Nghiên cứu tách chiết flavonoid và xác định hàm lượng vitamin c của lá cây chùm ngây guilandina moringa lam

LỜI CẢM ƠN Kết thúc bốn năm học tập nghiên cứu Viện Công nghệ Sinh học, trƣờng Đại học Lâm nghiệp Việt Nam, đƣợc cho phép Viện trƣởng giúp sức quý thầy cô ngành, năm học 2017-2018 này, em tiến hành làm khóa luận với đề tài: “Nghiên cứu tách chiết flavonoid xác định hàm lượng vitamin C Chùm Ngây (Guilandina moringa Lam)” Để hồn thành tốt luận khơng thể khơng kể đến giúp sức quý thầy cô công tác giảng dạy Viện Công nghệ Sinh học trƣờng Đại học Lâm nghiệp Việt Nam, gia đình nhƣ bạn bè bên, đồng hành ủng hộ em suốt quãng thời gian dài Lời đầu tiên, cho phép em đƣợc gửi lời biết ơn sâu sắc chân thành đến cô giáo trực tiếp hƣớng dẫn khóa luận - Thạc sỹ Nguyễn Thị Thu Hằng ngƣời thầy khoa học định hƣớng tận tình bảo, truyền đạt cho em kiến thức kinh nghiệm quý báu cách nghĩ, tiếp cận cách giải vấn đề, tác phong làm việc, giúp đỡ em suốt thời gian thực tập tốt nghiệp hoàn thành luận văn Em xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo anh chị bạn viện Công nghệ sinh học, Trƣờng Đại học Lâm Nghiệp quan tâm giúp đỡ em, thầy cô trang bị kiến thức quý báu suốt thời gian học tập thực tập tốt nghiệp vừa qua Em xin phép đƣợc gửi lời cảm ơn đến thầy cô giáo chị Nguyễn Thị Hồng Nhung Bộ môn Cơng nghệ Vi sinh Hóa sinh hỗ trợ tạo điều kiện trang thiết bị, điều kiện thực nghiệm cách tốt để em hồn thành khóa luận Cuối c ng, xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới bố mẹ, ngƣời vất vả nuôi dƣỡng dạy dỗ nên ngƣời, ngƣời uôn uôn h ch ệ, động viên, tin tƣởng ủng hộ tới ngày hôm nay! Tuy đƣợc bảo tận tình ThS Nguyễn Thị Thu Hằng thầy cô viện với sợ nỗ lực thân cố gắng để hoàn thiện uận văn này, song iến thức, inh nghiệm em c n hạn chế ,vậy nên báo cáo hoa học hông tránh h i sai sót, nh mong thầy đóng góp ý iến đánh giá, để báo cáo em đƣợc hoàn thiện Một lần em xin chân thành cảm ơn! i M PHẦN 1: TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Giới thiệu Chùm Ngây 1.1.1 Phân loại 1.1.2 Đặc điểm thực vật phân bố 1.1.3 Thành phần hóa học Chùm Ngây 1.1.4.Tác sụng sinh học Chùm Ngây 1.1.5 Tình hình nghiên cứu Chùm Ngây giới nước 1.1.6 Tình hình nghiên cứu Chùm Ngây Việt Nam 11 1.2 Hợp chất chống oxi hóa 12 1.2.1 Khái niệm 12 1.2.2 Phân loại hợp chất có tác dụng chống oxy hóa 12 1.3 Hợp chất Flavonoid 13 1.3.1 Khái niệm flavonoid 13 1.3.2 Cấu trúc chung phân loại 13 1.3.3 Tính chất lý hóa flavonoid 17 1.3.4 Hoạt tính sinh học flavonoid 18 PHẦN 2: NỘI DUNG, MỤC TIÊU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 19 2.2 Nội dung nghiên cứu 19 2.3 Vật liệu nghiên cứu 19 2.4 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất nghiên cứu 19 2.5 Phƣơng pháp nghiên cứu 20 2.5.1 Xác định độ ẩm bột Chùm Ngây 20 2.5.2 Xác định làm lượng vitamin C Chùm Ngây 21 2.5.3 Tách chiết hợp chất flavonoid theo phương pháp B.C.Talli 23 2.5.4 Tối ưu số điều kiện trình tách chiết theo quy trình 23 2.5.5 Xác định có mặt flavonoid dịch chiết 25 2.5.6 Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật flavonoid 26 PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 3.1 Xác định độ ẩm bột Ch m Ngây xác định hàm ƣợng vitamin C Chùm Ngây 28 3.1.1 Xác định độ ẩm bột Chùm Ngây 28 3.1.2 Xác định hàm lượng vitamin C Chùm Ngây 30 3.2 Tối ƣu số điều kiện trình tách chiết 30 3.2.1 Xác định ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu trích ly flavonoid 30 3.2.2 Xác định ảnh hưởng nồng độ ethanol đến hiệu trích ly flavonoid 31 3.2.3 Tỷ lệ mẫu/dung môi 32 3.2.4 Thời gian ngâm chiết 33 3.3 Xác định có mặt flavonoid trịn dịch chiết phƣơng pháp 34 3.3.1 Định tính flavonoid phản ứng màu đặc trưng 34 3.3.2 Định tính