Nghiên cứu trích ly flavonoid trong lá chè xanh camellia sinensis l o kuntze

LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đƣợc luận văn tốt nghiệp cố gắng nỗ lực thân em nhận đƣợc nhiều giúp đỡ từ thầy giáo, gia đình bạn bè Em chân thành cảm ơn ban lãnh đạo nhà trƣờng, thầy cô giáo Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp cho phép tạo điều kiện thuận lợi để em đƣợc thực khóa luận tốt nghiệp Em xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới ThS Nguyễn Thị Thu Hằng – phịng Cơng Nghệ Vi Sinh - Hóa Sinh, Viện Cơng nghệ sinh học, Trƣờng Đại học Lâm Nghiệp, ngƣời thầy tận tình trực tiếp hƣớng dẫn giúp đỡ em hoàn thành luận văn tốt nghiệp Trong trình thực luận văn tốt nghiệp, em thực tập làm việc phịng thí nghiệm Cơng nghệ Vi sinh Hóa sinh, viện Công nghệ sinh học, trƣờng Đại học Lâm Nghiệp Hà Nội Em xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới thầy cô môn thƣờng xuyên giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi thời gian em thực luận văn Cuối em xin chân thành cảm ơn gia đình bạn bè thƣờng xuyên động viên, giúp đỡ chỗ dựa vững cho em trình học tập, hoàn thành luận văn Em xin chân thành cảm ơn! Xuân Mai, ngày 14 tháng 05 năm 2018 Sinh viên thực Nguyễn Thị Hằng i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vi MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chè 1.1.1 Tên khoa học, nguồn gốc, phân loại 1.1.2 Đặc điểm hình thái 1.1.3 Thành phần hóa học chè 1.1.4 Tác dụng sinh học chè 1.2 Tổng quan flavonoid 1.2.1 Khái niệm 1.2.2 Phân loại 1.2.3 Tính chất lý hóa 12 1.2.4 Tác dụng sinh học flavonoid 13 1.3 Tình hình nghiên cứu, ứng dụng sản xuất chất flavonoid 15 1.3.1 Tình hình nghiên cứu, ứng dụng sản xuất giới 15 1.3.2 Tình hình nghiên cứu, ứng dụng sản xuất nƣớc 16 CHƢƠNG 2: MỤC TIÊU, NỘI DUNG, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 18 2.2 Nội dung nghiên cứu 18 2.3 Vật liệu nghiên cứu 18 2.4 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất 19 2.4.1 Thiết bị, dụng cụ 19 2.4.2 Hóa chất 19 ii 2.5 Phƣơng pháp nghiên cứu 20 2.5.1 Xử lý mẫu 20 2.5.2 Nghiên cứu chiết xuất flavonoid theo phƣơng pháp B.C.Talli 20 2.5.3 Định tính flavonoid phản ứng hóa học đặc trƣng 23 2.5.4 Định tính flavonoid sắc ký lớp mỏng 23 2.5.5 Xác định hoạt tính chống oxy hóa flavonoid lên hoạt độ peroxydaza máu 24 2.5.6 Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật 25 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 3.1 Kết xác định ảnh hƣởng số yếu tố cơng nghệ đến hiệu trích ly flavonoid theo phƣơng pháp ngâm lạnh 26 3.1.1 Ảnh hƣởng nồng độ ethanol 26 3.1.2 Ảnh hƣởng tỷ lệ nguyên liệu/dung môi ethanol 27 28 3.1.3 Ảnh hƣởng thời gian chiết ethanol 29 3.2 Định tính flavonoid phản ứng hóa học đặc trƣng 30 3.3 Định tính flavonoid sắc ký lớp mỏng 31 3.4 Xác định khả chống oxy hóa dịch flavonoid chiết từ chè 33 3.5 Khả kháng khuẩn dịch flavonoid chiết từ bột chè 34 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36 Kết luận 36 Kiến nghị 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO iii CHỮ VIẾT TẮT TLKTĐ: trọng lƣợng khô tuyệt đối iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Ảnh hƣởng nồng độ ethanol đến hiệu suất