Nghiên cứu trích ly flavonoid và xác định hàm lượng vitamin c trong hoa súp lơ xanh

LỜI CẢM ƠN Sau kết thúc khóa học Viện Công Nghệ Sinh Học Lâm Nghiệp, Trƣờng Đại Học Lâm Nghiệp Việt Nam, đƣợc giúp đỡ quý thầy cô Viện, năm học 2018-2019 em tiến hành làm khóa luận với đề tài “ Nghiên cứu trích ly flavonoid xác định hàm lượng vitamin C hoa Súp lơ xanh” Đầu tiên em xin đƣợc gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô giáo trực tiếp giúp em nhiều q trình thực khóa luận – Thạc sỹ Nguyễn Thị Thu Hằng, ngƣời định hƣớng bảo em nhiều kiến thức điều em cịn sai sót q trình thực hiện, truyền đạt cho em nhiều kiến thức kinh nghiệm quý báu, cách tiếp cận với vấn đề, cách giải vấn đề bị khúc mắc Ngồi để hồn thành tốt khóa luận khơng thể khơng kể đến giúp đỡ Thầy Cô Viện Công Nghệ Sinh Học Lâm Nghiệp, Trƣờng Đại Học Lâm Ngiệp Việt Nam, gia đình nhƣ bạn bên giúp đỡ em nhiều quãng thời gian qua Em xin chân thành cảm ơn đến Thầy Cô giáo th.s Nguyễn Thị Hồng Nhung Bộ môn Công nghệ Vi Sinh - Hóa Sinh hỗ trợ tạo điều kiện cho em trang thiết bị cách tốt để em hồn thành đƣợc khóa luận Dù đƣợc bảo tận tình ThS Nguyễn Thị Thu Hằng Thầy Cô viện, với nỗ lực thân em cố gắng hồn thiện khóa luận Tuy nhiên em q trình thực hiện, em cịn nhiều sai sót, kiến thức cịn hạn chế Em kính mong nhận đƣợc đóng góp ý kiến đánh giá Thầy Cơ để khố luận em đƣợc hồn thiện Em xin chân thành cảm ơn i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH v MỞ ĐẦU 1.1 Giới thiệu Súp lơ xanh 1.1.1.Tên khoa học, nguồn gốc, phân loại 1.1.2 Đặc điểm hình thái 1.1.3 Thành phần dinh dƣỡng hoa Súp lơ xanh[5] 1.1.4 Tác dụng sinh học hoa Súp lơ 1.2 Tổng quan flavonoid 1.2.1 Khái niệm 1.2.2 Cấu trúc chung phân loại 1.2.3 Tính chất lý hóa 13 1.2.4 Tính chất sinh học flavonoid 14 1.3 Tình hình nghiên cứu, ứng dụng sản xuất nƣớc 16 1.4 Tình hình nghiên cứu, ứng dụng sản xuất giới 17 CHƢƠNG : NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 18 2.2 Nội dung nghiên cứu 18 2.3 Vật liệu nghiên cứu 18 2.3.1 Vật liệu thực vật 18 2.3.2 Vật liệu vi sinh vật 18 2.3.3 Môi trƣờng nghiên cứu vi sinh vật 19 2.4 Thiết bị dụng cụ, hóa chất nghiên cứu 19 2.5 Phƣơng pháp nghiên cứu 19 2.5.1 Xác định độ ẩm hoa Súp Lơ 19 2.5.2 Yếu tố ảnh hƣởng đến trình tách chiết flavonoid 20 2.5.3 Xác định có mặt flavonoid dịch chiết 23 2.5.4 Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật hợp chất flavonoid tách chiết từ hoa Súp lơ xanh 24 2.5.5 Xác định hàm lƣợng Vitamin C hoa Súp Lơ xanh 25 PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 3.1 Xác định độ ẩm 28 3.2 Xác định loại dung môi thích hợp cho q trình trích ly 29 ii 3.3 Tách chiết flavonoid từ hoa Súp lơ xanh phƣơng pháp siêu âm theo quy trình ngâm chiết ethanol 30 3.4 Tối ƣu số điều kiện trình tách chiết flavonoid từ hoa Súp lơ xanh 30 3.4.1 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến hiệu trích ly 30 3.4.2 Ảnh hƣởng nồng độ ethanol đến khả trích ly 31 3.4.3 Ảnh hƣởng thời gian chiết ethanol 32 3.4.4 Ảnh hƣởng tỷ lệ nguyên liệu /dung môi ethanol 33 3.5 Xác định có mặt flavonoid cao chiết 34 3.5.1 Định tính flavonoid phản ứng màu đặc trƣng 34 3.5.2 Định tính flavonoid sắc ký lớp mỏng 35 3.6 Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định flavonoid chiết suất từ hoa Súp lơ xanh 36 3.7 Xác định hàm lƣợng vitamin C 38 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39 4.1 Kết luận 39 4.2 Kiến nghị 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO iii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Giá trị dinh dƣỡng hoa Súp lơ Bảng 3.1 Độ ẩm hoa Súp Lơ 28 Bảng 3.2 Trị số đo OD dịch chiết cồn 29 Bảng 3.3 Kết tách chiết Flavonoid 30 Bảng 3.4 