kháng thể trung hồ cho mẫu được tính theo cơng thức