Khảo sát sự lưu hành virus cúm AH5n1 trên địa bàn huyện lệ thủy, tỉnh quảng bình và đánh giá đáp ứng miễn dịch trên vịt sau tiêm vaccine qb7412

i LỜI CAM ĐOAN Đề tài cơng trình nghiên cứu riêng tơi, có phần nằm khn khổ đề tài “Điều tra dịch tễ học, định type virus Cúm gia cầm độc lực cao địa bàn tỉnh Quảng Bình” Sở Khoa học Cơng nghệ tỉnh Quảng Bình năm 2017 – 2018 PGS.TS Nguyễn Xuân Hòa làm chủ nhiệm Các số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực, phối hợp với Viện Thú y Quốc gia thực thử nghiệm vaccine QB7412 chưa công bố cơng trình khoa học Tơi xin cam đoan, thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Thừa Thiên Huế, tháng 02 năm 2018 Tác giả Cao Thị Hải ii Lời cám ơn Trong suốt trình thực đề tài hồn thành luận văn, tơi ln nhận giúp đỡ nhiều tổ chức cá nhân Nhân dịp tơi xin cảm ơn: Ban Giám hiệu, Phịng Đào tạo sau Đại học, Khoa Chăn nuôi Thú y, Trường Đại học Nông lâm Huế tạo điều kiện cho tơi theo học chương trình đào tạo trình độ Thạc sỹ trường Tập thể Lãnh đạo cán Chi cục Chăn nuôi Thú y Quảng Bình, Chi cục Thú y vùng III, Phân viện Thú y Miền Trung, Đề tài Khoa học Công nghệ tỉnh Quảng Bình năm 2017 - 2018 chi trả phần kinh phí nghiên cứu, tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tơi hồn thành đề tài nghiên cứu Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến Thầy giáo, TS Trần Quang Vui, Khoa Chăn nuôi Thú y, Trường Đại học Nông lâm Huế người thầy hướng dẫn khoa học, trực tiếp giúp đỡ tơi q trình thực đề tài hồn thành luận văn Tơi xin gửi lời cảm ơn đến đồng nghiệp công tác Chi cục Chăn ni Thú y Quảng Bình, Viện Thú y Quốc gia, anh chị em Trạm Chăn nuôi Thú y huyện Lệ Thủy, Cơng ty TNHH SX&TM Hồng Hải, Nghiên cứu sinh Phạm Hồng Kỳ cung cấp tài liệu, kinh phí xét nghiệm mẫu, nơi thử nghiệm vaccine để tơi thực nghiên cứu Đặc biệt, gia đình, bạn bè đồng nghiệp bên cạnh, động viên, giúp đỡ tơi q trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Mặc dù thân nổ lực, cố gắng, song kiến thức thời gian hạn chế nên không tránh khỏi tồn tại, thiếu sót Vì vậy, kính mong tiếp tục nhận quan tâm, góp ý từ q thầy giáo, bạn bè, đồng nghiệp cho nội dung nghiên cứu Xin chân thành cảm ơn! Thừa Thiên Huế, tháng 02 năm 2018 Tác giả Cao Thị Hải iii TÓM TẮT LUẬN VĂN Để có sở khoa học nhằm mục đích đưa biện pháp phịng bệnh phù hợp, tiến hành thực đề tài: “Khảo sát lưu hành virus cúm A/H5N1 huyện Lệ Thủy, tỉnh Quảng Bình đánh giá đáp ứng miễn dịch vịt sau tiêm vaccine QB7412” Được thực huyện Lệ Thủy tháng nghiên cứu (từ tháng 8/2017 đến tháng 01/2018), để xác định yếu tố nguy làm phát sinh lây lan dịch cúm gia cầm, sử dụng 116 phiếu điều tra để điều tra (36 hộ có gia cầm mắc bệnh 80 hộ khơng có gia cầm mắc bệnh xung quanh ổ dịch), yếu tố nguy gồm: nguồn gốc giống không rõ ràng (OR = 