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến khả trích ly 31 Bảng 3.5 Ảnh hƣởng nồng ethanol độ đến hiệu suất trích ly 32 Bảng 3.6 Ảnh hƣởng thời gian chiết ethanol đến hiệu suất trích ly 33 Bảng 3.7 Ảnh hƣởng tỷ lệ nguyên liệu/ dung mơi ethanol đến hiệu suất trích ly 34 Bảng 3.8 Định tính xác định có mặt flavonoid 34 Bảng 3.9 Tính kháng chủng vi sinh vật kiểm định dịch Flavonoid 37 Bảng 3.10 Hàm lƣợng viatamin C hoa Súp lơ 38 iv DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cây Súp lơ xanh Hình 1.2 Cấu trúc flavonoid [2] Hình 1.3 cấu tạo flavonoid Hình 1.4 Cấu tạo flavan 3,4 diol Hình 1.5 Cấu tạo flavanon 10 Hình 1.6 Dẫn chất taxifolin 10 Hình 1.7 cấu tạo appogenin lutelin 11 Hình 1.8 Câu tạo flavon 3-ol 11 Hình 1.9 cấu tạo chalcon 11 Hình 1.10 Cấu tạo auron 12 Hình 2.1 Hoa Súp lơ 18 Hình 2.2: Sơ đồ quy trình chiết xuất flavonoid hoa Súp lơ xanh theo phƣơng pháp ngâm chiết 22 Hình 3.1 Hình ảnh hoa Súp Lơ trƣớc (A) sau sấy (B) 28 Hình 3.2 Dịch chiết loại cồn 29 Hình 3.3 Định tính flavonoid trích ly từ hoa Súp lơ xanh 35 Hình 3.4 Kết chạy sắc ký mỏng flavonoid quan sát dƣới ánh sáng thƣờng ánh sáng tử ngoại 36 Hình 3.5 Hoạt tính kháng số chủng vi sinh vật kiểm định Flavonoid chiết suất từ hoa Súp lơ xanh 37 v MỞ ĐẦU Từ hàng kỉ trƣớc, ngƣời biết sử dụng thực vật vào nhiều lĩnh vực khác nhau, áp dụng nông nghiệp, công nghiệp áp dụng vào y học nhƣ sử dụng thực vật có hoạt tính dƣợc liệu để phòng chữa bệnh Hiện nhờ phát triển khoa học công nghệ nên việc nghiên cứu thành phần hoạt tính dƣợc liệu có thực vật ngày đƣợc thuận lợi hiệu Vấn đề sức khỏe ngƣời ngày đƣợc đầu tƣ phát triển Flavonoid hợp chất có nhiều tác dụng y học: điều trị số bệnh nhƣ viêm nhiễm, dị ứng, số bệnh liên quan đến dày giúp thể điều hịa q trình trao đổi chất, chống lão hóa, làm bền thành mạch máu, giảm hàm lƣợng cholesterol máu Flavonoid khơng có thực vật bậc cao mà xuất loại thực vật bậc thấp, nhiều loại rau củ có chứa flavonoid flavonoid có tính dƣợc liệu, đến có khoảng 11000 hợp chất flavonoid đƣợc biết cấu trúc không ngừng nghiên cứu tìm thêm nhiều cấu trúc khác Flavonoid đƣợc phân lập từ nhiều nguồn thực vật khác nhau, thực phẩm phổ biến có hàm lƣợng flavonoid cao Hoa Súp lơ xanh loại thực vật thiên nhiên giàu flavonoid, có tác dụng làm chậm q trình lão hóa làm cân q trình trao đổi chất thể, kích hoạt hệ thống thải độc, bảo tế bào loại bỏ chất gây ung thƣ khỏi thể Việt Nam nƣớc đa dạng sinh học, nguồn tài nguyên dồi môi trƣờng lý tƣởng để trồng loại rau củ Súp lơ xanh loại chịu đƣợc lạnh (nhiệt độ thích hợp để trồng từ 15-180C) thích hơp với khí hậu Việt Nam đặc biệt miền bắc vùng cao nhƣ Tây Nguyên, Đà Lạt, Lâm Đồng Hiện lĩnh vực nghiên cứu hoạt tính sinh học có thực vật đƣợc nhà khoa học quan tâm nhiều, nhận thấy quan trọng lồi tơi tiến hành thu nhận flavonoid từ Sup lơ Xanh với đề tài khóa luận “Nghiên cứu trích ly flavonoid xác định hàm lượng vitamin C hoa Súp lơ xanh” CHƢƠNG TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Giới thiệu Súp lơ xanh 1.1.1.Tên khoa học, nguồn gốc, phân loại Súp lơ xanh có tên tiếng Anh: Broccoli, tên khoa học: Brassica oleracea.italica Plenck, thuộc họ thập tự: Cruciferaceae, thuộc nhóm Italica Italia nƣớc sử dụng Súp lơ xanh làm rau khoảng 2000 năm trƣớc Cây trở thành loại rau thông dụng Mỹ sau giống Súp lơ Xanh thƣơng mại đƣợc thu hoạch Broollyn, New York Ngày Súp lơ xanh đƣợc trồng nhiều Anh, Châu Âu Châu Á [10] Hình 1.1 Cây Súp lơ xanh Súp lơ xanh đƣợc chia phân loại thành nhóm là: Súp lơ đơn: Thƣờng đƣợc trồng vụ sớm Giống có đặc điểm nhỏ, dài mặt có lớp phấn trắng, mỏng, ngù hoa trắng, gạo nhỏ, mặt mịn, mỏng, ăn ngon, trọng lƣợng hoa phần sử dụng làm thực phẩm từ 1-2kg Súp