trích ly flavonoid 26 Bảng 3.2 Ảnh hƣởng tỷ lệ nguyên liệu/dung môi ethanol đến hiệu suất trích ly flavonoid 28 Bảng 3.3 Ảnh hƣởng thời gian chiết ethanol đến hiệu suất trích ly flavonoid 29 Bảng 3.4 Kết định tính flavonoid chiết xuất từ chè 30 v DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Lá búp chè Hình 1.2 Cấu trúc flavonoid Hình 1.3 Cấu trúc anthocyanidin Hình 1.4 Cấu trúc flavan 3-ol Hình 1.5 Cấu trúc flavan 3,4-diol Hình 1.6 Cấu trúc naringin hesperidin Hình 1.7 Cấu trúc 3- Hydroxyflavanon 10 Hình 1.8 Cấu trúc flavon 10 Hình 1.9 Cấu trúc quercetin, kaempferol myricetin 10 Hình 1.10 Cấu trúc chalcon 11 Hình 1.11 Cấu trúc dihydrochalcon 11 Hình 1.12 Cấu trúc auron 11 Hình 2.1 Bột chè khô 20 Hình 2.2 Quy trình chiết xuất flavonoit tồn phần (theo B.C.Talli) 21 Hình 3.1 Biểu đồ ảnh hƣởng nồng độ ethanol đến hiệu suất trích ly flavonoid 27 Hình 3.2 Biểu đồ ảnh hƣởng tỷ lệ nguyên liệu/ dung mơi ethanol đến hiệu suất trích ly flavonoid 28 Hình 3.3 Biểu đồ ảnh hƣởng thời gian chiết ethanol đến hiệu suất trích ly flavonoid 30 Hình 3.4 Kết định tính flavonoid chiết xuất từ chè 31 Hình 3.5 Kết chạy sắc ký mỏng flavonoid quan sát dƣới ánh sáng thƣờng ánh sáng tử ngoại 32 Hình 3.6 Ảnh hƣởng nồng độ flavonoid chiết xuất từ chè xanh lên % ức chế hoạt động enzyme peroxydaza 34 Hình 3.7 Một số hình ảnh khả kháng vi sinh vật dịch flavonoid chiết xuất từ chè xanh 35 vi MỞ ĐẦU Xã hội ngày phát triển, đời sống vật chất ngƣời ngày đƣợc nâng cao, nhƣng kèm theo hệ lụy sức khỏe ngày tăng áp lực sống ô nhiễm môi trƣờng tự nhiên xã hội Do vậy, nhu cầu sử dụng sản phẩm giúp trẻ hóa thể, nâng cao sức đề kháng, phòng ngừa chữa trị bệnh tật ngày đƣợc trọng, đặc biệt chất chống oxy hóa Với tác dụng sinh hóa phong phú, tồn diện, flavonoid ngày đƣợc ý đƣợc ứng dụng nhiều việc sản xuất sản phẩm dƣợc phẩm thực phẩm chức giàu flavonoid giúp chống oxy hóa tăng cƣờng sức khỏe Từ đó, việc nghiên cứu khai thác hợp chất flavonoid thu hút nhiều quan tâm Cây chè (hay trà) có tên khoa học Camellia sinensis (L.) O Kuntze, từ lâu đổ uống quen thuộc ngƣời đƣợc sử dụng rộng rãi nhiều quốc gia toàn giới Là loại đồ uống giàu chất chống oxy hóa, chè có tác dụng chống lão hóa giúp phịng chống nhiều bệnh tật bao gồm bệnh tim mạch, hen suyễn, gan, bệnh miệng đặc biệt có tác dụng phòng tránh, giảm nguy mắc bệnh ung thƣ Với tác dụng chữa bệnh giá trị, từ lâu chè đối tƣợng nghiên cứu nhà khoa học thuộc lĩnh vực hoá sinh - y dƣợc toàn giới Ở chè hợp chất polyphenol đƣợc quan tâm đặc biệt, có vai trị đáng kể q trình chuyển hố bản, điều hoà sinh trƣởng, phát triển bảo vệ thực vật Trong số polyphenol thiên nhiên, hoạt chất flavonoid có ý nghĩa thực tiễn lớn chúng mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe ngƣời nhƣ hoạt tính chống oxi hóa, ngăn chặn điều trị số bệnh tim mạch Việt Nam quốc gia có diện tích trồng chè lớn, nhƣng tập trung khai thác lĩnh vực thực phẩm đồ uống, việc nghiên cứu hóa học tác dụng sinh dƣợc học hợp chất flavonoid khai thác từ chè với mục đích phục vụ y dƣợc học hƣớng nghiên cứu cần đẩy mạnh Tận dụng nguồn nguyên liệu dồi sẵn có, với tầm quan trọng hợp chất thiên nhiên đặc biệt flavonoid với mong muốn đóng góp