2,46); gần chợ buôn bán gia cầm (OR = 1,19); không tiêm vaccine phòng bệnh cho đàn gia cầm (OR = 2,45); sử dụng nguồn nước ao hồ, sông suối chăn nuôi (OR = 2,56); chăn nuôi gần đường giao thông (OR = 2,83) Với mục tiêu xác định lưu hành virus cúm A/H5N1 huyện Lệ Thủy, tiến hành thu thập mẫu swab chợ, trang trại chăn nuôi gia cầm với tổng số mẫu 24 mẫu gộp tương đương với 240 mẫu swab đơn (gộp nơi lấy mẫu) sử dụng phương pháp Real time RT-PCR phát có mặt virus cúm A/H5N1 theo thời gian địa điểm nghiên cứu, kết 24 mẫu có mẫu dương tính với virus cúm A (gen M) với tỷ lệ 29,17%, tiếp tục xét nghiệm số mẫu dương tính gen M để xác định subtype H5, N1 phát thấy có mẫu dương tính với H5 (12,5%) mẫu dương tính với N1 (8,33%) tháng có tỷ lệ dương tính cao với gen M tháng 01/2018 (75%), tiếp đến tháng 12/2017 (50%) Như có lưu hành virus cúm A/H5N1 địa bàn huyện Lệ Thủy 8,33%; Kết giám sát lưu hành virus cúm gia cầm chợ trang trại chăn nuôi với tỷ lệ lưu hành virus cúm A/H5N1 14,28%, tỷ lệ lệ dương tính chợ 16,67%, trang trại 0% Sử dụng phương pháp ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI) để đánh giá khả đáp ứng miễn dịch vịt sau tiêm vaccine QB7412 từ 30 mẫu huyết vịt tiêm phòng lần 30 mẫu huyết tiêm phịng lần trang trại chăn ni vịt thử nghiệm Kết đánh giá đáp ứng miễn dịch vịt sau tiêm phòng vaccine QB7412 đạt tỷ lệ mẫu huyết bảo hộ sau tiêm phòng lần 53,33% (16/30 mẫu) mẫu huyết bảo hộ sau tiêm phòng lần 90% (27/30 mẫu) Trong đối chứng đàn vịt khơng tiêm vaccine có tỷ lệ bảo hộ tự nhiên 0% Như vậy, vaccine QB7412 sử dụng nghiên cứu coi hiệu iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii TÓM TẮT LUẬN VĂN iii MỤC LỤC iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH MỤC CÁC BẢNG viii DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, HÌNH ix MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu đề tài Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn 3.1 Ý nghĩa khoa học 3.2 Ý nghĩa thực tiễn Điểm đề tài Chương 1.TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Lịch sử bệnh Cúm gia cầm 1.1.1 Giới thiệu bệnh Cúm gia cầm 1.1.2 Lịch sử bệnh cúm gia cầm giới 1.1.3 Bệnh Cúm gia cầm Việt Nam 1.1.4 Tình hình dịch bệnh địa bàn tỉnh Quảng Bình 10 1.2 Virus học bệnh Cúm gia cầm 12 1.2.1 Cấu trúc chung virus Cúm gia cầm 12 1.2.2 Cấu trúc hệ gen virus cúm A 13 1.2.3 Protein 16 1.2.4 Kháng nguyên virus 19 1.2.5 Độc lực virus 23 1.2.6 Cơ chế xâm nhập, nhân lên gây bệnh virus 25 1.2.7 Sức đề kháng virus 26 v 1.2.8 Nuôi cấy lưu giữ virus 26 1.2.9 Truyền nhiễm học 26 1.2.10 Triệu chứng, bệnh tích 29 1.3 Các phương pháp chẩn đoán 32 1.3.1 Dựa vào dịch tễ 32 1.3.2 Dựa vào triệu chứng, bệnh tích 32 1.3.3 Chẩn đoán phịng thí nghiệm 32 1.3.4 Phân lập định danh virus 35 1.4 Phòng bệnh 35 1.4.1 Phòng bệnh vệ sinh 35 1.4.2 Phòng bệnh vaccine 37 Chương 2.NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40 2.