lơ kép: Thƣờng đƣợc trồng vụ muộn, thấp, trọng lƣợng hoa sử dụng làm thực phẩm từ 1,5-3kg, mỏng bầu, màu nõn tía 1.1.2 Đặc điểm hình thái Cây Súp lơ xanh có đặc điểm hình thái nhƣ sau: Hệ rễ: Cây thuộc loại rễ chùm, phân nhánh, phát triển phía hệ rễ tiếp tục ăn sâu xuống đất rễ ngang bắt đầu phát triển mạnh mẽ hơn, rễ cọc ăn nông Khi giai đoạn thành thục hệ rễ ăn sâu 30cm rộng khoảng 40cm, chịu hạn chịu úng Lá: Súp lơ có phát triển, có cuống mặt phiến rộng, có lớp bảo vệ, xẻ thùy số diện tích cao Hoa: Hoa Súp lơ giống nhƣ loại hoa họ Thập tự, hoa tập trung thành chùm Hoa nở thân chính, sau nở tiếp cành cấp I tiếp tục cấp II cấp III Hoa nở từ dƣới lên vào buổi sáng khoảng 8-10 Hoa thƣờng thụ phấn nhờ côn trùng, nhiệt độ thích hợp cho thụ phấn 12-22ºC, nhiệt độ dƣới 10ºC xâm nhập hạt phấn bị kìm hãm, cịn nhiệt độ 30ºC hạt phấn xâm nhập nhanh nhƣng khó thụ tinh Tính trạng chín sớm năm trội so với tính trạng hai năm đƣợc kiểm tra hàng loạt gen Quả: Quả Súp lơ thuộc dạng giác, có hai ngăn chứa hạt nằm dọc theo rãnh Tùy thuộc vào giống Súp lơ mà có số lƣợng hạt khác Sau hoa nở đƣợc 3-4 tuần đạt kích thƣớc lớn chuyển vào giai đoạn chín Hạt: Hoa Súp lơ thƣờng có dạng trứng trịn, màu nâu nâu xám, nâu đỏ [10] 1.1.3 Thành phần dinh dưỡng hoa Súp lơ xanh[5] Trong hoa Súp lơ xanh, nƣớc chiếm khoảng 75-95% trọng lƣợng Nƣớc chứa chất dinh dƣỡng vận chuyển vật chất từ quan sang quan khác tổ chức tế bào Khi lƣợng nƣớc giảm, Súp lơ bị héo vàng hoa, rút ngắn thời hạn bảo quản Các thành phần có hoa Súp lơ xanh gồm: Gluxit bao gồm: Các loại đƣờng đơn, đƣờng kép nhƣ sucrose, fructose, glucose, maltose, galactose., Các polysaccaride: tinh bột, celllulose,hemixenlulose Tinh bột: lƣợng tinh bột hoa Súp lơ thấp khoảng 0,1% Dƣới tác dụng môi trƣờng acid enzyme, tinh bột bị phân giải thành dextrin, maltose glucose Cellulose: Trong hoa Súp lơ có khoảng 0,9% cellulose Phân bố khắp quan hoa Súp lơ nhƣng có nhiều lớp vỏ cuống hoa Lƣợng cellulose Súp lơ nhiều hoa già, chất lƣợng thấp Chất xơ Chất sơ Súp lơ bao gồm cellulose, hemixenlulose, pectin chiếm khoảng 2,5% Axit hữu Hàm lƣợng acid hữu hoa Súp lơ thƣờng nhỏ 1%, có khả hạn chế tốc độ hoạt động enzyme gây biến màu sản phẩm cắt Vitamin Trong Súp lơ xanh có nhiều vitamin nhƣng nhiều vitamin C gọi axit ascorbic, tồn dạng: Dạng tự acid ascorbic, dạng oxi hóa hehydro ascorbic dạng liên kết với protid ascorbigen Vitamin C bền vững môi trƣờng axit dễ bị thủy phân môi trƣờng kiềm, O2, ánh sáng, nhiệt độ cao.Vitamin C chất quý có Súp lơ xanh Ngồi ra, Súp lơ cịn có thành phần vitamin có giá trị cao nhƣ có chứa vitamin A, vitamin nhóm B, niacin, pantothenic, acid tartric acid folic Sau bảng thành phần dinh dƣỡng hoa Súp lơ xanh Bảng 1.1 Giá trị dinh dƣỡng hoa Súp lơ STT Thành phần dinh dƣỡng Năng lƣợng Hàm lƣợng 100g 141 KJ (34 kcal) Carbohydrate 6,64g Đƣờng 1,7g Chất xơ 2,6g Chất béo 0,37g Chất đạm 2,82g Vitamin C 89,2 mg Vitamin E 0,78 mg Vitamin K 101,6 mg 10 Canxi 47 mg 11 Sắt 0,73mg 12 Magiê 21 mg 13 Phốt 66 mg 14 kali 316mg 15 Kẽm 0,41mg (https://en.m.wikipedia.org/wiki/Papaya) 1.1.4 Tác dụng sinh học hoa Súp lơ Hoa Súp lơ xanh thƣờng chứa nhiều hợp chất tốt cho sức khỏe nhƣ: Bảo vệ tế bào, chống lão hóa, Súp lơ xanh chứa glucosinolates vitamin C chất đƣợc chứng minh có tác dụng chống lại cân oxy hóa (oxidative stress - OS) Sự cân oxi hóa hậu cân hình thành gốc tự có oxy chế kháng oxy hóa thể [11, 12, 13] Sự cân oxi hóa đƣợc xem có liên quan đến nguyên nhân nhiều bệnh lý ngƣời nhƣ xơ vữa động mạch, ung thƣ, tiểu đƣờng, tổn thƣơng gan, thấp khớp, đục thủy tinh thể, rối loạn thần kinh trung ƣơng, thần kinh vận động, Parkinson, muộn, bệnh lý phụ khoa, bệnh lý thai kỳ… 3.3 Tách chiết flavonoid từ hoa Súp lơ xanh phƣơng pháp siêu âm theo quy trình ngâm chiết ethanol Khóa luận lựa chọn phƣơng pháp để trích ly flavonoid từ hoa Súp lơ xanh, với đối tƣợng khác thu đƣợc kết khác tùy thuộc vào vật liệu mà hiệu suất trích ly khác, kết thu đƣợc bảng 3.3 cho thấy phƣơng pháp phù hợp trích ly flavonoid từ hoa Súp lơ xanh Bảng 3.3 Kết tách chiết Flavonoid Phƣơng pháp Siêu âm Quy trình ngâm chiết Khối lƣợng bột Hoa Súp lơ xanh (g) 5 5 5 Hàm lƣợng flavonoid thu đƣợc (g) 0,072 0,069 0,071 0,148 0,139 0,145 Tỷ lệ phần trăm (%) 1,41 ± 0.03 2,88 ± 0,09 Kết Bảng 3.3 thu đƣợc hiệu suất tách chiết flavonoid phƣơng pháp siêu âm 1,141%, hiệu suất tách chiết flavonid phƣơng pháp ngâm chiết 2,88%, kết cho thấy quy trình ngâm chiết đạt hiệu cao hẳn so với phƣơng pháp siêu âm nên khóa luận lựa chọn phƣơng pháp ngâm chiết để tiến hành tách chiết flavonoid từ hoa súp lơ xanh để tối ƣu hàm lƣợng flavonoid 3.4 Tối ƣu số điều kiện trình tách chiết flavonoid từ hoa Súp lơ xanh 3.4.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu trích ly Trích ly flavonoid điều kiện nhiệt độ khác cho kết hiệu suất thu nhận flavonoid khác, kết đƣợc thể bảng 3.4 30 Bảng 3.4 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến khả trích ly Nhiệt độ Nóng 60ºC Nhiệt độ phòng Lạnh 4ºC Mẫu Khối lƣợng mẫu (g) Khối lƣợng flavonoid (g) N1 N2 N3 T1 T2 T3 L1 L2 L3 5 5 5 5 0,161 0,159 0,163 0,147 0,142 0,146 0,052 0,044 0,051 Hiệu suất trích ly theo TLĐTĐ (%) 3,22 ± 0,04 2,9 ± 0,05 0,98 ± 0,09 Kết bảng 3.2 cho thấy trích ly nhiệt độ 4ºC cho hiệu trích ly thấp 0,98%, thí nghiệm dùng nhiệt độ phịng hiệu suất trích ly 2,9%, thí nghiệm thực 60ºC cho kết hiệu suất trích ly flavonoid từ hoa Súp lơ cao 3,22% so với điều kiện nhiệt độ lại 3.4.2 Ảnh hưởng nồng độ ethanol đến khả trích ly Dung mơi ethanol ảnh dƣởng trực tiếp đến hiệu tách chiết flavonoid, loại bỏ chất khỏi nguyên liệu Vì flavonoid có độ phân cực mạnh nên dùng ethanol methanol nhƣng methanol có tính độc cao nên khơng ƣu tiên dùng Để đạt đƣợc hiệu cao ta cần thực thí nghiệp nhiều mức nồng độ khác để tách chiết Kết thể bảng 3.5 31 Bảng 3.5 Ảnh hƣởng nồng ethanol độ đến hiệu suất trích ly Nồng độ 60 % 80 % 90 % Mẫu Khối lƣợng mẫu (g) Khối lƣợng flavonoid (mg) N1 N2 N3 M1 M2 M3 P1 P2 P3 5 5 5 5 0,141 0,146 0,139 0,148 0,153 0,152 0,164 0,162 0,161 Hiệu suất trích ly (%) 2,84 ± 0,07 3,02 ± 0,05 3,25 ± 0,03 Kết Bảng 3.2 thay đổi nồng độ ethanol kết thu đƣợc khác nhau, cụ thể theo kết bảng ta thấy nồng độ 90% khả trích ly flavonoid đạt hiệu cao 3,25% so với nồng độ cịn lại Khóa luận lựa chọn nồng độ 90% để thực thí nghiệm tách chiết flavonoid để đạt đƣợc hiệu cao 3.4.3 Ảnh hưởng thời gian chiết ethanol Thời gian trích ly dài hiệu suất sản phẩm mà thu đƣợc cuối tăng nhƣng đến ngƣỡng định hiệu suất tăng chậm thời gian bỏ nhiều mà hiệu thu lại không đƣợc nhƣ mong muốn cịn có hệ lụy làm ảnh hƣởng xấu đến chất lƣợng sản phẩm Vì cần xác định đƣợc xác thời gian trích ly thích hợp cho mẫu Từ mà ta tiến hành thí nghiệm nghiên cứu thời gian chiết cụ thể ethanol vòng 12 giờ, 24 36 Kết đƣợc thể Bảng 3.6 32 Bảng 3.6 Ảnh hƣởng thời gian chiết ethanol đến hiệu suất trích ly Thời gian (h) 12 24 36 Khối lƣợng bột hoa Súp lơ (g) 5 5 5 5 55 Hàm lƣợng flavonoid thu đƣợc (g) 0,159 0,161 0,158 0,165 0,163 0,162 0,166 0,162 0,164 Hiệu suât trích ly theo TLKTĐ (%) 3,18 ± 0,03 3,27 ± 0,03 3,28 ± 0,04 Kết từ bảng 3.6 cho thấy thay đổi thời gian chiết hiệu suất tách chiết flavonoid thay đổi, kết thu đƣợc từ 12 lên 24 hàm lƣợng flavonoid tăng từ 3,18 lên 3,27 số khả quan, cho thời gian từ 24 lên 36 tăng từ 3,27 lên 3,28 mà thời gian bỏ lại nhiều vừa tốn thời gian, cơng sức hao mịn thiết