flavonoid phương pháp chạy sắc ký lớp mỏng 35 3.4 Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định flavonoid 35 CHƢƠNG : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38 4.1 Kết luận 38 4.2 Kiến nghị 38 ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, xã hội phát triển nhu cầu chất dinh dƣỡng cao, màu sắc thực phẩm đƣợc cải thiện nhằm tăng giá trị cảm quan cho thực phẩm Chất màu yếu tố quan trọng nhằm mục đ ch Một chất tạo màu tiêu biểu flavonoid, flavonoid nhóm hợp chất po ypheno thƣờng gặp thực vật Các flavonoid nhóm hợp chất phong phú đa dạng vào bậc thiên nhiên, có mặt khơng thực vật bậc cao mà số thực vật bậc thấp, chí cịn có loài tảo Hơn nửa rau thƣờng dùng có chứa flavonoid chúng thành phần hay gặp dƣợc liệu có nguồn gốc thực vật Cho đến nay, flavonoid lớp chất đƣợc nhà hoá học hợp chất thiên nhiên quan tâm nghiên cứu Có khoảng 11000 hợp chất f avonoid đƣợc biết cấu trúc Flavonoid khơng có giá trị mặt cảm quan mà đƣợc khai thác, sử dụng nhiều ĩnh vực: thực phẩm, mỹ phẩm có ý nghĩa đặc biệt quan trọng y dƣợc học Flavonoid có ứng dụng y học để điều trị số bệnh nhƣ: viêm nhiễm, dị ứng, loét dày hành tá tràng, giúp thể điều hồ q trình chuyển hố, chống lão hố, làm bền thành mạch máu, giảm ƣơng cho estero máu…Với nhà hố sinh flavonoid chất chống oxi hoá mạnh Hiện nay, nhiều f avonoid đƣợc phân lập từ thực vật Ch m ngây đƣợc xem loài thực vật chứa hợp chất thiên nhiên có tác dụng làm chậm q trình lão hố đột biến tế bào thể Việt Nam nƣớc có khí hậu nhiệt đới ẩm gió mùa Là điều kiện tốt cho sinh trƣởng phát triển nhiều oài động thực vật, đặc biệt với loại chịu hạn nhƣ: Phi lao, Hƣơng thảo, Chùm ngây, Keo,…Chùm ngây đƣợc trồng khắp giới chủ yếu Ấn Độ, Hy Lạp, Châu Phi,Châu Á( có Việt Nam) Việt Nam, Ch m ngây đƣợc trồng nhiều tỉnh miền Nam sau đƣợc nhân rộng tỉnh miền Bắc Với nguồn nguyên liệu dồi chùm ngây phong phú với việc nhận thấy ý nghĩa, tầm quan trọng hoạt chất chống lão hóa đời sống nhƣ ĩnh vực nghiên cứu khoa học, em tiến hành tách chiết flavonoid với đề tài khóa luận tốt nghiệp à: “Nghiên cứu tách chiết hợp chất flavonoid vitamin C Chùm Ngây Guilandina moringa Lam” PHẦN 1: TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Giới thiệu Chùm Ngây 1.1.1 Phân loại Cây Chùm ngây hay gọi Chùm Ngây Cải Ngựa, tên khoa học Moringa oleifera Lam, thuộc hệ thống phân loại nhƣ sau[1]: Giới: Plantea Ngành: Magnoliophyta Lớp: Magnoliopsida Phân lớp: Dilleniidae Bộ: Capparales Họ: Moringaceae Chi: Moringa Adans Loài: Moriga oleifera Lam Chi Moringa chi họ Chùm ngây Moringaceae.Với 13 loài tất loài thân gỗ thích hợp với khí hậu khu vực nhiệt đới cận nhiệt đới Loài phổ biết Chi Moringa Chùm ngây (Moriga oleifera Lam) đƣợc trồng nhiều nơi khu vực nhiệt đới, loài chi Moringa đƣợc trồng Việt Nam [2] 1.1.2 Đặc điểm thực vật phân bố Cây Chùm Ngây nh hay nhỡ cao khoảng 5-10m V dày, có khía rãnh.Thân non có long, kép, mọc so le, dài 30-60cm, có 6-9 đơi chét hình trứng, mọc đối Hoa thơm, màu trắng giống hoa họ Đậu Cây hoa vào tháng 1-2 Quả Chùm Ngây dạng nang treo, có thiết diện tam giác, dài 25-30 cm hay hơn, mở làm mảnh, hạt có cạnh có màu trắng, dạng màng [2] Chùm Ngây loài nhiệt đới cận nhiệt đới, thích hợp với đất cát khơ có khả chịu hạn hán Theo số báo cáo Chùm Ngây sinh trƣởng tốt dải nhiệt độ từ 18,7-28,5oC pH khoảng 4,5-8 [21] Cây Chùm Ngây có nguồn gốc Tây Bắc Ấn Độ, sau đƣợc đƣa vào trồng rộng rãi Ấn Độ, Hy Lạp, Philippin, Thái Lan, Ma aysia, Cuba ,… Ngoài ra, Chùm Ngây c n đƣợc phát có phân bố Châu Phi, Madagascar Ở Việt Nam, Chùm Ngây mọc hoang đƣợc trồng nhiều tỉnh phía Nam từ Đà Nẵng, Nha Trang, Phan Thiết vào đến Kiên Giang đảo Phú Quốc [2] A B C D Hình 1.1: Một số hình ảnh hình thái Chùm Ngây (Guilandina moringa Lam)[2] A Thân Chùm Ngây C Lá Chùm Ngây B Hoa Chùm Ngây D Quả Chùm Ngây 1.1.3 Thành phần hóa học Chùm Ngây Các phận Chùm Ngây chứa nhiều chất khống quan trọng, nguồn cung cấp đạm amino acid, vitamin, beta-carotene, nhiều hợp chất phenolic Chùm Ngây cung cấp hỗn hợp nhiều hợp chất nhƣ zeatin, quercetin kaempferol Kết phân t ch hàm ƣợng dinh dƣỡng quả, tƣơi bột khơ Chùm Ngây đƣợc tóm tắt nhƣ Bảng 1.1 [11]: Bảng 1.1: Một số thành phần hóa học Chùm Ngây STT 10 11 12 13 14 15 16 Thành phần dinh dƣỡng/100g Protein(g) Chất béo (g) Carbohydrat(g) Chất xơ (g) Chất khoáng(g) Ca (mg) Mg (mg) P (mg) K (mg) Cu (mg) Fe (mg) S (mg) Oxalic acid (mg) Vitamin A (mg) Vitamin B (mg) Vitamin B1 (mg) Quả tƣơi Bột 2,5 0,1 3,7 4,8 2,0 30 24 110 259 3,1 5,3 137 10 0,11 423 0,5 6,7 1,7 13,4 0,9 2,3 440 25 70 259 1,1 7,0 137 101 6,8 423 0,21 27,1 2,3 38,2 19,2 2003 368 204 1324 0,054 28,2 870 1,6 1,6 2,64 Kết xác định thành phần dinh dƣỡng Chùm Ngây phong phú với hàm ƣợng dinh dƣỡng bột Chùm Ngây cao Các nhà khoa học nghiên cứu hàm ƣợng dinh dƣỡng ƣu việt Chùm Ngây thực phẩm, trái tiêu biểu thƣờng d ng nhƣ : cam, cà rốt, sữa, cải bó xơi, yaourt chuối so sánh trọng ƣợng [16]: Hình 1.2: So sánh hàm lƣợng dinh dƣỡng Chùm Ngây số thực phẩm giàu dinh dƣỡng thơng dụng [3] Nhìn chung, Chùm Ngây có hàm ƣợng vitamin C nhiều gấp lần trái cam có tác dụng tăng cƣờng hệ thống miễn dịch thể, chống oxi hóa chữa trị bệnh ây an nhƣ cảm cúm Hàm ƣợng canxi Chùm Ngây cao, cao sữa lần giúp bổ sung canxi cho xƣơng, ngăn ngừa oãng xƣơng Hàm ƣợng Kali nhiều chuối lần kali chất cần thiết cho óc hệ thần kinh.Vitamin A Chùm Ngây nhiều cà rốt lần giúp chống lại chứng bệnh mắt, da tim, đồng thời ngăn ngừa tiêu chảy chứng bệnh thông thƣờng hác…Protein nhiều sữa lần, có vai trị quan trọng thể ngƣời động vật có vai trị tạo nên cấu trúc thể 1.1.4.Tác sụng sinh học Chùm Ngây Lá Chùm Ngây phòng bệnh ung thƣ, thối hóa, xơ nang Lá Chùm Ngây có chứa 46 loại chất chống oxy hóa, đặc biệt vitamin C vitamin A Đây chất chống oxy hóa vơ quan trọng sức kh e ngƣời Các chất chống oxy hóa giúp trung h a tác động tàn phá gốc tự do, từ bảo vệ kh i bệnh ung thƣ bệnh thối hóa nhƣ thối hóa điểm vàng bệnh xơ nang Tốt cho bắp, xƣơng, da máu Lá Chùm Ngây giàu amin acid có chứa 18 amin acid, có amin acid thiết yếu (isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalaine, threonine, tryptohyan, valine) nên loài chứa protein “hoàn hảo’ loại giới thực vật Hỗ trợ điều trị tăng cho estero , tăng ipid máu, tăng trig ycerit, àm giảm uric acid, ngăn ngừa s i oxalate Giúp ổn định huyết áp đƣờng huyết, bảo vệ gan, trị suy nhƣợc Điều trị u xơ tiền liệt tuyến phịng ngừa ỗng xƣơng, với hàm ƣợng canxi magie phong phú, Chùm Ngây trở thành loại thực vật có tác dụng tốt cho xƣơng bạn bạn bổ sung chúng qua ăn uống dùng để pha trà Canxi dƣỡng chất cần thiết để xây dựng xƣơng răng, c n magiê lại giúp thể hấp thụ canxi tốt Vì Ch m Ngây chứa nhiều hai dƣỡng chất này nên đặc biệt tốt cho bạn việc phịng ngừa bệnh ỗng xƣơng bệnh xƣơng hác Chùm Ngây chứa cytokinin – loại kích thích tố thực vật tạo phân chia tế bào, tăng trƣởng, làm chậm trình lão hóa tế bào Các nghiên cứu lâm sàng cho thấy Chùm Ngây sản xuất đặc tính chống lão hóa ngƣời [4] 1.1.5 Tình hình nghiên cứu Chùm Ngây giới nước 1.1.4.1 Tình hình nghiên cứu Chùm Ngây giới Trên giới có nhiều nghiên cứu trích ly ứng dụng hoạt chất sinh học Chùm Ngây Theo cơng trình nghiên cứu Suphachai Charoensin tạp chí Medicinal Plant Research (2012), 15(g) bột Chùm Ngây trích ly với 350 m methano , hàm ƣợng phenolic flavonoid tổng số lần ƣợt 261,45 65,38 (mg đƣơng ƣợng gallic acid/g chiết xuất) [19] Boonyadist Vongsak CS (2013) nghiên cứu tr ch ly Chùm