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 40 2.2 Nội dung nghiên cứu 40 2.3 Phương pháp nghiên cứu 40 2.3.1 Xác định lưu hành virus cúm A phương pháp Realtime RT-PCR 40 2.3.2 Phương pháp điều tra dịch tễ học 45 2.3.3 Đánh giá đáp ứng miễn dịch vịt sau tiêm phòng vaccine QB7412 46 2.3.4 Phương pháp xử lý số liệu 48 Chương 3.KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 49 3.1 Quy mô chăn nuôi địa bàn huyện Lệ Thủy, tỉnh Quảng Bình 49 3.2 Hiện trạng buôn bán gia cầm chợ thực lấy mẫu giám sát 51 3.3 Giám sát lưu hành virus Cúm gia cầm huyện Lệ Thủy 51 3.4 Kết xác định số yếu tố nguy làm phát sinh lây lan dịch cúm gia cầm địa bàn huyện Lệ Thủy 55 3.4.1 Nguồn cung cấp giống không rõ ràng 55 3.4.2 Cơ sở chăn nuôi gần chợ buôn bán gia cầm 56 3.4.3 Hộ chăn nuôi không tiêm vaccine phòng bệnh cúm A/H5N1 cho đàn gia cầm 57 3.4.4 Nguồn nước sử dụng 58 vi 3.4.5 Gần đường giao thơng 59 3.6 Đánh giá khả đáp ứng miễn dịch vịt sau tiêm vaccine QB7412 59 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 62 KẾT LUẬN 62 ĐỀ NGHỊ 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 vii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT CDC: Center for Disease Control DNA: Deoxyribonucleic acid ELISA: Emzyme Linked Immunosozbent Assay FAO: Food and Agriculture Organization of the United Nations HA: Haemagglutination test HI: Haemagglutination inhibitory test HPAI: Highly Pathogenic Avian Influenza LPAI: Low Pathogenic Avian Influenza OIE: Office international des epizooties RNA : Ribonucleic acid RT-PCR: Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction WHO: World Health Organization OR Odd ratio Ct Cycle of threshold viii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Tình hình Cúm gia cầm số nước giới từ năm 2003 đến năm 2005 Bảng 1.2 Tổng hợp tình hình Cúm gia cầm xảy nước từ năm 2007 đến năm 2017 Bảng 1.3: Tình hình dịch cúm gia cầm từ năm 2014 – 2017 10 Bảng 2.2 Thành phần master mix 44 Bảng 2.3 Chu trình luân nhiệt phản ứng RT-PCR 45 Bảng 2.4 Bảng tương liên x 46 Bảng 2.5 Lịch tiêm phòng lấy mẫu huyết 47 Bảng 3.1 Diễn biến quy mô đàn gia cầm nuôi địa bàn huyện Lệ Thủy giai đoạn 2013 – 2017 50 Bảng 3.2 Kết giám sát virus cúm gia cầm theo thời gian 52 Bảng 3.3 Kết xét nghiệm mẫu swab tháng chợ gia cầm sống trang trại chăn nuôi 53 Bảng 3.4 Kết phân tích yếu tố nguy nguồn gốc giống không rõ ràng 56 Bảng 3.5 Kết phân tích yếu tố nguy gần chợ bn bán gia cầm 57 Bảng 3.6 Kết phân tích yếu tố nguy khơng tiêm vaccine phịng bệnh cúm gia cầm 58 Bảng 3.7 Kết phân tích yếu tố nguy nguồn nước sử dụng 58 Bảng 3.8 Kết phân tích yếu tố nguy gần đường quốc lộ 59 Bảng 3.9 Đáp ứng miễn dịch vịt sau tiêm vaccine QB7412 60 