thêm hiểu biết để nâng cao giá trị chè Việt Nam, em thực đề tài ―Nghiên cứu trích ly Flavonoid chè xanh Camellia sinensis (L.) O Kuntze” CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chè 1.1.1 Tên khoa học, nguồn gốc, phân loại Cây chè hay cịn gọi trà, có tên khoa học Camellia sinensis (L.) O Kuntze đƣợc xếp hệ thống phân loại thực vật nhƣ sau: Giới: Plantae Ngành: Magnoliopsida Bộ: Ericales Họ: Theaceae Chi: Camellia Loài: C sinensis Hình 1.1 Lá búp chè Chè có nguồn gốc từ vùng Đơng Nam Trung Quốc, giáp phía Bắc Việt Nam, với cách trồng theo phƣơng pháp cổ truyền từ kỷ 19 chè phát triển rộng khắp trở thành mặt hàng nông sản quan trọng Hiện với phát triển khoa học lai tạo nhiều loại giống chè khác nhau, theo thống kê có khoảng 380 giống chè Tuy nhiên, 380 giống chè chủ yếu có nguồn gốc từ loại giống là: Camellia sinensis var bohea, Camellia sinensis var macrophilla, Camellia sinensis var shan Camellia sinensis Assamica [4, 12] 1.1.2 Đặc điểm hình thái Cây chè loại dễ cọc ăn sâu vào lòng đất, tùy theo chiều cao, độ lớn nhỏ thân cành mà chia thành loại: bụi, gỗ nhỏ gỗ lớn Cây bụi: khơng có thân rõ rệt, mọc tự nhiên có độ cao 2-3m, tán nhỏ >1m, gồm nhiều cành nhỏ gần nhau, phân cành thấp, gần sát cổ rễ, có từ mặt đất [7] Cây gỗ nhỏ: thân tƣơng đối rõ rệt, để mọc tự nhiên cao 6-10m, tán to 2-3m, gồm nhiều cành to nhỏ khác rõ, độ phân cành cao cổ rễ xa mặt đất, dƣới 1m [7] Cây gỗ lớn: thân to lớn, mọc tự nhiên cao tới 15-20m, tán to rộng 5-6m, gồm cành to lớn, độ phân cành xa mặt đất hàng mét, cành mọc song song vuông góc vói thân cây, thân cành mọc có màu xanh phớt hồng, già chuyển sang màu nâu tro sám [1, 4, 7] Lá chè mọc cành khơng đối xứng, cịn non có màu xanh sáng mềm, phía dƣới có nhiều lơng tơ màu trắng (tuyết chè) Khi già có màu xanh thẫm, tuyết có từ 6-15 gân Lá có hình dạng kích cỡ khác tùy thuộc vào giống, điều kiện canh tác, khí hậu Hoa chè lồi hoa lƣỡng tính mọc thành chùm từ kẽ nách lá, hoa có dạng hình cầu, màu trắng hồng [7] Quả có dạng hình cầu, cịn non có màu xanh, chín có màu nâu xanh vàng Mỗi có 3-4 ngăn, ngăn có 1-2 hạt [7] Chè cho suất cao vào mùa mƣa từ tháng 5-11, sau 10-15 ngày thu hoạch lần Chè nguyên liệu sử dụng công nghiệp chế biến chủ yếu tôm 2-3 [7] 1.1.3 Thành phần hóa học chè Lá chè tƣơi có thành phần hóa học khoảng 70% nƣớc, 20% tanin (hỗn hợp catechin dẫn xuất chúng), - 3,5% cafein, pectin 3-5% cịn lại chất khống, xơ, lignin tinh dầu (0,07 - 0,21%) Thuật ngữ polyphenol (tanin thực vật) dùng để hợp chất phenolic chuyển hóa thứ cấp phân bố rộng CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết xác định ảnh hƣởng số yếu tố công nghệ đến hiệu trích ly flavonoid theo phƣơng pháp ngâm lạnh 3.1.1 Ả ưởng nồ g độ ethanol Dung môi chiết yếu tố quan trọng có ảnh hƣởng đến trình chiết xuất hợp chất tự nhiên có thực vật Hiệu chiết xuất hoạt tính chất chiết xuất phụ thuộc lớn vào dung môi nồng độ dung môi Việc lựa chọn nồng độ dung môi ảnh hƣởng trực tiếp đến việc hiệu suất tách chất khỏi nguyên liệu Flavonoid hợp chất có tính phân cực mạnh thơng thƣờng sử dụng chất có độ phân cực mạnh nhƣ methanol, ethanol hay nƣớc làm dung môi trích ly Flavonoid có khả hịa tan tốt