Ngây để hàm ƣợng phenolic flavonoid tổng số lớn điều kiện sử dụng dung môi cồn ethanol 70% thu đƣợc hàm ƣợng phenolic flavonoid tổng số lần ƣợt 13,23 6,20g/100g chiết xuất [10] Nghiên cứu Đại học Baroda, Kalabhavan, Gujarat (Ấn Độ) hoạt tính thông số lipid Chùm Ngây, thử th , ghi nhận: th cho ăn Chùm Ngây (200mg/kg ngày) hay uống lovastatin (6mg/kg/ngày) trộn hỗn hợp thực phẩm có tính cách tạo cholesterol cao, thử nghiệm kéo dài 120 ngày Kết cho thấy th ăn Chùm Ngây hay uống lovastatin có tác dụng làm hạ cholesterol, phospholipid, triglycerid, hạ tỷ số cholesterol/phospholipid máu so với th nhóm đối chứng [18] Dịch chiết thơ Chùm Ngây có hoạt tính làm giảm đáng ể cholesterol huyết chuột thí nghiệm có chế độ ăn giàu chất béo Đƣợc cho có mặt thành phần hóa học β-sitosterol Nghiên cứu hoạt tính kháng nấm gây bệnh, nghiên cứu Institute of Bioagricu tura Sciences, Academia Sinica, Đài Bắc (Đài Loan) ghi nhận dịch chiết từ hạt Chùm Ngây ethanol có hoạt tính diệt đƣợc nấm gây bệnh loại Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophyte, Epidermophyton floccosum Microsporum canis [15] Dịch chiết nƣớc nóng hoa, lá, rễ, hạt, v thân Ch m Ngây đƣợc nghiên cứu Trung tâm nghiên cứu kỹ thuật (CEMAT) Guatamala City hoạt t nh dƣợc học, thử chuột Hoạt tính chống co giật đƣợc chứng minh thử nghiệm chuột ập, hoạt tính chống sƣng thử chân chuột bị gây phù carrageenan tác dụng lợi tiểu ƣợng nƣớc tiểu thu đƣợc chuột đƣợc ni nhốt lồng Nƣớc trích từ hạt cho thấy tác động ức chế rõ co giật gây acetylcholin liều ED50= 65,6 mg/m môi trƣờng; tác động ức chế phụ gây carrageenan đƣợc định 1000mg/kg hoạt tính lợi tiểu 1000 mg/kg Những nghiên cứu t nh dƣợc lý Chùm Ngây đƣợc tiến hành rộng rãi, cho thấy thành phần dịch chiết cồn có hoạt tính chống co thắt, thong qua việc phong t a kênh calci Hoạt tính chống co thắt dịch chiết cồn Chùm Ngây có mặt hợp chất 4-[α-[L-rhamnosyloxy] benzyl]o-metyl thiocarbamat Đây sở để lý giải Chùm Ngây đƣợc dùng để chữa bệnh tiêu chảy y học dân gian Ngồi ra, hoạt tính chống co thắt từ thành phần hác c n sở dƣợc ý để oài đƣợc sử dụng điều trị rối loạn nhu động ruột Dịch chiết methanol Chùm Ngây thể hoạt tính chống viêm loét bảo vệ gan chuột Dịch chiết nƣớc có hoạt tính chống viêm lt cho thấy phức hợp chống viêm loét phổ biến oài Cũng có nghiên cứu cơng bố rễ Chùm Ngây có hoạt tính bảo vệ gan Dịch chiết nƣớc dịch chiết cồn hoa Chùm ngây 10 - Chất chuẩn quercetin: hịa tan quercetin dạng bột khô cồn 70° chấm giếng m ng - Hòa tan mẫu flavonoid tách chiết theo quy trình ethyacetat - Dùng pipet hút mẫu h a tan chấm lên m ng, khoảng cách vết chấm cách bờ dƣới 1cm, hai bờ bên 0,5cm khoảng cách vết chấm cách 0,6cm K ch thƣớc vết chấm cách vừa phải Triển khai m ng: - Chuẩn bị bình triển khai: rửa sạch, sấy khơ - Pha hệ dung mơi triển khai vào bình lần ƣợt theo tỷ lệ xác định: ethyaxetat:to uen:axit fomic:nƣớc = 7:3:1,5:1 - Đặt giấy lọc vào bình triền khai - Bão hịa dung mơi bình triển khai từ 15-20 phút - Dùng kẹp cho m ng chấm mẫu vào bình triển hai, đậy nắp bình lại - Theo dõi vạch dung môi di chuyển đến cạnh mép m ng khoảng 0,5 cm lấy m ng kh i bình triển khai - Sấy nhẹ m ng để đuổi hết dung môi - Phát vết qua màu sắc tự nhiên 2.5.6 Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật flavonoid Các loại môi trƣờng sử dụng nghiên cứu xác định hoạt tính kháng vi sinh vật flavonoid: Bảng 2.1: Môi trƣờng nuôi cấy chủng vi sinh vật Môi trƣờng PDA nuôi cấy nấm mốc Aspergillus niger Thành phần môi trƣờng g/l 200g(đun sôi dịch triết) Dịch ch iết khoai tây Suczose 20g Agar 16g Hòa tan dẫn nƣớc đến 1000ml điều chỉnh pH= 6,5 Môi trƣờng LB nuôi cấy vi khuẩn E.coli, Salmonella 26 Thành phần môi trƣờng g/l Pepton 10g Chiết