ix DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc virus cúm A 12 Hình 1.2 Cấu trúc virus cúm A/H5N1 13 Hình 1.3 Cấu trúc hệ gen virus cúm A 15 Hình 1.4 Sơ đồ minh họa đột biến điểm tượng “ kháng nguyên” (antigenic drift) (A) đột biến tái tổ hợp tượng “trộn kháng nguyên” (antigenic shift) virus cúm A (B) 23 Hình.1.5 Quá trình xâm nhập nhân lên virus tế bào vật chủ 25 Hình 1.6 Bệnh tích đại thể gia cầm mắc bệnh cúm A/H5N1 31 Hình 1.7 Cơ chế hoạt động Taqman probe 34 Hình 3.1 Diễn biến tổng đàn gia cầm nuôi huyện Lệ Thủy 2013-2017 50 Hình 3.2 Biến động lưu hành virus cúm gia cầm tháng nghiên cứu 53 Hình 3.3 Tỷ lệ lưu hành virus cúm gia cầm chợ buôn bán gia cầm sống tháng nghiên cứu 54 Hình 3.4: Tỷ lệ đáp ứng miễn dịch vaccine QB 7412 60 MỞ ĐẦU ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, Việt Nam nước nông nghiệp với khoảng 70% dân số nông dân gắn liền với lĩnh vực sản xuất nông nghiệp trồng trọt, chăn nuôi Trong năm gần đây, tiến kỹ thuật giống, thức ăn, quản lý, thú y với biện pháp khuyến khích chăn ni nhà nước, ngành chăn ni nói chung chăn ni gia cầm nói riêng ngày phát triển dần chiếm vị trí quan trọng nông nghiệp nước ta Sự phát triển mang lại hiệu kinh tế, tạo nhiều hội việc làm, nâng cao đời sống vật chất tinh thần cho người dân, góp phần xóa đói giảm nghèo tạo hội vươn lên làm giàu cho nhiều hộ gia đình, đồng thời góp phần vào kinh tế quốc gia Tuy nhiên, bên cạnh phát triển cịn nhiều khó khăn, thách thức cho ngành chăn ni gia tăng diễn biến ngày phức tạp loại dịch bệnh, phải kể đến bệnh cúm gia cầm virus cúm A/H5N1 độc lực cao thuộc họ Orthomyxoviridae gây Đây bệnh truyền nhiễm nguy hiểm có tốc độ lây lan nhanh, tỷ lệ chết cao đàn gia cầm nhiễm bệnh đặc biệt nguy hiểm lây lan gây chết người Bệnh cúm gia cầm xảy lần Việt Nam vào cuối năm 2003, ghi nhận virus cúm gia cầm độc lực cao (HPAI) H5N1 Kể từ dịch cúm gia cầm H5N1 liên tục xảy nhiên quy mô dịch có thay đổi theo chiều hướng nhỏ lẻ trở thành dịch địa phương Việt Nam Tại Quảng Bình, năm 2012, dịch cúm gia cầm bùng phát 14 xã địa bàn 04 huyện Lệ Thuỷ, Quảng Ninh, Bố Trạch Quảng Trạch với tổng số gia cầm ốm chết tiêu huỷ 52.529 con, gồm: 1.369 gà; 50.198 vịt; 962 ngan, ngỗng Viện Thú y quốc gia phân lập chủng A/duck/Vietnam/QB1207/2012, mã số Genbank: KF182741 từ mẫu não vịt mắc bệnh ni Quảng Bình Từ chủng virus Viện Thú y quốc gia sản xuất vaccine vô hoạt vaccine nhũ dầu cho đáp ứng miễn dịch tốt gà vịt, cần có nghiên cứu sâu khả tạo miễn dịch không mang trùng thủy cầm điều kiện thực địa (Nguyễn Thị Hồng Thắm cs, 2014) Hiện Viện Thú y thử nghiệm vaccine QB7412 số tỉnh có Quảng Bình, nghiên cứu chế tạo vaccine cúm A/H5N1 vô hoạt tương đồng chủng phân lập Viết Nam, chủng đại diện cho clade 2.3.2.1c lưu hành phổ biến Nguồn dịch cúm A/H5N1 khó kiểm