bị Vì khóa luận lựa chọn 24 tối ƣu vừa mang lại hiệu cao mà thời gian lại khơng bị lãng phí áp dụng cơng nghiệp khả quan 3.4.4 Ảnh hưởng tỷ lệ ngun liệu /dung mơi ethanol Thực chất q trình trích ly thực đƣợc dựa vào tinh hịa tan tốt hoạt chất sinh học dung môi hữu cơ, trình chuyển khối chênh lệch nồng độ ngun liệu dung mơi Vì để nghiên cứu hiệu suất trích ly flavonoid cần nghiên cứu ảnh hƣởng tỉ lệ nguyên liệu/ dung mơi 1/10,1/15,1/20 Kết thí nghiệm thu đƣợc nhƣ sau: 33 Bảng 3.7 Ảnh hƣởng tỷ lệ nguyên liệu/ dung mơi ethanol đến hiệu suất trích ly Tỷ lệ nguyên liệu: dung môi ethanol (g/ml) Khối lƣợng bột hoa Súp Lơ (g) Hàm lƣợng flavonoid thu đƣợc (g) 5 5 5 5 0,164 0,161 0,163 0,164 0,170 0,168 0,167 0,162 0,163 1/10 1/15 1/20 Hiệu suất trích ly theo TLKTĐ (%w/w) 3,25 ± 0,03 3,35 ± 0,06 3,28 ± 0,05 Kết Bảng 3.4 cho tỷ lệ nguyên liệu/ dung mơi ảnh hƣởng đến hiệu suất trích ly flavonoid, cụ thể nồng độ 1/10 hiệu suất trích ly flavonoid thu đƣợc 3,25%, nồng độ 1/15 cho hiệu suất trích ly flavonoid cao 3,35%, nồng độ 1/20 thu đƣợc kết 3,28% Khóa luận lựa chọc chiết suất flavonoid tỷ lệ nguyên liệu/ dung mơi 1/15 để tối ƣu q trình trích ly đạt đƣợc hiệu cao 3.5 Xác định có mặt flavonoid cao chiết 3.5.1 Định tính flavonoid phản ứng màu đặc trưng Cao flavonoid thu đƣợc sau tách chiết theo phƣơng pháp ngâm chiết đƣợc hòa tan ethanol thu đƣợc dịch flavonoid Tiến hành phản ứng đặc trƣng với nhóm chất flavonoid Kết thu nhận đƣợc trình nghiên cứu thể Bảng 3.8 Hình 3.3 Bảng 3.8 Định tính xác định có mặt flavonoid Thuốc thử Màu phản ứng FeCl3 NaOH Xanh đen Vàng cam 34 FeCl3 NaOH Hình 3.3 Định tính flavonoid trích ly từ hoa Súp lơ xanh Kết Bảng 3.8 Hình 3.3 đƣợc dịch chiết hoa súp lơ xanh có chứa flavonoid thể rõ là: phản ứng với FeCl3 cho kết màu xanh đen, phản ứng với NaOH cho kết dƣơng tính màu vàng cam Khóa luận tách chiết thành công flavonoid từ hoa Súp lơ xanh 3.5.2 Định tính flavonoid sắc ký lớp mỏng Việc phân tích thành phần flavonoid sắc ký lớp mỏng đƣợc tiến hành mẫu flavonoid trích ly đƣợc từ hoa Súp lơ xanh Để phân tích thành phần flavonoid mỏng, sử dụng phƣơng pháp sắc ký mỏng chiều, đƣợc tiến hành mỏng Silicagel, chạy sắc ký chiều từ dƣới lên với hệ dung môi (etyl axetat: toluene: formic acid: H2O = 7: 3: 1, 5: 1) Sau chạy sắc ký xong, mỏng đƣợc làm khô tủ ấm nhiệt độ 32oC –37oC sau quan sát dƣới ánh sáng thƣờng ánh sáng tử ngoại Kết đƣợc thể hình 3.4 35 Hình 3.4 Kết chạy sắc ký mỏng flavonoid quan sát dƣới ánh sáng thƣờng ánh sáng tử ngoại Kết Hình 3.4 cho thấy thí nghiệm chạy sắc ký thành cơng, nhận thấy thí nghiệm tách chiết từ hoa Súp lơ xanh tách chiết đƣợc hợp chất flavonoid Kết quan sát dƣới ánh sáng thƣờng sắc ký vết tách có màu nâu nhạt, quan sát ánh sáng UV vết tách phát quang dễ dàng quan sát Vết tách có màu nâu nhạt màu flavonoid Quan sát hình ảnh chạy sắc ký nhận thấy q trình trích ly flavonoid từ Hoa Súp lơ xanh thành công, dung môi để chạy sắc ký mỏng cho flavonoid tách chiết từ Hoa Súp lơ phù hợp Khi quan sát dƣới ánh thƣờng ảnh sắc ký vết tách có màu nâu nhạt, quan sát ánh sáng tử ngoại vết tách phát quang dễ quan sát 3.6 Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định flavonoid chiết suất từ hoa Súp lơ xanh Súp lơ có hoạt tính có khả chữa trị, bệnh liên quan đến dày mà bệnh thƣờng liên quan đến nhóm vi khuẩn có khả gay viêm nhiễm cho thể, thí nghiệm xác định xem dịch chiết từ Súp lơ có kháng đƣợc vi khuẩn hay khơng 36 Điều kiện làm thí nghiệm: dịch chiết hoa Súp lơ nồng độ 50mg/ml mg/ml chủng vi sinh vật kiểm định gồm : Bacillus cereus, E.coli, Salmonella, Shigella Trực khuẩn Gram dƣơng: Bacillus cereus Shigella Trực khuẩn Gram âm : , E.coli, Salmonella A B D C