suất nấm men (yeast extrart) 5g NaCl 5g Agar 16g Hòa tan dẫn nƣớc đến 1000ml điều chỉnh pH= 7,0 Môi trƣờng Hansen nuôi nấm cấy men Saccharomyces cerevisiae Thành phần môi trƣờng g/l Pepton 10g K2HPO4 3g MgSO4.7H2O 2g Agar 16g Hòa tan dẫn đến 1000ml với pH=6,5- 7,0 Các bƣớc tiến hành: -Khử trùng bàn tay cồn 70% trƣớc cho tay vào box cấy -Đổ môi trƣờng chuẩn bị vào đĩa petri tr ng để khoảng 30 phút cho mặt thạch thật khô -Dùng pipet man vô trùng nh dịch chủng vi sinh vật đƣợc nuôi lên sinh khối môi trƣờng l ng ên đĩa môi trƣờng -Dùng que trang trải lên khắp mặt thạch -Sau tiến hành đục lỗ đầu lớn pipet -Dùng pipet vô trùng nh 0,1ml dịch flavonoid (đã pha oãng 0,15g/ml nƣớc) vào lỗ thạch để tủ lạnh h sau để tủ ấm nhiệt độ 50°C Sau 24-48 quan sát vòng kháng vi sinh vật tạo thành 27 PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Xác định độ ẩm bột Chùm Ngây xác định hàm lƣợng vitamin C Chùm Ngây 3.1.1 Xác định độ ẩm bột Chùm Ngây Độ ẩm thể ƣợng nƣớc có mẫu, sấy khơ mẫu tƣơi bột khô Chùm Ngây để xác định độ ẩm mẫu thông qua nhiệt độ làm giảm ƣợng nƣớc có mẫu Độ ẩm cao ƣợng nƣớc nhiều ngƣợc lại Kết số liệu đĩa cân, mẫu đƣợc thống kê cụ thể bảng: Bảng 3.1: Độ ẩm bột Chùm Ngây Mẫu Khối Khối Khối Khối Độ ẩm Độ ẩm trung ƣợng ƣợng ƣợng đĩa ƣợng H (%) bình (%) đĩa cân mẫu (g) cân đĩa cân (m) trƣớc sau sấy (mo) sấy (m1) Lá L1 220,50 13,8 234,3582 223,7432 76,60 Chùm L2 236,00 14,0 250,0736 239,2161 77,15 ngây L3 203,70 15,0 219,2724 207,0926 78,20 Bột B1 33,80 5,0065 38,8065 38,4128 7,86 Chùm B2 37,49 5,0098 42,5011 42,1159 7,68 ngây B3 35,96 5,0033 40,9633 40,5825 7,61 77,23±0,55 tƣơi khô 28 7,72±0,25 A B Hình 3.1: Hình ảnh Chùm Ngây trƣớc sau sấy ( A) bột Chùm Ngây trƣớc sau sấy( B) Qua Bảng 3.1 cho thấy độ ẩm trung bình Chùm Ngây 77,23% độ ẩm bột hô 7,72% Độ ẩm trung bình bột khô Chùm Ngây cao chứng t vi sinh vật, nấm mốc dễ xâm nhiễm làm h ng.Vì vậy, cần có phƣơng pháp bảo quản an tồn cẩn thận để sử dụng Lá Chùm ngây sau sấy đến trọng ƣợng khơ tuyệt đối đƣợc nghiền làm bột khô tiếp tục sấy bột đến khối ƣợng hơng đổi làm mẫu cho thí nghiệm sau 29 3.1.2 Xác định hàm lượng vitamin C Chùm Ngây Chuẩn độ có màu xanh lam nhạt đƣợc ghi dƣới bảng số liệu sau: Bảng 3.2: Nồng độ vitamin C thời kỳ Chùm Ngây Loại Ký Khối Tổng Thể Thể Nồng độ Nồng độ hiệu ƣợng thể tích tích Iốt Vitamin C Vitamin C mẫu mẫu tích mẫu 0,001N (mg/100g) TB (g) dịch lấy chuẩn mẫu chuẩn độ (ml) (ml) độ (mg/100g) (ml) Lá BT1 5,0002 100 10 5,55 97,676 bánh BT2 5,0036 100 10 5,6 98,489 tẻ BT3 5,0061 100 10 5,6 98,439 98,2 ± 0,813 Kết trình bày Bảng 3.2 cho thấy nồng độ vitamin C Chùm Ngây thời kỳ phát triển khác hác Trong đó, nồng độ Vitamin C non 81,8 mg/ 100g, bánh tẻ 98,2 mg/ 100g (là cao nhất), già 89,07 mg/100g Nhƣ vậy,hàm ƣợng vitamin C Ch m Ngây cao đồng nghĩa với tác dụng chống oxi hóa, lão hóa tốt ngƣời.Trong sau củ quả, vitamin C hầu nhƣ có mặt nhƣng cao loại rau mà đƣợc trồng đầy đủ ánh sáng Nếu tính số mg Vitamin C có 100g rau ăn đƣợc (mg%) theo “Bảng thành phần hóa học thức ăn Việt Nam” (Nhà xuất Y học – 1972), so với nồng độ vitamin C số loại giàu vitamin C hác nhƣ: dứa (10mg/100g), chuối (10mg/100g) nồng độ vitamin C Chùm Ngây cao 3.2 Tối ƣu số điều kiện trình tách chiết 3.2.1 Xác định ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu trích ly flavonoid Trải qua bƣớc tách chiết, lọc, cô cạn, tiến hành đo cân hối ƣợng, thu đƣợc kết sau: 30 Bảng 3.3: Tách chiết flavonoid điều kiện nhiệt độ khác Điều kiện nhiệt Mẫu độ Khối Khối ƣợng ƣợng flavonoid mẫu (g) (g) Khối ƣợng Hiệu suất flavonoid TB (g) trích ly theo TLĐTĐ (%w/w) Nóng (600C) Nhiệt độ phòng Lạnh (40C) N1 0,2219 N2 0,2497 N3 0,2331 T1 0,2109 T2 0,2038 T3 0,2125 L1 0,1825 L2 0,1630 L3 