methanol ethanol nhƣng methanol chất có độc tính cao nên đề tài tiến hành lựa chọn ethanol nồng độ khác để trích ly Kết nghiên cứu đƣợc thể Bảng 3.1 Hình 3.1 Bảng 3.1 Ảnh hƣởng nồng độ ethanol đến hiệu suất trích ly flavonoid 60% Khối lƣợng bột chè xanh khô (g) Hàm lƣợng flavonoid thu đƣợc (g) 0,2192 ± 0,037 Hiệu suất trích ly theo TLKTĐ(% w/w) 4,384 70% 0,2403 ± 0,036 4,806 80% 0,2545 ± 0,042 5,090 90% 0,2735 ± 0,035 5,470 Nồng độ ethanol (%) 26 Hiệu suất trích ly flavonoid theo TLKTĐ (%) 60% 70% 80% 90% Nồng độ ethanol Hình 3.1 Biểu đồ ả ưởng nồ g độ ethanol đến hiệu suất trích ly flavonoid Kết Bảng 3.1 Hình 3.1 cho thấy trích ly flavonoid nồng độ ethanol khác cho hiệu suất trích ly flavonoid khác dao động khoảng 4,384% – 5,47% Hiệu suất trích ly flavonoid tăng lên chiết nồng độ ethanol từ 60% - 90%, ethanol 90% cho hiệu suất trích ly cao 5,47% Vì vậy, lựa chọn nồng độ ethanol để thực q trình trích ly flavonoid chè xanh 90% 3.1.2 Ả ưởng tỷ lệ nguyên liệu/dung mơi ethanol Q trình trích ly đƣợc thực dựa vào tính hịa tan tốt hoạt chất sinh học dung mơi hữu cơ, q trình chuyển khối có chênh lệch nồng độ nguyên liệu dịng chảy bên ngồi (dung mơi).Vì để nghiên cứu hiệu suất trích ly flavonoid cần nghiên cứu ảnh hƣởng tỷ lệ nguyên liệu/dung môi, đề tài tiến hành khảo sát tỷ lệ nguyên liệu/dung môi: 1/5, 1/10, 1/15, 1/20 Các kết thí nghiệm đƣợc thể Bảng 3.2 Hình 3.2 27 Bảng 3.2 Ảnh hƣởng tỷ lệ nguyên liệu/dung môi ethanol đến hiệu suất trích ly flavonoid Khối lƣợng Hàm lƣợng flavonoid Hiệu suất trích liệu: dung mơi bột chè xanh thu đƣợc (g) ly theo TLKTĐ ethanol (g/ml) (g) 1/5 0,0518 ± 0,015 1,726 1/10 0,1477 ± 0,016 4,923 1/15 0,1630 ± 0,020 5,433 1/20 0,1667 ± 0,023 5,556 1:05 1:10 Hiệu suất trích ly flavonoid theo TLKTTĐ (%) Tỷ lệ nguyên (% w/w) 1:15 1:20 Tỷ lệ nguyên liệu/dung mơi (g/ml) Hình 3.2 Biểu đồ ả ưởng tỷ lệ ngun liệu/ dung mơi ethanol đến hiệu suất trích ly flavonoid Kết trình bày Bảng 3.2 Hình 3.2 cho thấy hiệu suất trích ly flavonoid tăng lên tỷ lệ: nguyên liệu/dung môi tăng, từ tỷ lệ 1/5 đến 1/10 hiệu suất trích ly tăng nhanh từ 1,726% lên 4,923% nhƣng tăng dung môi từ 1/10 lên 1/15 1/15 lên 1/20 hiệu suất trích ly tăng nhƣng khơng đáng kể Lý Ngọc Trâm (2012) tỷ lệ nguyên nguyên liệu/dung mơi ethanol thích hợp để trích ly flavonoid từ phế thải chè phƣơng pháp trích ly động nhiệt độ 70oC 1/12 28 Hiệu suất trích ly đạt cao tỷ lệ nguyên liệu/dung môi 1/20 nhƣng để tiết kiệm dung môi hay để tăng hiệu kinh tế cho q trình trích ly chọn tỷ lệ nguyên liệu/dung môi 1/15 phù hợp 3.1.3 Ả ưởng thời gian chiết ethanol Theo lý thuyết thời gian trích ly dài hiệu suất thu nhận sản phẩm tăng nhƣng đến ngƣỡng thời gian định lƣợng sản phẩm thu đƣợc tăng lên không đáng kể, đồng thời ảnh hƣởng xấu đến chất lƣợng sản phẩm Do cần xác định thời gian trích ly thích hợp cho nguyên liệu Tiến hành nghiên cứu thời gian chiết ethanol 12 giờ, 24 36 Kết xác định ảnh hƣởng thời gian chiết ethanol 90% đƣợc thể Bảng 3.3 Hình 3.3 Bảng 3.3 Ảnh hƣởng thời gian chiết ethanol đến hiệu suất trích ly flavonoid Thời gian Khối lƣợng bột Hàm lƣợng Hiệu suất trích ly (h) chè xanh khô (g) Flavonoid thu đƣợc theo TLKTĐ (% (g) w/w) 12 0,1704 ± 