Hình 3.5 Hoạt tính kháng số chủng vi sinh vật kiểm định Flavonoid chiết suất từ hoa Súp lơ xanh Hình A: Vi khuẩn Bacillus cereus Hình C: Vi khuẩn Salmonella Hình B: Vi khuẩn Shigella Hình D: Vi khuẩn E.coli Kết nhƣ sau: Bảng 3.9 Tính kháng chủng vi sinh vật kiểm định dịch Flavonoid Chủng vi sinh vật kiểm định Đƣờng kính vịng kháng vi sinh vật kiểm định (cm) Vi khuẩn Shigella 1,92 ± 0,045 Vi khuẩn Bacillus cereus 1,83 ± 0,032 Vi khuẩn E.coli 1,21 ± 0,014 Vi khuẩn Salmonella 1,35 ± 0,003 37 Sau thu đƣợc kết ta trực quan ta thấy đƣợc hoạt tính có hoa Súp lơ có khả kháng lại vi sinh vật Kết Bảng 3.9 thu đƣợc hoạt tính kháng số loại vi sinh vật hợp chất flavonoid cao, hàm lƣợng flavonoid nhƣng tính kháng loại vi sinh vật khác cụ thể nhƣ sau: tính kháng cao vi khuẩn Shigella với đƣờng kính vòng kháng 1,92 cm vi khuẩn Bacillus cereus với đƣờng kính kháng 1,83 cm.tính kháng thấp vi khuẩn E.coli với đƣờng kính vịng kháng 1,21cm vi khuẩn Salmonella với đƣờng kính vịng kháng 1,53 cm 3.7 Xác định hàm lƣợng vitamin C Vitamin C hay Acid Ascorbic chất dinh dƣỡng quan trọng cho loài linh trƣởng bậc cao số lồi nhỏ khác Chức vitamin C chống lão hóa, ngăn ngừa bênh ung thƣ, tăng hệ miễn dịch chất chống oxi hóa mạnh quan trọng Hoa Súp lơ xanh loại thực vật có hàm lƣợng vitamin C cao, 100g hoa Súp lơ xanh có chƣa 75-90mg vitamin C, Bảng 3.10 Hàm lƣợng viatamin C hoa Súp lơ ST T Kí hiệu mẫu Khối lƣợng mẫu(g) Tổng thể tích mẫu lấy chuẩn độ (ml) M1 5,002 100 M1 5,0036 100 M3 5,023 100 Thể Thể Nồng tích tích độ Nồng độ mẫu Iot vitamin Vitamin lấy 0,001N C C TB chuẩn chuẩn (mg/100 (mg/100g) độ(ml) độ(ml) g) 10 4,56 80,23 80,48 ± 10 4,5385 79,82 0,814 10 4,6457 81,39 Kết theo thí nghiệm cho thấy hàm lƣợng vitamin C Hoa Súp lơ cao so với loại thực vật khác, 100g hoa Súp lơ xanh có chƣa 80,48mg vitamin C 38 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận - Đã xác định đƣợc độ ẩm hoa Súp lơ xanh cao 79,13% - Đã xác định đƣợc loại cồn phù hợp cho q trình trích ly phƣơng pháp đo OD ethanol - Đã tối ƣu đƣợc phƣơng pháp tách chiết flavonoid phƣơng pháp ngâm chiết: hiệu suất trích ly flavonoid hoa Súp lơ lên đến 3,35% - Đã tối ƣu đƣợc số điều kiện trình tách chiết flavonoid từ hoa Súp lơ xanh kết xác định đƣợc nồng độ ethanol 90%, nhiệt độ 60ºC, tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi 1/15 với thời gian chiết 24h - Đã định tính đƣợc có mặt flavonoid có cao chiết hoa Súp lơ xanh phản ứng màu đặc trƣng nhƣ: phản ứng màu xanh đen với FeCl3 phản ứng màu vàng cam NaOH Phƣơng pháp chạy sắc ký lớp mỏng thành cơng, quan sát thấy có vết tách từ flavonoid tách chiết từ hoa Súp lơ xanh - Đã xác định đƣợc flavonoid chiết suất từ hoa Súp lơ xanh có tính kháng số loại vi sinh vật kiểm định nhƣ kháng cao Vi khuẩn Shigella vi khuẩn Bacillus cereus có tính kháng thấp với vi khuẩn E.coli vi khuẩn Salmonella - Đã xác định đƣợc hàm lƣợng vitamin C hoa Súp lơ xanh cao 80,48% 4.2 Kiến nghị - Tiếp tục khảo sát thêm yếu tố ảnh hƣởng đến q trình trích ly flavonoid từ Hoa Súp lơ xanh - Nghiên cứu sử dụng thêm phƣơng thức trích ly khác để thu đƣợc flavonoid với kết cao - Xác định thêm hàm lƣợng vitamin có Hoa Súp lơ xanh 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO I TIẾNG VIỆT Đỗ Trung Đàm (2006), phƣơng pháp nghiên cứu tác dụng dƣợc lý thuốc từ thảo dƣợc, Nhà xuất KH &KT, Hà nội Ngô Văn Thu Trần Hùng., Dƣợc liệu học 2011 Nhà xuất Y học Bộ Y tế Nguyễn Quốc Khang, Hà Thị Thanh Bình (1999) Góp phần nghiên cứu số hoạt tính sinh học flavonoid Đu đủ (Carica papaya L.) Tạp chí Dược học, số 6, 15-17 Phạm Kim Mãn cộng (2001) Nghiên cứu thuốc Panacrin ức chế đƣợc sử dụng điều trị ung thƣ Tạp chí Dược liệu, 6, 58-62 Hà Thị Bích Ngọc, Trần Thị Huyền Nga, Nguyễn Văn Mùi (2007) Điều tra hợp chất số lồi thực vật Việt Nam Tạp chí khoa học ĐHQGHN, Khoa học tự nhiên Công nghệ, 23, 130-134 Đỗ Thị Thảo (2006) Nghiên cứu khả phịng chống ung thƣ chất hóa học số thuốc Việt Nam Luận án tiến sĩ sinh học Lại Thị Ngọc Hà, Vũ Thị Thƣ Stress oxi hóa chất chống oxi hóa tự nhiên tạp chí Khoa học Phát triển 2013 2009 Nguyễn Duy Thịnh, Giáo trình Cơng Nghệ chè, Trƣờng Đại Học Bách Khoa Hà Nội, 2004 Đỗ Thị Hoa Viên, Nghiên cứu khảo sát hoạt chất flavonoid mơ Prunus armeniaca (họ Rosaceae) Tạp chí Khoa học công nghệ 2007 45(2): p 49- 53 10 Nhà xuất Nông Nghiệp, (2015) Danh mục loại thực vật Việt Nam, Đại học Quốc Gia Hà Nội Trung tâm tài nguyên môi trƣờng II TIẾNG ANH 11 10 Zietz M., Annika W., Schmidt S., Rohn S., Schreiner M., Krumbein A., Kroh L.W Genotypic and Climatic Influence on the Antioxidant Activity of Flavonoids in Kale (Brassica oleracea var sabellica) J.Agric.Food Chem 2010;58:2123–2130.doi:10.1021/jf9033909 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 11 Arvind G, Bhowmik D, Duraivel S, Harish G (2013), “Traditional and medicinal uses of Carica papaya, Journal of Medicinal Plants Studies; 1:23203862 12 Reilly K, Valverde J, Finn L, Rai D.K, Brunton N, Sorensen J.C, Sorensen H, GaffneyM.Potential of cultivar and crop management to affect phytochemical content in winter-grown sprouting broccoli (Brassica oleracea L var italica) J.Sci.FoodAgric 2013;94:322–330.doi: 10.1002/jsfa.6263 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 13 Kris-Etherton P., Lefevre M, Beecher G, Gross M, Keen C, Etherton T Bioactive compounds in nutrition and health-research methodologies for establishing biological function: The antioxidant and anti-inflammatory effects of flavonoids on atherosclerosis Annu Rev Nutr 2004;24:511–538 doi: 10.1146/annurev.nutr.23.011702.073237 14 Tajul AY, Boshra V, (2013), “Papaya - An Innovative Raw Material for Food and Pharmaceutical Processing Industry” Health and the Environment Journal, Vol 4, No.1 15 Ayoola GA, Coker HAB, Adesegun SA, Adepoju-Bello AA, Obaweya K., Ezennia EC, Atangbayila (2008) “Phytochemical screening and Antioxidant activity of selected medicinal plants used for the treatment of malaria in southwest Nigeria” Tropical Journal of Pharmaceutical Research, (3) 16 Aysun Ozkan, Hamide gubbuk, Gunes Esma, Ayse Erdogan (2011) “The Antioxidant capacity of different papaya fruit juices (Carica papaya L.) was grown under greenhouse conditions in Turkey” Turkish Journal of Biology, 619-625 17 Dai J, R J Mumper, “Plant Phenolics: Extraction Analysis and Their Antioxidant and Anticancer Properties” Molecules 2010.15: p 7313-7352 18 Grotewold E, (2006)” The Science of Flavonoids” New York: Springer Science Business Media Inc 19 Ikeyi Adachukwu P, Ann O, Eze Faith U, (2013), “phytochemical analysis of paw-paw (carica papaya) leaves”, International journal of life science biotechnology and pharma research, Vol 2, No 20 Indranil Bhattacharjee, Soroj Kumar Chattarjee, Anupam Ghosh, Goutam Chandra (2011) “Antimicrobial activity of some plant extracts used in traditional Indian folk medicine” Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 165-169 21 J B Harborne and C.A.Williams, (2000) “Review: Advances in flavonoid research since 1992” Phytochemistry 55: p 481 -504.13 Kalpna Rakholiya, Sumitra Chanda (2012) “Invitro interaction of certain antimicrobial agents in combination with plant extracts against some strains of pathogenic bacteria” Asia Pacific Tropical Medicine Journal, 876-880 22 Maisarah AM, Nurul Amira B., Asmah R Fauziah O (2013) “Antioxidant analysis of different parts of Carica papaya” Journal of International Food Research, 20 (3), 1043-1048 23 McCully KS (1998) “Homocysteine, folate, vitamin B6, and cardiovascular disease” The Journal of the American Medical Association 279:392-3 24 Mohamad F M Bukhori, A N Rahman, N Khalid, A H Rashid, and M M Diah, “The Supercritical fluid extraction of alkaloids from papaya (Carica papaya L var Eksotika) leaves” Borneo Journal of Resource Science & Technology 4(2), pp 35– 49, 2014 25 Moses Alo, Ukpai Agwu Eze, Chukwudi Anyim (2012) “Invitro antimicrobial activity of indica magnifera extract, papaya and guava leaves on salmonella typhi isolated” World Journal of Public Health, (1): 26 Noriko Otsuki, Nam H Đằng, Emi Kumagai, Akira Kondo, Satoshi Iwata, Chikao Morimoto (2010) “Carica juice extract of papaya leaves exhibited anti- tumor activity and immune efects” Journal of Ethnopharmacology 127, 760- 767 27 Okunola A, Alabi, Muyideen T Haruna, Chinedu P Anokwuru, Tomisin Jegede, Harrison Abia, Victor U Okegbe Babatunde E ESAN (2012) “Comparative study on antimicrobial properties of fresh and dried leaf extract of Carica papaya L on bacterial and clinical fungal íolation” Advances in Applied Research Science (5), 3107-3114 28 “Pantothenic Acid” Linus Pauling Institute at Oregon State University Micronutrient Information Center 29 Peterson J J, Beecher G R, Bhagwat S A, Dwyer J T, Gebhardt S E, Haytowitz D B, “Flavanones in grapefruit, lemons, and limes: A compilation and review of the data from the analytical literature” Journal of Food Composition and Analysis, 2006, 19, 74–80 30 Re R, Pellegrini N, Proteggente A, Pannala A, Yang M, Rice Evans, “Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization asay” Free radical biology and medicine 1999 26: p.1231 – 1237 31 Rehman Z U (2006) “Citrus peel extract – A natural source of antioxidant” Food Chemistry, 99, 450–454 32 Richards, Oscar W (1938) “The Stimulation of Yeast Proliferation By Pantothenic Acid” (PDF) Journal of Biological Chemistry 113 (2): 531–536 33 Segovia R G, (2008) “Effect of the flavonoid quercetin on inflammation and lipid peroxidation induced by Helicobacter pylori in gastric mucosa of guinea pig” Journal of Gastroenterol 43: p 441-447 34 Suresh K, Deepa P, Harisaranraj R Vaira Achudhan V (2008) “Antimicrobial and Phytochemical Investigation of the Leaves of Carica papaya L, Cynodon dactylon (L.) Pers, Euphorbia hirta L, Melia azedarach L and Psidium guajava L.” Ethnobotanical Leaflets 12: 1184-1191 35 Swain J, Goldstein J L (1963), “Methods in polyphenol chemistry” Proceedings of the plant phenolics group symposium, Oxford 36 Thảo TT Nguyễn, Paul N Shaw, Marie-Odile PARAT Amitha K Hewavitharana (2013) “Carica's anti-cancer activity” Molecular Nutrition & Food Research 153-164 37 Aravind G, Debjit Bhowmik, Duraivel S, Harish G (2013) “Traditional use and healing of papaya” Journal of Medicinal Plants Research, vol III WEB https://en.m.wikipedia.org/wiki/Papaya ... Sup lơ Xanh với đề tài khóa luận ? ?Nghiên c? ??u trích ly flavonoid x? ?c định hàm lượng vitamin C hoa Súp lơ xanh? ?? CHƢƠNG TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN C? ??U 1.1 Giới thiệu Súp lơ xanh 1.1.1.Tên khoa h? ?c, ... đến q trình trích ly flavonoid từ Hoa Súp lơ xanh - Nghiên c? ??u sử dụng thêm phƣơng th? ?c trích ly kh? ?c để thu đƣ? ?c flavonoid với kết cao - X? ?c định thêm hàm lƣợng vitamin c? ? Hoa Súp lơ xanh 39 TÀI... tử g? ?c tự [56] 17 CHƢƠNG : NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN C? ??U 2.1 M? ?c tiêu nghiên c? ??u Trích ly đƣ? ?c flavonoid x? ?c định đƣ? ?c hàm lƣợng vitamin C hoa Súp lơ xanh, làm sở cho đề xuất phƣơng án chiết