0,1948 0,2349 ± 0,028 11,74 0,2090 ± 0,01 10,45 0,1801 ± 0,032 9,01 Hình 3.2: Flavonoid thơ thu đƣợc sau tách chiết Qua Bảng 3.3 kết tách chiết flavonoid nhiệt độ 60°C có hiệu suất trích ly f avonoid cao so với nhiệt độ phòng nhiệt độ lạnh (4°C) chứng t tách chiết flavonoid nhiệt độ 600 thích hợp loại b đƣợc tạp chất béo, dầu, hidrocacbon, chất bột mẫu dung mơi đáp ứng tốt điều kiện nhiệt độ 3.2.2 Xác định ảnh hưởng nồng độ ethanol đến hiệu trích ly flavonoid Dung mơi ethanol ảnh hƣởng trực tiếp đến hiệu tách chiết flavonoid, loại b chất kh i nguyên liệu Vì f avonoid có độ phân cực mạnh nên dùng ethanol 31 methano nhƣng methano có t nh độc cao nên quy trình tách chiết flavonoid lựa chọn ethanol nồng độ hác để tách chiết Kết thể bảng sau: Bảng 3.4: Ảnh hƣởng nồng độ Ethanol quy trình tách chiết Nồng độ Mẫu ethanol Khối Khối ƣợng Khối ƣợng Hiệu suất trích ƣợng flavonoid trung bình ly tính theo mẫu (mg) (g) TLKTĐ (g) (%w/w) Ethanol B1 0,2054 96% B2 0,2080 B3 0,2056 Ethanol E1 0,2235 80% E2 0,2186 E3 0,2202 Ethanol M1 0,2325 60% M1 0,2365 M3 0,2312 N1 0,1579 N2 0,1658 N3 0,1600 Nƣớc 0,2097±0,023 10,48 0,2208±0,005 11,04 0,2324±0,005 11,62 0,1612±0,008 8,06 Qua Bảng 3.4 kết cho thấy hiệu suất trích ly flavonoid khác nồng độ ethanol khác nhau, cụ thể: ethanol 60% cho hàm ƣợng f avonoid cao đáng kể so với dung môi ethanol 96% , ethanol 80% nƣớc Tuy nhiên, ethanol 60% có hiệu suất f avonoid cao nhƣng độ hợp chất flavonoid trích ly ethanol 80% cao hiệu suất trích ly flavonoid 80% cao thấp hiệu suất trích ly flavonoid 60% 0,44% Vì vậy, dung mơi ethanol 80% dùng trình tách chiết phù hợp độ hiệu suất flavonoid tối ƣu 3.2.3 Tỷ lệ mẫu/dung mơi 32 Sử dụng dung mơi ethanol q trình tách chiết cho hiệu suất trích ly cao tỷ lệ mẫu phải tối ƣu dung môi ethanol phải phù hợp để tách chiết Tỷ lệ mẫu dung môi hác đƣợc thể bảng dƣới: Bảng 3.5: Tỷ lệ mẫu/ dung môi tách chiết Mẫu(g) Khối ƣợng bột Chùm ngây(g) Hàm ƣợng Hiệu xuất trích ly theo f avonoid thu đƣợc TLKTĐ(%w/w) (g) 1/10 0,2083 ± 0,028 10,41 1/15 0,2218 ± 0,032 11,09 1/20 0,2845 ± 0,037 11,23 Qua bảng 3.5 cho thấy tỷ lệ dung mơi tăng hiệu suất tách chiết tăng cụ thể là: từ tỷ lệ 1/10 đến 1/15 hiệu suất tr ch y tăng từ 10,41% lên 11,09% từ tỷ lệ 1/15 lên 1/20 hiệu suất tr ch y tăng hông đáng ể nhƣng tỷ lệ 1/20 đem ại hiệu suất trích ly cao nhất.Tuy tỷ lệ 1/20 có hiệu xuất tách chiết cao nhƣng lại tốn dung môi mà hiệu suất tăng ại hơng đáng ể Vì vậy, tỷ lệ 1/15 tối ƣu cho hiệu suất cao dung môi phù hợp 3.2.4 Thời gian ngâm chiết Thời gian ngâm ethanol 80% nhiệt độ 600 C khoảng thời gian hác đƣợc thể bảng dƣới: Bảng 3.6: Khối lƣợng tách chiết flavonoid theo mức thời gian khác Thời gian chiết Khối ƣợng flavonoid thô Hiệu suất trích ly theo (giờ) (g) TLKTĐ (%w/w) 0,2016 ± 0,018 10,08 0,2239 ± 0,024 11,12 10 0,2355 ± 0,032 11,77 12 0,2275 ± 0,027 11,38 Mẫu(g) 33 Kết bảng 3.6 cho thấy hàm ƣợng f avonoid tăng từ 5h đến 10h tăng nhanh thời gian 8h - 10h cụ thể: từ 5h hàm ƣợng flavonoid 10,8 % từ h 11,2% tăng 1,04% Từ 8h – 10h hàm ƣợng từ 11,12 (%) tăng ên 11.77% tăng 0,65% so với khoảng thời gian từ – 8h Sau 10h hàm ƣợng flavonoid giảm từ 12,32% xuống 11,38% giảm 0,94%.Nhƣ vậy, hàm ƣợng flavonoid hiệu tách chiết khoảng 8h cho hiệu suất trích ly flavonoid cao 3.3 Xác định có mặt flavonoid trịn dịch chiết phƣơng pháp 3.3.1 Định tính flavonoid phản ứng màu đặc trưng Cao flavonoid thu đƣợc sau tách chiết theo quy trình B.C.Ta ii đƣợc h a tan ethano thu đƣợc dịch flavonoid Tiến hành phản ứng đặc trƣng với nhóm chất flavonoid Bảng 3.7: Kết định tính flavonoid trích ly từ Chùm Ngây Thuốc thử FeCl3 NaOH Màu phản ứng Xanh đen Vàng cam Dựa vào màu sắc phản ứng flavonoid với FeCl3 NaOH phản ứng