0,015 3,408 24 0,2712 ± 0,033 5,424 36 0,2763 ± 0,038 5,526 29 HIệu suất trích ly flavonoid theo TLKTĐ (%) 12h 24h 36h Thời gian chiết ethanol Hình 3.3 Biểu đồ ả ưởng thời gian chiết ethanol đến hiệu suất trích ly flavonoid Từ kết Bảng 3.3 Hình 3.3 cho thấy hàm lƣợng flavonoid tăng theo thời gian chiết Thời gian chiết từ 12h đến 24h, hiệu suất trích ly flavonoid tăng cao từ 3,408% lên 5,424%, tiếp tục tăng thời gian từ 24h đến 36h hiệu suất trích ly flavonoid tăng 0,102% Chiết 36h cho hiệu suất trích ly cao chiết 24h Tuy nhiên, chiết 36h cho hiệu suất trích ly tăng khơng nhiều so với 24h áp dụng quy mơ cơng nghiệp khơng khả thi Để tiết kiệm thời gian, chi phí cho q trình trích ly nên chọn thời gian 24h cho trình chiết ethanol 90% Vì lựa chọn thời gian chiết ethanol 24h 3.2 Định tính flavonoid phản ứng hóa học đặc trƣng Tiến hành trích ly flavonoid theo quy trình B.C.Talli thu đƣợc cao flavonoid tồn phần, hịa tan cao flavonoid thu đƣợc dịch flavonoid hòa tan ethanol Tiến hành phản ứng đặc trƣng phát có mặt nhóm chất flavonoid Bảng 3.4 Kết định tính flavonoid chiết xuất từ chè Thuốc thử FeCl3 NaOH Shinoda Màu phản ứng Xanh đen Vàng nâu Đỏ cam 30 a b c Hình 3.4 Kết định tính flavonoid chiết xuất từ chè a: Phản ứng với FeCl3; b: Phản ứng với NaOH; c: Phản ứng shinoda Các kết Bảng 3.4, Hình 3.4 cho thấy dịch flavonoid chiết từ bột chè xanh thu đƣợc cho phản ứng dƣơng tính với thuốc thử đặc hiệu nhóm chất flavonoid Cụ thể: phản ứng FeCl3 có màu xanh đen đặc trƣng cho thấy có mặt của flavonoid có cấu tạo orthodiphenol Phản ứng Shinoda có màu đỏ cam có mặt chất flavonoid mang nhóm cacbony (>C=O) vị trí C4 cấu tạo hóa học quan trọng cần có bioflavonoid (các chất flavonoid có hoạt tính sinh học) 3.3 Định tính flavonoid sắc ký lớp mỏng Việc phân tích thành phần flavonoid sắc ký lớp mỏng đƣợc tiến hành mẫu flavonoid trích ly đƣợc từ chè sử dụng mẫu chuẩn quercetin Để phân tích thành phần flavonoid mỏng, sử dụng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng chiều đƣợc tiến hành mỏng Silicagel Chạy sắc ký chiều từ dƣới lên với hệ dung môi (etyl axetat: toluene: formic acid: H2O = 7: 3: 1,5: 1) Sau chạy sắc ký xong, mỏng đƣợc làm khô tủ sấy nhiệt độ 32oC – 37oC sau quan sát dƣới ánh sáng thƣờng ánh sáng tử ngoại Kết đƣợc trình bày Hình 3.5 31 Hình 3.5 Kết chạy sắc ký mỏng flavonoid quan sát ánh g t ường ánh sáng tử ngoại Trong 1, 4: Mẫu chuẩn quercetin 2, 3: Flavonoid tách chiết từ chè tƣơi Kết chạy sắc ký chứng minh q trình trích ly flavonoid từ chè tƣơi thực thành công Khi quan sát dƣới ánh sáng thƣờng ảnh sắc ký vết tách có màu vàng nâu mờ khó quan sát, nhƣng quan sát ánh sáng tử ngoại vết tách dễ quan sát Qua hình ảnh chạy sắc ký, thấy có vết tách từ flavonoid tách chiết từ chè giống nhƣ vết tách từ mẫu chuẩn quercetin nhƣng nhỏ nhạt màu so với mẫu chuẩn quercetin, điều chứng tỏ flavonoid tách chiết từ chè thu đƣợc có quercetin với hàm lƣợng nhỏ bên cạnh flavonoid tách chiết từ chè cịn chứa nhóm flavanol, flavone thể vết tách ảnh chạy sắc ký Theo Chi - Tang Ho, Đại học Rutgers, thành phần flavonoid chè tƣơi gồm flavanol nhƣ (-)-epicatechin gallate (ECG), (-)-epigallocatechin (EGC), (-)- epigallocatechin