sốt, vịt, chúng nhiễm virus mà khơng có biểu lâm sàng thải lượng lớn virus vào môi trường lây truyền cho gia cầm khỏe người 55 sống địa bàn huyện Lệ Thủy, tỉnh Quảng Bình 29,17% 3.4 KÊT QUẢ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ YẾU TỐ NGUY CƠ LÀM PHÁT SINH VÀ LÂY LAN DịCH CÚM GIA CẦM TRÊN ĐỊA BÀN HUYỆN LỆ THỦY Qua thực tế điều tra thực địa, thu thập thông tin từ người chăn nuôi gia cầm; tổng hợp thông tin từ Chi cục Chăn nuôi Thú y Quảng Bình, Trạm Chăn ni Thú y huyện Lệ Thủy, lựa chọn 116 hộ chăn ni (36 hộ có gia cầm mắc bệnh cúm 80 hộ khơng có gia cầm mắc bệnh xã lân cận) để tiến hành nghiên cứu Bằng phương pháp thống kê sinh học phân tích dịch tễ học, sau phân tích 31 yếu tố, chúng tơi xác định 05 yếu tố nguy có ý nghĩa thống kê (P < 0,05) làm phát sinh lây lan dịch cúm gia cầm địa bàn huyện Lệ Thủy, cụ thể: 3.4.1 Nguồn cung cấp giống không rõ ràng Đối với ngành chăn nuôi, công tác chọn giống để sản xuất đóng vai trị quan trọng, yếu tố định phần lớn thành cơng cho người chăn ni Chính vậy, chọn giống tốt, nguồn gốc rõ ràng, bệnh chăn ni có hiệu kinh tế cao ngược lại, mua giống không rõ nguồn gốc, mua trôi thị trường chưa qua kiểm dịch yếu tố rủi ro lớn Trong nghiên cứu này, quy định gia cầm có nguồn gốc rõ ràng đàn gia cầm xuất phát từ đàn gia cầm giống tiêm phòng vaccine cúm gia cầm trại ấp địa phương (cùng xã) đàn gia cầm mua có nguồn gốc rõ ràng (có chứng nhận kiểm dịch quan thú y) Kết điều tra cho thấy, tổng số 116 hộ điều tra có 36 hộ chăn ni mua xã khác huyện mua chợ từ lái bn, khơng rõ nguồn gốc, khơng có giấy tờ kiểm dịch quan thú y Kết điều tra thể bảng 3.4 56 Bảng 3.4 Kết phân tích yếu tố nguy nguồn gốc giống không rõ ràng Yếu tố nguy Bị bệnh Không bị bệnh Tổng Nguồn gốc không rõ ràng 15 18 33 Nguồn gốc rõ ràng 21 62 83 36 80 116 Tổng Kết P-value 0,034 Df OR 2,46 Kết phân tích nguy bảng 3.4 cho thấy: Mua gia cầm từ đại lý bán cám, khơng có nguồn gốc rõ ràng có nguy mắc cúm gia cầm cao gấp 2,46 lần so với gia cầm giống người dân sản xuất chỗ mua từ nơi khác rõ nguồn gốc sai khác có ý nghĩa mặt thống kê với P < 0,05 3.4.2 Cơ sở chăn nuôi gần chợ buôn bán gia cầm Chợ điểm giao thương buôn bán nên số lượng người đến đơng, có hộ có chăn nuôi gia cầm Khi đàn gia cầm họ xảy dịch cúm gia cầm, mầm bệnh theo họ đến chợ Ở chợ có bn bán gia cầm, sản phẩm gia cầm gia cầm nơi chúng qua có nguy tiếp xúc với nguồn bệnh cao, dễ mắc bệnh Vì chợ bn bán gia cầm, sản phẩm gia cầm yếu tố làm lây lan phát sinh cúm gia cầm Kết điều tra thể bảng 3.5 57 Bảng 3.5 Kết phân tích yếu tố nguy gần chợ buôn bán gia cầm Yếu tố nguy Bị bệnh Không bị bệnh Tổng Gần chợ buôn bán gia cầm (1km) 21 50 71 36 80 116 Tổng Kết 30 45 P-value 0,021 Df OR 1,19 Kết phân tích nguy bảng 3.5 cho thấy: Chăn nuôi gia cầm gần chợ buôn bán gia cầm (