tạo màu xanh đen phản ứng tạo màu vàng sáng phản ứng dƣơng t nh với nhóm flavonoid Hình 3.3: Kết định tính flavonoid trích ly từ Chùm Ngây Dựa vào màu sắc phản ứng Flavonoid qua bảng hình 3.6 cho thấy phản ứng flavonoid với FeCl3 NaOH phản ứng tạo màu xanh đen phản ứng tạo màu vàng sáng phản ứng dƣơng t nh với nhóm Flavonoid 34 3.3.2 Định tính flavonoid phương pháp chạy sắc ký lớp mỏng Sau hòa tan cao flavonoid ethanol, tiếp tục cô cạn để bay ethano cho 10m nƣớc nóng h a tan f avonoid thô để nguội lắc với ethyl acetate Dịch ethy acetate đƣợc sử dụng làm dịch thử Hình 3.4: Kết chạy sắc ký mỏng flavonoid quan sát dƣới ánh sang thƣờng ánh sang tử ngoại Mẫu 1: chất chuẩn quercetin Mẫu 2,3: flavonoid tách chiết từ Chùm ngây Quan sát màu sắc nhƣ hình ảnh chạy sắc ý thu đƣợc, nhận thấy dải màu mẫu flavonoid thơ tách chiết đƣợc có màu vàng, cột màu cgần với cột màu cịn lại, chứng t mẫu flavonoid thơ tách chiết đƣợc tƣơng đối tinh Việc lựa chọn dung môi nhƣ điều kiện tách chiết phù hợp 3.4 Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định flavonoid Dịch chiết flavonoid Chùm Ngây ethanol 80%, đƣợc cô cạn nồi cách thủy,thu cao khô từ dịch chiết Cao hơ sau đƣợc dẫn với nƣớc vô trùng đƣợc dung dịch cao khô 35 Flavonoid dạng kết tinh : 0,15g 1m nƣớc vô trùng A B C D Hình 3.5: Hoạt tính kháng số chủng vi sinh vật kiểm định flavonoid A:Đƣờng kính vịng kháng nấm nem Saccharomyces cerevisiae B: Đƣờng kính vịng kháng vi khuẩn E.coli C:Đƣờng kính vịng kháng vi khuẩn Salmonella D:Đƣờng kính vịng kháng nấm mốc Aspergillus niger Kết nhận đƣợc cho thấy flavonoid Chùm Ngây có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định cao Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định Chùm ngây hiệu với hai nhóm nấm men nấm mốc Aspergillus niger Hoạt tính kháng thấp vi khuẩn 36 Bảng 3.8: Hoạt tính kháng số chủng vi sinh vật kiểm định flavonoid Đƣờng kính vịng Chủng vi sinh vật kháng (cm) Nấm men Saccharomyces cerevisiae 2,2 Vi khuẩn E coli 1,2 Vi khuẩn Salmonella 1,5 Nấm mốc Aspergillus niger 2,4 Qua Bảng 3.8 hoạt tính kháng số chủng hợp chất f avonoid tƣơng đối cao,c ng hàm ƣợng flavonoid nhƣng t nh háng hác chủng vi sinh vật cụ thể: tính kháng thấp vi khuẩn E coli với đƣờng kính vịng kháng 1,2 cm, tính kháng cao nấm mốc Aspergillus niger có đƣờng kính 2,4 cm cịn nấm men Saccharomyces cerevisiae vi khuẩn Salmonella có t nh háng tƣơng đối 37 HƢƠNG : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Với kết thu đƣợc, rút số kết luận nhƣ sau: - Xác định đƣợc độ ẩm Chùm ngây 77,23% bột khô Chùm ngây 7,72 % - Đã khảo sát bốn thông số ảnh hƣởng đến trình tách chiết điều kiện nhiệt độ, dung môi ethanol, tỷ lệ mẫu/dung môi thời gian tách chiết Kết xác định đƣợc điều kiện trích ly tối ƣu nhiệt độ 600C thích hợp, ethanol 80% , tỷ lệ mẫu/ dung môi ethanol =1/15 tƣơng đƣơng với thời gian tối ƣu - Đã xác định đƣợc hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định flavonoid: khả háng vi sinh vật kiểm định flavonoid thể với đƣờng kính vịng kháng vi sinh vật cao, ức chế sinh trƣởng vi khuẩn Gram (- E coli, Salmonella, nấm mốc Aspergillus niger, nấm men Saccharomyces cerevisiae - Lá Chùm ngây khơng có hàm ƣợng flavonoid cao mà hàm ƣợng vitamin C mức cao, đạt 98,2 mg/100g Do vậy, khẳng định Chùm ngây nguồn vật liệu thực vật có hàm ƣợng cao chất có tác dụng chống oxi hóa, chống ão hóa tăng cƣờng sức đề kháng thể 4.2 Kiến nghị - Trên sở lý thuyết trên, đề nghị thiết kế đƣa phƣơng pháp chiết khác nhau, phù hợp cho việc triển khai quy mô pilot công nghiệp - Tiếp tục khảo sát để tìm dung mơi chiết, điều kiện chiết tối ƣu 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO Phần Tiếng Việt [1] Nguyễn Tiến Bân (2003), Danh lục loài