gallate (EGCG), (-)32 epicatechin (EC), (+)- gallocatechin (GC), (+)- catechin (C) dẫn xuất; flavonol nhƣ quercetin, kaempferol, dẫn xuất glycoside; flavone 3.4 Xác định khả chống oxy hóa dịch flavonoid chiết từ chè Một số flavonoid có lực cao với enzyme peroxydaza, tham gia vào phản ứng enzyme với vai trò chất bị oxy hóa từ dạng khử (hydroquinone) thành dạng semiquinon quinon Semiquinon quinon sinh từ flavonoid tƣơng ứng gốc tự bền, có khả triệt tiêu gốc tự hoạt động có hại thể Trong phản ứng oxy hóa indigocarmin hoạt độ enzyme giảm số lƣợng semiquinon quinon đƣợc tạo thành nhiều điều thể khả chống oxy hóa flavonoid Trong phản ứng flavonoid đóng vai trị chất cạnh tranh với indigocarmin Dựa vào việc xác định cƣờng độ màu phản ứng oxy hóa chất indigocarmin H2O2 môi trƣờng axit yếu có tham gia enzyme peroxydaza bƣớc sóng 610 nm tính đƣợc hoạt tính enzyme (từ tính đƣợc % ức chế hoạt động enzyme) Hoạt tính enzyme peroxydaza mẫu đối chứng (khơng có mẫu thử) 100%, có chất thử hoạt tính enzyme thay đổi Trong thí nghiệm này, đề tài tiến hành đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dịch flavonoid chiết xuất từ chè với nồng độ thay đổi từ 25 µg/ml đến 200µg/ml máu gà Kết Hình 3.6 cho thấy, từ nồng độ 100 µg/ml trở lên dịch flavonoid có tác dụng làm hoạt động enzyme giảm mạnh Ở nồng độ 200 µg/ml dịch flavonoid chiết xuất từ chè gần nhƣ kìm hãm hồn tồn hoạt động enzyme 98,5% Nhƣ dịch flavonoid chiết từ chè xanh có hoạt tính chống oxy hóa máu 33 % ỨC CHẾ HOẠT ĐỘNG CỦA ENZYM PEROXYDAZA 120 98.5 100 80.3 80 67.18 60 47.2 40 29.41 11.62 20 18.73 0 50 100 150 200 250 Nồng độ dịch flavonoid (µg/ml) Hình 3.6 Ả ưởng nồ g độ flavonoid chiết xuất từ chè xanh lên % ức chế hoạt động enzyme peroxydaza 3.5 Khả kháng khuẩn dịch flavonoid chiết từ bột chè Trong dân gian, chè thƣờng đƣợc sử dụng để chữa số bệnh viêm nhiễm nhƣ ghẻ lở, mụn nhọt,…đây bệnh liên quan tới chủng vi khuẩn có khả gây viêm nhiễm bên bên thể, đề tài tiến hành kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn dịch flavonoid chiết từ bột chè xanh nồng độ 5mg/ml 50mg/ml chủng vi sinh vật kiểm định gồm: trực khuẩn Gram âm Salmonella enterica, Escherichia coli, trực khuẩn Gram dƣơng Bacilus subtilis, nấm Aspergillus niger Kết cho thấy nồng độ 50mg/ml, dịch flavonoid chiết từ bột chè xanh có tác dụng ức chế chủng vi khuẩn gram âm Escherichia coli, Salmonella enterica nấm Aspergillus niger với mức độ khác Khi pha loãng nồng độ 5mg/ml tác dụng ức chế thể yếu, không rõ Đối với vi khuẩn Gram dƣơng Bacilus subtilis dịch flavonoid chiết từ bột chè hai nồng độ 5mg/ml 50mg/ml khơng có tác dụng ức chế 34 a b c Hình 3.7 Một số hình ảnh khả ă g k g vi i vật dịch flavonoid chiết xuất từ chè xanh 1: công thức đối chứng nhỏ ước cất 2: hợp chất flavonoid nồ g độ 50mg/ml 3: hợp chất flavonoid nồ g độ 5mg/ml a: Ảnh hƣởng dịch chiết đến sinh trƣởng Salmonella enterica b: Ảnh hƣởng dịch chiết đến sinh trƣởng Escherichia coli c: Ảnh hƣởng dịch chiết đến sinh trƣởng Nấm Aspergillus niger 35 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Đã khảo sát đƣợc ảnh hƣởng số yếu tố cơng nghệ đến hiệu suất q trình trích ly flavonoid: nồng độ ethanol 