thực vật Việt Nam, NXB Nông nghiệp [2] Võ Văn Chi (1997), Từđiển thuốc Việt Nam, Nhà xuất y học [3] Sa ihah (2011) “Phân lập hợp chất có tác dụng chống oxy hóa Chùm Ngây ( Moringa oleifera Lam.)”, Đại học khoa học tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh [4] Phạm Hồng Hộ, Cây có vịthuốc ởViệt Nam, NXB KHKT Hà Nội [5] Đào Kim Nhung, Đỗ Thị Gấm, Trần Quỳnh Hoa, Trần Nam Thái, Nghiên cứu số hoạt tính sinh học Flavonoid chiết xuất từ vải (Litchi chinensisi Sonn) nhãn (Dimocarpus longan Lour), Tạp ch Dƣợc học, 394 (2009) 39-43 [6] Ngô Văn Thu, Bài giảng Dƣợc liệu - Tập 1, Bộ Môn Dƣợc liệu, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, 1998 [7] Trần Quang Vinh (2009), “Sự thay đổi hàm lượng flavonoid Chùm Ngây (Moringa oleifera Lam.) theo giai đoạn phát triển”, Đại học khoa học tự nhiên TP HCM [8] Tiểu luận môn học-các phƣơng pháp xác định hàm ƣợng vitamin thực phẩm ĐH Bách hoa,ĐHQG Tp HCM [9] Phạm Văn Ngọt tgk (2015), Khả háng huẩn cao chiết thử nghiệm Tạp chí khoa học ĐHSP TPHCM Phần Nước Ngồi [10] Boonyadist Vongsa et a (2013), “Maximizing total phenolics, total flavonoids contents and antioxidant activity of Moringa oleifera leaf extract by the appropriate extraction method”, Mahidol University, Bangkok, pp 566-571 [11] Caceres A et a (1992), “Pharmacologic properties of Moringa oleifera: 2: Screening for antispasmodic, anti-inflammatory and diuretic activity” J Ethnopharmacol 36: 233-237 39 [12] Gressman, The chemistry of flavonoid compounds, Academic press, Lon don, 1975 [13] Tan M.C., Tan C.P and Ho C.W., Effects of extraction solvent system, time and temperature on total phenolic content of henna (Lawsonia inermis) stems, International Food Research Journal 20 (2013) 3117-3123 [14] Wang J., Sun B.G., Cao Y., Tian Y and Li X H., Optimization of ultrasound-assisted extraction of phenolic compounds from wheat bran, Food Chemistry 106 (2008) 804-810 [15] Ei ert U, Wo ters B, Nadrtedt A (1981), “The antibiotic princip e of seeds of Moringa oleifera and Moringa stenopeta a”, P antaMed 42: 55-61 [16] J E Brown, H Khodr, R C Hider, and C Rice-Evans (1998), “Structural dependence of flavonoid interactions with Cu2+ ions: implications for their antioxidant properties”, Biochemica Journa , vo 330, no 3, pp 1173-1178 [17] Makkar HPS, Becker K (1996), Nutritional value and antinutritional components of whole and ethanol extracted Moringa oleifera leaves [18] Mehta LK., Balaraman R., Amin AH, Bafna PA, Gulati OD (2003), Effect of fruits of Moringa oleifera on the lipid profile of normal and hypercholesterolaemic rabbits [19] Suphachai Charoensin (2012), “Antioxidant and anticancer activities of Moringa oleifera leaves”, Journa of Medicina P ant Research, pp 318-325 [20] Wang Xiaomei, Cao Wengen (2007), “Advances in Research of Pharmacological Effects of Flavonoid Compounds”, Department of Pharmacy, Journal of Suzhou College [21] Sandra et a (2003), “Ultrasound-assisted extraction of Ca, K and Mg from in vitro citrus culture”, Journal of the Brazilian Chemical Society 40 ... ƣợng vitamin C Chùm Ngây 2.2 Nội dung nghiên c? ??u - Nghiên c? ??u x? ?c định đƣ? ?c độ ẩm bột Chùm Ngây x? ?c định hàm ƣợng vitamin C Chùm Ngây - Nghiên c? ??u tách chiết hợp chất flavonoid bột Chùm Ngây theo... ảnh hình thái Chùm Ngây (Guilandina moringa Lam) [2] A Thân Chùm Ngây C Lá Chùm Ngây B Hoa Chùm Ngây D Quả Chùm Ngây 1.1.3 Thành phần hóa h? ?c Chùm Ngây C? ?c phận Chùm Ngây chứa nhiều chất khoáng... hình nghiên c? ??u Chùm Ngây giới nư? ?c 1.1.4.1 Tình hình nghiên c? ??u Chùm Ngây giới Trên giới c? ? nhiều nghiên c? ??u trích ly ứng dụng hoạt chất sinh h? ?c Chùm Ngây Theo c? ?ng trình nghiên c? ??u Suphachai Charoensin