90%, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi ethanol =1/15, thời gian chiết ethanol 24h điều kiện thích hợp để trích ly flavonoid từ chè xanh phƣơng pháp ngâm lạnh Ở điều kiện hiệu suất trích ly flavonoid đạt hiệu cao Dịch flavonoid chiết xuất từ chè xanh thể hoạt tính chống oxy hóa tốt nồng độ 200 µg/ml thơng qua phản ứng oxy hóa indigocarmin máu Dịch flavonoid chiết xuất từ chè xanh có khả ức chế nhóm trực khuẩn Gram âm Salmonella enterica, Escherichia coli nấm Aspergillus niger Kiến nghị Tiếp tục khảo sát thêm ảnh hƣởng số yếu tố khác đến khả trích ly flavonoid phƣơng pháp ngâm lạnh nhƣ số lần trích ly, khuấy trộn Nghiên cứu sử dụng phƣơng pháp trích ly khác nhƣ phƣơng pháp hầm hay ngấm kiệt siêu âm để q trình trích ly thu nhận flavonoid từ bột chè đạt hiệu cao 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO I.TIẾNG VIỆT Djemukhatze K M (1981), ―Cây chè Miền Bắc Việt Nam‖, NXB Nông nghiệp, Hà Nội Đỗ Trung Đàm (2006), ―phƣơng pháp nghiên cứu tác dụng dƣợc lý thuốc từ thảo dƣợc‖, Nhà xuất KH &KT, Hà nội Lại Thị Ngọc Hà, Vũ Thị Thƣ (2013), ―Stress oxi hóa chất chống oxi hóa tự nhiên‖.Tạp chí Khoa học Phát triển Lê Tất Khƣơng (1999) ―Giáo trình chè‖ NXB Nơng nghiệp, Hà Nội Trần Văn Ơn (2006), Bài Giảng Thực vật học tập 2, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phƣơng pháp cô lập hợp chất hữu cơ, NXB ĐH quốc gia Tp.HCM Đỗ Ngọc Quý, Nguyễn Kim Phong (1997) ―Cây chè Việt Nam‖, NXB Nông nghiệp, Hà Nội Nguyễn Duy Thịnh (2004), Giáo trình Cơng Nghệ chè, Trƣờng Đại Học Bách Khoa Hà Nội, 2004 Ngô Văn Thu, Bài giảng dƣợc liệu II nhà xuất y dƣợc Hà Nội 10 Ngô Văn Thu Trần Hùng (2011), Dƣợc liệu học Nhà xuất Y học Bộ Y tế 11 Nguyễn Anh Thủy, Dƣơng Anh Tuấn, Vũ Nguyên Thành (2011), Tinh chế peroxide từ củ cải trắng Raphanus sativus Var hortensis ứng dụng xét nghiệm ethanol, Tạp chí cơng nghệ sinh học, 113-118 12 Đồn Hùng Tiến, Đỗ Văn Ngọc (1998), Tuyển tập cơng trình nghiên cứu Chè, Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội 13 Đỗ Thị Hoa Viên (2007), Nghiên cứu khảo sát hoạt chất flavonoid mơ Prunus armeniaca (họ Rosaceae) Tạp chí Khoa học cơng nghệ II TIẾNG ANH 14 Afaq F.; Adhami V M.; Ahmad N.; Mukhtar H.(2004), Health benefits of tea consumption In T Wilson, & N J Temple (Eds.), Beverages in nutrition and health New Jersey: Humana Press Inc 15 Benavente G O.; Castillo J.; Marin F R.; Ortuno A.; Del Rio J A (1997) Uses and properties of Citrus flavonoids J.Agric Food Chem, 45, 45054515 16 Cabrera C., et al (2008) Beneficial Effects of Green Tea—A Review J Amer Coll Nutrition, Vol 25, No 2, 79–99 17 Dai J and R J Mumper (2010) Plant Phenolics: Extraction Analysis and Their Antioxidant and Anticancer Properties Molecules, p 7313-7352 18 Demeule M.; Michaud-Levesque J.; Annabi B.; Gingras D.; Boivin D.; Jodoin J.; et al (2002) Green tea catechins as novel antitumor and antiangiogenic compounds Current Medicinal Chemistry Anticancer Agents, 2, 441−463 19 Gramza A.; Korczak J (2005) Tea constituents (Camellia sinensis L.) as antioxidants in lipid systems Trends in Food Science and Technology, 16, 351−358 20 Gressman (1975), ―The chemistry of flavonoid compounds‖, Academic press, London 21 Grotewold E (2006) The Science of Flavonoids New York: Springer Science Business Media Inc 22 Gulcin (2012), Antioxidant activity of food constituents: an overview Arch Toxicol 86: p 345–391 23 Harborne J B and Williams C A (2000), Review: Advances in flavonoid research since 1992 Phytochemistry 55: p 481 -504 24 Khan N.; Mukhtar H (2007), Tea polyphenols for health promotion Life Sciences, 81, 519−533 25 Koo M W.; Cho C H (2004) Pharmacological effects of green tea on the gastrointestinal system Euro J Pharmacology, 500, 177−185 26 Nakachi K.; Matasuyama S.; Miyake S.; Suganuma M and Imai K (2000) Preventive effects of drinking green tea on cancer and cardiovascular disease: epidemiological evidence for multiple targeting prevention Biofactors, 13, 49–54 27 Peterson J J.; Beecher G R.; Bhagwat S A.; Dwyer J T.; Gebhardt S E.; Haytowitz D B (2006) Flavanones in grapefruit, lemons, and limes: A compilation and review of the data from the analytical literature J Food Compos Anal., 19, 74–80 28 Rehman Z U (2006) Citrus peel extract - A natural source of antioxidant Food Chemistry, 99, 450–454 29 Re R., et al (1999), Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay Free radical biology and medicine 26: p.1231 - 1237 30 (Russian) Epmakov A U gp (1972) ―Phytobiochemical methodl‖, Leningrat Publishing House, pp 117 – 123, 336 – 374 31 Sandhar H.K (2011), Review of Phytochemistry and Pharmacology of Flavonoids Intre Pharm Scie., (1), 25-41 32 Segovia R G., et al (2008), Effect of the flavonoid quercetin on inflammation and lipid peroxidation induced by Helicobacter pylori in gastric mucosa of guinea pig J Gastroenterol 43: p 441-447 33 Singh B N; Singh B R.; Singh R L.; Prakash D.; Singh D P.; Sarma B K.; et al (2009) Polyphenolics from various extracts/fractions of red onion (Allium cepa) peel with potent antioxidant and antimutagenic activities Food Chem Toxicology, 47, 1161–1167 34 Swain J., Goldstein J L (1963), ―Methods in polyphenol chemistry‖, Proceedings of the plant phenolics group symposium, Oxford 35 Tram L N.; Shimoyamada M.; Kato K.; Yamauchi R (2003) Isolation and characterization of some antioxidative compounds from the rhizomes of smaller galanga (Alpinia officinarum Hance) J Agric Food Chem., 51, 4924-4929 36 Wu A H.; Butler L M (2011) Green tea and breast cancer Molecular Nutrition and Food Research, 55, 921–930 37 Xuejun P.; Guoguang N.; Huizhou L (2003) Microwave-assisted extraction of tea polyphenols and tea caffeine from green tea leaves Chemical engineering and processing, 42, 129–133 ... 3,4-diol, anthocyanidin, flavanone, flavone, flavonol, 3-hydroxy flavanon, chalcon, dihidrochalcon, aurone Isoflavonoid (3-benzopyrans): gồm nhóm phụ iso flavan, iso flavan-4ol, isoflavon, isoflavanon,... flavonoid, biflavonoid (những flavonoid dimer), triflavonoid (cấu t? ?o monomer flavonoid) flavonlignan (những flavonoid mà phân tử có cấu trúc lignan [11] 1.2.2.1 Các chất thuộc nhóm flavonoids... isoflavan, isoflava-3-ene, isoflavan 4-ol, isoflavanon; isoflavon, rotenoid, pterocarpan, coumestan, 3-arycoumarin, coumaronochromen, coumaronochromon, chất thƣờng gặp họ đậu (Fabaceae) Isoflavan: