Nghiên cứu chiết tách và xác định thành phần hóa học của lá cây cỏ lào Bình Định

Header Page of 126 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG NGUYỄN THỊ THÙY TRANG Công trình ñược hoàn thành ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Người hướng dẫn khoa học: GS.TS ĐÀO HÙNG CƯỜNG Phản biện 1: PGS.TS LÊ THỊ LIÊN THANH NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC Phản biện 2: TS TRẦN MẠNH LỤC CỦA LÁ CÂY CỎ LÀO BÌNH ĐỊNH Chuyên ngành: Hóa hữu Mã số: 60 44 27 Luận văn ñã ñược bảo vệ trước hội ñồng chấm Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khoa học họp Đại học Đà Nẵng vào ngày 14 tháng 11 năm 2012 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Đà Nẵng - 2012 Footer Page of 126 Có thể tìm hiểu luận văn tại: - Trung tâm Thông tin – Học liệu, Đại học Đà Nẵng - Thư viện trường Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng Header Page of 126 MỞ ĐẦU dịch chiết từ cỏ lào, nồng ñộ ñịnh có tác dụng Lý chọn ñề tài Ngày với tiến khoa học kỹ thuật chất lượng kích thích tăng trưởng tế bào gốc dây cuống rốn Đây sở ñể tiến hành nghiên cứu chế phẩm ñiều trị bệnh nan y Các sống người ngày nâng cao, bên cạnh ñó người nghiên cứu cho thấy cỏ lào chứa ñạm, phosphor kalium phải ñối mặt với nhiều vấn ñề Một vấn ñề lớn Các phận ñều chứa tinh dầu, alcaloid, tanin, flavonoid, mà nguời phải ñương ñầu ñó bệnh tật Các nhà khoa học coumarin Tuy nhiên cỏ lào nơi khác có có khác không ngừng nghiên cứu ñể tìm kiếm phương thuốc trị bệnh nhiều thành phần hàm lượng cấu tử Để tìm tối ưu Xu hướng y học ñại tìm kiếm hoạt chất kiếm vùng nguyên liệu tốt cần tiến hành nghiên cứu cỏ lào có loài thảo mộc có tác dụng chữa bệnh vùng khác Với hy vọng góp phần nhỏ vào việc biến cỏ Nước ta vùng nhiệt ñới gió mùa, ánh sáng nhiều, lượng mưa lào thành chế phẩm chữa bệnh hữu hiệu cho người, ñã lớn, ñộ ẩm cao nên thực vật phát triển mạnh Thảm thực vật nước thực ñề tài: “ Nghiên cứu chiết tách xác ñịnh thành phần ta ña dạng phong phú với hàng nghìn họ, hàng vạn loài, ñó hoá học cỏ lào Bình Định” nguồn dược liệu quý giá ñang cần ñược nghiên cứu khai thác Mục ñích nghiên cứu Cây cỏ lào (Eupatorium odoratum L.; Chromolaena odorata Nghiên cứu ñiều kiện chiết tách xác ñịnh thành phần hoá học King & Robinson) thuộc họ Cúc (Asteraceae) Cỏ lào ñược gọi hợp chất có cỏ lào Bình Định cộng sản, yên bạch, bớp bớp, bù xích, chùm hôi, nhả nhật, muồng Đối tượng phạm vi nghiên cứu mung phia, hay tên tiếng Anh fragrant thoroughwort, bitter bush Lá cỏ lào (tươi, khô) dịch chiết từ cỏ lào tên tiếng Pháp langue de chat, eupatoire odorante …là loài mọc phương pháp chiết soxhlet Lá cỏ lào ñược lấy từ cỏ lào mọc hoang lan rộng chiếm ñịa bàn phân bố nhanh nhiều vùng hoang ñịa bàn tỉnh Bình Định giới Ở Việt Nam, cỏ lào thường gặp nhiều nơi từ tỉnh ñồng Các phương pháp nghiên cứu ñến miền trung du vùng ñồi núi thấp Về công dụng y học, + Nghiên cứu lý thuyết từ lâu dân gian ñã biết dùng cỏ lào ñể cầm máu, chữa lành vết + Các phương pháp nghiên cứu thực nghiệm thương, vết bỏng trị số bệnh nhiễm khuẩn ñường ruột, ung Bố cục luận văn nhọt, ghẻ lở, viêm ñại tràng , ñau nhứt xương, cảm cúm… Thành phần hoá học cỏ lào ñã ñược nhiều tác giả Nội dung luận văn chia làm chương: Chương 1- Tổng quan nước nghiên cứu Học viện quân y 17 ñã nghiên cứu dịch chiết Chương 2- Những nghiên cứu thực nghiệm toàn phần cỏ lào ñể bào chế dạng thuốc trị vết thương, vết Chương 3- Kết bàn luận bỏng Một nghiên cứu viện y học cổ truyền Trung ương cho thấy Footer Page of 126 Tổng quan tài liệu nghiên cứu Header Page of 126 1.5.2 Phân loại CHƯƠNG 1.5.3 Tính chất số hợp chất flavonoid TỔNG QUAN 1.5.4 Các phương pháp ñịnh tính ñịnh lượng 1.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY CỎ LÀO 1.1.1 Sơ lược nguồn gốc cỏ lào giới thực vật 1.5.5 Các phương pháp chiết xuất tổng hợp flavonoid 1.1.2 Cây cỏ lào 1.5.6 Tác dụng sinh học ứng dụng 1.2 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CỦA CÂY CỎ LÀO CHƯƠNG – NHỮNG NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM Những nghiên cứu cho thấy cỏ lào chứa tinh dầu (có nhiều tươi), tanin (thuộc nhóm tanin pyrogalic), flavonoid 2.1 NGUYÊN LIỆU, DỤNG CỤ, HOÁ CHẤT 2.1.1.Thu gom nguyên liệu (flavonol, flavanol, chalcol, dihydroflavonol), coumarin, ankaloit (có Nguyên liệu ñược bắt ñầu lấy vào tháng 7/2012 từ vùng gò nhiều rễ), antraquinon, glucoxit, saponin Trong ñó chủ yếu tinh ñồi ñịa bàn tỉnh Bình Định Lấy cách ngẫu nhiên loại dầu flavonoid (non, già), non 1.2.1 Thành phần hóa học tinh dầu cỏ lào 2.1.2 Xử lí nguyên liệu Đối với tinh dầu tiến hành chưng cất lôi nước, sau ñó tiến hành ño GC-MS xác ñịnh cấu trúc số hợp chất sau: Alpha pinene; Beta pinene; D-limonene; Beta ocimene; Caryophylene; Pregeijerene; Germacrene-D; Delta- cadinene; Alpha-copaene; Caryophyllene oxide; Delta-humulene… 1.2.2 Thành phần hóa học falvonoid cỏ lào Đối với flavonoid, chúng ñược chiết từ cỏ lào dung môi phân cực CH3OH, C2H5OH Sử dụng phương LC1 13 MS, UV-VIS, H-NMR, C-NMR xác ñịnh ñược cấu trúc số hợp chất sau: Odoratin; Obuin; 4,2′-Dihydroxy-4′,5′,6′’ trimethoxychalcone; 6,7-Dihydroxy-5,4 - dimetoxyflavanon … 1.3 GIÁ TRỊ SỬ DỤNG CỦA CÂY CỎ LÀO 1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 1.5 HỢP CHẤT FLAVONOID 1.5.1 Định nghĩa Footer Page of 126 a Mẫu tươi Lá cỏ lào sau ñược hái rửa sạch, ñể nước sau ñó cắt nhỏ b Mẫu khô Lá cỏ lào sau hái ñược rửa sạch, ñể nước, sấy khô 400C ngày Sau ñó xay nhỏ thành bột 2.1.3 Thiết bị - dụng cụ hóa chất a Thiết bị - dụng cụ b Hoá chất 2.2 SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU Header Page of 126 Lá tươi chưng cất lôi cắt nhỏ tinh dầu soxhlet (dung môi C2H5OH: H2O tỉ lệ 1:1 ) Xác ñịnh ñộ ẩm, xác ñịnh hàm lượng tro, hàm lượng kim loại rửa sấy khô (lá khô) ño GC-MS dịch chiết (L1) Xác ñịnh thành phần, hàm lượng CTCT chất có tinh dầu 2.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CHỈ TIÊU HOÁ LÍ 2.3.1 Xác ñịnh ñộ ẩm 2.3.2 Xác ñịnh hàm lượng tro phương pháp tro hóa mẫu 2.3.3 Xác ñịnh hàm lượng số kim loại cỏ lào phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử 2.4 PHƯƠNG PHÁP CHƯNG CẤT LÔI CUỐN HƠI NƯỚC 2.5 XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN, HÀM LƯỢNG VÀ CTCT CÁC CHẤT CÓ TRONG TINH DẦU LÁ CỎ LÀO VÀ DỊCH CHIẾT BẰNG PHƯƠNG PHÁP GC-MS 2.6 PHƯƠNG PHÁP CHIẾT ĐỂ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CỦA LÁ CÂY CỎ LÀO 2.7 CHƯNG CẤT DUNG MÔI BẰNG PHƯƠNG PHÁP CẤT soxhlet QUAY CHÂN KHÔNG 2.8 XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN DỊCH CHIẾT TỪ LÁ CÂY CỎ Dung môi etyl axetat Dung môi n-hexan LÀO BẰNG PHƯƠNG PHÁP LC-MS CHƯƠNG Dịch chiết khô (L2) Cô quay chân không, ño LC-MS dịch chiết (L1) dịch chiết (L2) dịch chiết (L3) Cô quay chân không, ño GC-MS Dịch chiết khô (L3) xác ñịnh thành phần, hàm lượng số hợp chất flavonoid KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN xác ñịnh 3.1 KẾT QUẢ ñộ ẩm,xác XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CHỈ TIÊU HOÁ LÍ CỦA LÁ CỎhàm LÀOlư ñịnh 3.1.1 Độ ẩm ợng tro, hàm lượ Độ ẩm trung bình 61,022 % So sánh với loại ng kim khác láloại cỏ lào có ñộ ẩm trung bình Giá trị khác khảo sát mẫu tươi lấy vào thời ñiểm khác tùy Xác ñịnh thành phần, hàm lượng hợp chất có dịch chiết soxhlet vào loại non hay già Do nguyên liệu nghiên cứu mẫu tươi lấy cách ngẫu nhiên (bao gồm non, già) vào thời ñiểm khác nhau, ñộ ẩm mẫu có tính tương ñối tính theo khối lượng mẫu tươi Footer Page of 126 Header Page of 126 10 Các cấu tử tinh dầu ñược xác ñịnh thành phần %, ñịnh danh 3.1.2 Hàm lượng tro Hàm lượng tro trung bình là: 10,515% Trong thành phần xác ñịnh CTCT phương pháp sắc kí khí – khối phổ, tro vô có mặt muối số kim loại K, Na, sở so sánh với thư viện liệu phổ Cụ thể thành phần hóa học tinh Ca, Fe, Cu, Pb, Zn… Sự có mặt kim loại ảnh dầu cỏ lào với công thức phân tử, thời gian lưu tỉ lệ phần hưởng ñến tính chất dịch chiết từ yên bạch với phương trăm ñược ñược trình bày bảng 3.4 pháp chiết khác Bảng 3.4 Thành phần hóa học tinh dầu cỏ lào Bình 3.1.3 Hàm lượng số kim loại Định Bảng 3.3 Bảng hàm lượng số kim loại cỏ lào C10H16 C10H16 C10H16 C10H16 C10H16 C10H16 C10H18O C11H16 Thời gian lưu 4,043 4,960 5,093 6,093 6,160 6,433 7,927 8,777 Phần trăm (%) 0,26 0,22 0,16 0,07 0,12 0,43 0,13 1,63 C12H18 9,161 14,15 C10H18O C13H22O2 C11H14O C11H16 10,261 10,727 12,011 12,161 0,08 0,06 0,07 0,11 C12H18 13,094 0,50 C15H24 C15H24 14,178 14,261 0,66 0,82 C15H24 C15H24 C15H24 C15H24 14,578 15,261 15,478 15,678 0,15 0,14 3,35 0,36 C15H24 15,845 3,17 STT Hợp chất CTPT năm 1992) hàm lượng kim loại nặng tối ña cho phép rau 01 02 03 04 05 06 07 08 sấy khô Pb: 2mg/kg, Zn: 20mg/kg, Cu: 30mg/kg hàm lượng 09 beta-cis-ocimene β-pinen beta-mycrene limonene 2-norpinene,3,6,6- trimethyl tricyclene beta-limalool cyclohexen-5,6-diethenyl-3methyl Dispiro2.0.2.5 undecan, 8methylene p-menth-1-en-4-ol linalyl propanoate isopyrethrone cyclohexen-3,4-diethenyl-3methyl tricyclo3.2.1.02,7oct-3ene,2,3,4,5-tetramethyl germacrene B p-menth-3-ene,2-isopropenyl1-vinyl alpha-cubebene alpha-amorphene copaene cyclobuta1,2:3,4dicyclopeten e,decahydro-3A-methyl elemene Kim loại Hàm lượng (mg/kg cỏ lào) TCVN (mg/kg) Zn2+ Cu2+ Pb2+ 119,00 34,80 0,92 20,000 30,000 2,000 Căn vào tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN) cho vệ sinh thực phẩm (theo ñịnh y tế số 505/BYT-QĐ ngày 13 tháng kim loại nặng có cỏ lào lớn nhiều so với hàm lượng tối tiết mùa hàm lượng kim loại cỏ lào ñịa phương 10 11 12 13 theo thời gian lấy mẫu khác 14 ña cho phép Do sử dụng cỏ lào làm thuốc uống cần phải lưu ý Đồng thời ảnh hưởng ñiều kiện sinh thái thời 3.2 XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN, HÀM LƯỢNG VÀ CTCT MỘT SỐ CẤU TỬ CHÍNH CÓ TRONG TINH DẦU LÁ CỎ 15 16 LÀO hắc, ñộ nhớt cao, ñược làm khan Na2SO4 ñược bảo quản 17 18 19 20 tủ lạnh nhiệt ñộ 50C 21 Tiến hành thu tinh dầu phương pháp chưng cất lôi nước Tinh dầu thu ñược nhẹ nước, có màu vàng ñậm, mùi Footer Page of 126 Header Page of 126 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 11 isocaryophyllene 1H-cyclopenta 1,3cyclopropa 1,2bezene, octahydro-7methyl-3methylene 2-petanone,5-(2methylenecyclohexyl)stereoisomer chưa ñịnh danh naphthalene,1,2,3,4,6,8ahexahydro-1-isopropyl-4,7dimethyl bicyclo7.2.0 undec-4ene,4,11,11-trimethyl-8methylene alpha-caryophyllene germacrene D cycloprop[E]azulene,decahyd ro-1,1,7-trimethyl-4methylene Delta cadinene Delta muurolene cadina-3,9-diene cadina-1,3,5-triene o-menth-8-ene-4methanol,α,α-dimethyl-1vinyl-(1S,2S,4R) caryophylleneoxide ledol alpha-bisabolol eudesmol cadinol 1-cadin-4-en-10-ol copaen-11-ol eudesm-4(14)-en-11-ol 3,7,11,15-tetramethyl-2hexadecen-1-ol hexadecanoic acid 3,7,11,15tetramethylhexadecen1,3,6,10-pentaene Footer Page of 126 12 C15H24 C15H24 16,862 19,22 17,011 0,88 C12H20O 17,245 0,41 C15H24 17,345 17,478 0,33 0,38 47 48 49 50 51 52 2,4-dioctylphenol C22H38O 28,845 0,05 phytol C20H40O 29,495 3,72 hexadecanan diallyl acetal C22H42O2 29,795 0,09 kauren-18-ol,acetate,(4.beta) C22H34O2 29,895 0,14 pentacosane C25H52 33,396 0,08 bis(2-ethylhexyl)phthalate C24H38O4 33,979 0,16 So sánh thành phần hóa học tinh dầu cỏ lào Bình Định với tinh dầu cỏ lào Nghệ An, Hà Tĩnh Phú Yên ñược thể cụ thể bảng 3.5 Ta nhận thấy thành phần hóa học tinh C15H24 17,561 0,50 dầu cỏ lào Bình Định tinh dầu Nghệ An Hà Tĩnh có cấu tử germacrene D với hàm lượng cao (Bình Định: 18,67%; C15H24 C15H24 C15H24 17,745 4,12 18,562 18,67 18,811 2,71 Nghệ An: 20,5%; Hà Tĩnh: 16,8%) Nhưng bên cạnh ñó thành phần tinh dầu cỏ lào Bình Định có khác biệt so với tinh dầu cỏ lào Nghệ An, Hà Tĩnh Phú Yên như: Bình Định có hàm lượng lớn isocaryophylen (19,22%) vùng khác lại không C15H24 C15H24 C15H24 C15H22 C15H26O 18,911 19,211 19,395 19,478 20,312 0,40 0,35 6,00 0,30 6,15 C15H24O C15H26O C15H26O C15H26O C15H26O C15H26O C15H24O C15H26O C20H40O 21,095 21,428 22,178 22,345 22,578 22,662 22,828 22,995 25,995 0,26 0,41 0,92 1,02 0,72 1,11 0,50 3,28 0,06 C16H32O2 C20H32 27,945 28,495 0,38 0,04 có Sự khác biệt do: - Cây ñược trồng ñịa bàn khác nhau, khí hậu thời tiết khác nhau; - Thời ñiểm thu hái nguyên liệu không giống nhau; - Tinh dầu cỏ lào Bình Định chủ yếu ñược lấy từ cành non tinh dầu ñịa phương khác lại bao gồm lá, cành non, thân Phú Yên có thêm hoa; - Điều kiện chiết tinh dầu khác (nhiệt ñộ, dụng cụ thí nghiệm…) Header Page of 126 13 14 Bảng 3.5 So sánh thành phần hóa học tinhdầu cỏ Định có nhiều cấu tử trùng khớp với hàm lượng tương ñối cao TT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 lào Bình Định với Phú Yên, Nghệ An Hà Tĩnh Hàm lượng (%) Tên hợp chất Bình Nghệ Phú Yên Định An Alpha pinene 8,516 11,0 Beta pinene 0,21 5,761 5,1 D-limonene 0,07 0,653 0,8 Beta-cis-ocimene 0,27 1,067 3,2 Cyclohexene-3,4-diethyl-30,11 2,428 methyl Cyclohexene-5,6-diethyl-11,63 23,046 methyl Tetracyclo[5.2.1.0(2,6).0(3,5 12,490 )]decane,4,4-dimethyl Dispiro2.0.2.5undecane,814,15 methylene Copaene ylangene 3,35 1,845 Beta caryophyllene 10,059 9,1 Alpha caryophylene 4,12 3,108 Beta cubebene 14,281 0,2 Elemol 0,864 0,4 Myrcene 0,16 1,3 Geijerene 20,7 Germacrene-D 18,67 20,5 Delta cadinene 0,4 3,7 o-menth-8-ene-4methanol,α,α-dimethyl-16,15 vinyl-(1S,2S,4R) Cadina-3,9-diene 6,00 Elemene 3,17 0,2 Phytol 3,72 Isocaryophylene 19,22 - như: germacrene – D (18,67%); isocaryophylene (19,22%) 3.3 XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN, HÀM LƯỢNG VÀ CTCT CÁC Hà Tĩnh 11,1 5,3 0,7 2,4 - 3.3.1 Thành phần, hàm lượng CTCT hợp chất có dịch chiết với dung môi etyl axetat Mẫu L2: Lá cỏ lào sấy khô, xay thành bột, cân lượng 15g Tiến hành chiết soxhlet với dung môi etyl axetat thời gian giờ, dịch chiết có màu xanh thẫm Cô ñuổi dung môi, ñể vào tủ lạnh nhiệt ñộ 100C vòng 12 giờ, lọc lấy phần dịch lỏng ñem ñi phân tích thiết bị phân tích thiết bị sắc kí khí – - khối phổ liên hợp, sở so sánh với thư viện liệu phổ Việc - xác ñịnh ñược tiến hành Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm 7,3 0,1 0,8 1,2 15,5 16,8 4,0 0,2 - Tóm lại so với tài liệu tham khảo thành phần tinh dầu cỏ lào (xem phần 1.2.1) thành phần tinh dầu cỏ lào Bình Footer Page of 126 HỢP CHẤT CÓ TRONG DỊCH CHIẾT LÁ CỎ LÀO KHÔ TP Hồ Chí Minh So sánh sắc kí ñồ-khối phổ thu ñược hình 3.7 với thư viện chuẩn cho thấy thành phần dịch chiết cỏ lào khô với dung môi etyl axetat có 37 cấu tử Các cấu tử chủ yếu thuộc nhóm monotecpen, secquiterpen, diterpen bao gồm dẫn xuất phenol, ancol, andehit…Trong ñó có thành phần là: 4-Hydroxy-3-(4methoxycinnamoyl)-6-methyl-2H-pyran-2-one (11,56%); (+)-Epi- biclosesquiphellandrene (8,98%); All-trans-squalene (8,45%); α- Amyrin (6,6%); 2-(4-methoxy-2,5-dimethyl-phenyl)-9-methyl-2Hbenzo[g]indazole (5,57%); Caryophylene (5,19%) Cụ thể thành phần hoá học dịch chiết với công thức phân tử, thời gian lưu tỉ lệ phần trăm ñược trình bày bảng 3.6 Header Page of 126 15 16 Bảng 3.6 Thành phần hoá học dịch chiết cỏ lào khô với dung môi etyl axetat 01 α-Pinene C10H16 Thời gian lưu 4,09 02 4(10)-Thujene C10H16 4,57 0,12 03 β-Pinene C10H16 4,67 0,56 04 D-Limonene C10H16 5,30 0,17 05 3-Carene C10H16 5,45 0,14 06 Benezeneacetaldehyde C6H8O 5,59 0,04 07 Acetin,mono- C12H18 6,15 0,37 08 2,7-Dimethyl-3,6dimethylene-1,7-octadiene C5H10O4 6,66 0,27 3-methyl-3,4-divinyl-1cyclohexene Hydroquinone C11H16 6,76 1,93 C6H6O2 8,37 0,45 1-(3-methyl-cyclopent-2enyl)-cyclohexene C12H18 13 p-Menth-3-ene,2isopropenyl-1-vinyl-,(1S,2R)(-)Copaene 14 Chưa ñịnh danh 15 Caryophylene 16 α-Caryophylene ST T 09 10 11 12 Tên hợp chất Footer Page of 126 Công thức phân tử Phần trăm (%) 1,11 17 C15H24 18 (+)-Epibiclosesquiphellandrene Chưa ñịnh danh 10.73 8.98 10,87 2,01 19 Cadina-3,9-diene C15H24 11,06 3,71 20 o-Menth-8-ene4methanol,α,α-dimethyl1vinyl-,(1S,2S,4R)-(-) C15H26O 11,38 0,66 21 n-hexadecanoic acid C16H32O2 14,98 0,75 22 23 Phytol α-Amyrin C20H40O C30H50O 16,15 18,64 1,50 6,60 24 5-Hydroxy-4’,7dimethoxyflavanone All-trans-squalene C17H16O5 20,54 1,10 C30H50 20,85 8,45 4-Hydroxy-3-(4methoxycinnamoyl)-6methyl-2H-pyran-2-one Chưa ñịnh danh C16H14O5 21,1 11,56 21,4 1,32 C11H11O4 21,63 4,97 29 Ethanone,1-(3,4,5trimethoxyphenyl)2-(4-methoxy-2,5-dimethylphenyl)-9-methyl-2Hbenzo[g]indazole C21H20N2O 21,96 5,57 30 Chưa ñịnh danh 22,25 8,91 31 32 Chưa ñịnh danh 2-propen-1-one,3-(4hydroxyphenyl)-1-(2-hydro3,4,6-trimethoxyphenyl)- 22,76 22,88 2,31 2,99 25 26 27 28 8,72 1,22 C15H24 9,03 0,59 C15H24 9,54 2,32 9,66 0,87 C15H24 10,07 5,19 C15H24 10,47 1,34 C18H18O6 Header Page of 126 18 17 33 dl-α-Tocopherol 34 Chưa ñịnh danh 35 Flavone,4’,5,6,7tetramethoxyFlavone,3,4’,5-Trihydroxy3’,7-dimethoxyStigmasterol C29H50O2 23,3 3,39 23,77 2,20 C19H18O6 24,12 2,86 STT C17H14O7 24,7 1,81 01 α-Pinene C29H48O 24,87 1,09 02 Bảng 3.7 Thành phần hoá học dịch chiết cỏ lào khô với dung môi n-hexan 36 37 3.3.2 Thành phần, hàm lượng CTCT hợp chất có dịch chiết với dung môi n-hexan Mẫu L3: Lá cỏ lào sấy khô, xay thành bột, cân lượng 11g Tiến hành chiết soxhlet với dung môi n-hexan thời gian giờ, dịch chiết có màu xanh Cô ñuổi dung môi, ñể vào tủ lạnh nhiệt ñộ 100C vòng 12 giờ, lọc lấy phần dịch lỏng ñem ñi phân tích thiết bị phân tích thiết bị sắc kí khí – khối phổ liên hợp, sở so sánh với thư viện liệu phổ Việc xác ñịnh ñược tiến hành Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm TP.Hồ Chí C10H16 Thời gian lưu 4,08 Phần trăm (%) 1,63 β-Phellandrene C10H16 4,56 0,20 03 β-Pinene C10H16 4,67 1,09 04 p-Mentha-l,8-diene, (S)-(-)- C10H16 5,29 0,18 05 3-carene C10H16 5,44 0,26 06 Benzeneacetaldehyde C8H8O 5,58 0,06 07 Chưa ñịnh danh 6,14 0,07 08 -Methyl-5,6-divinyl-1 – cyclohexene Cyclohexene,3,4-diethyenyl3-methyll-(3-Methyl-cyclopent-2enyl)- cyclohexene C11H16 6,66 0,30 C11H16 6,75 2,58 C12H18 8,72 3,68 C15H24 9,03 0,28 12 p-Menth-3-ene, 2isopropenyl-l-vinyl-, (lS,2R)(-)Copaene C15H24 9,54 3,95 13 Chưa ñịnh danh 9,66 1,15 14 Caryophylene 15 Chưa ñịnh danh 16 α-Cubebene 09 10 Minh Cụ thể thành phần hoá học dịch chiết với công thức phân Hợp chất Công thức phân tử tử, thời gian lưu tỉ lệ phần trăm ñược trình bày bảng 3.7 11 Footer Page of 126 C15H24 10,07 8,80 10,17 0,27 C15H24 10,37 0,27 Header Page 10 of 126 19 20 17 α- Caryophyllene C15H24 10,46 2,24 37 σ-Tocopherol 18 Germacrene D C15H24 10,73 16,25 38 Chưa ñịnh danh 19 σ- Muurolene C15H24 10,87 3,95 39 Stigmasterol C29H48O 24,87 2,66 20 Cadina-3,9-diene C15H24 11,06 6,27 40 α - Sitosterol C29H50O 25,63 2,62 21 Cadina-1,3-5-triene C15H22 11,13 0,28 22 o-Menth-8-ene-4methanol,α,α-dimethyl-1vinyl-,(1S,2S,4R)-(-) C15H26O 11,39 0,75 23 24 σ-Elemene Germacrene D-4-ol C15H24 C15H26O 11,57 0,34 11,72 0,73 25 (-)-Spathulenol C15H24O 11,76 0,31 26 Caryophyllene oxide C15H24O 11,83 0,38 27 Ledol C15H26O 11,95 0,15 28 α –Cadinol C15H26O 12,5 29 α- Eudesmol C15H26O 12,54 0,38 30 Platambin C15H26O2 14,5 31 Phytol C20H40O 16,16 2,71 32 Hexanedioic acid, bis(2ethylhexyl)ester 5-Hydroxy-4',7dimethoxyflavanone All-trans-Squalene C22H42O4 18,18 1,17 C17H16O5 20,54 1,68 C30H50 20,85 18,43 C28H48O 23,29 4,50 3.3.3 So sánh thành phần hàm lượng hợp chất có dịch chiết với dung môi etyl axetat dung môi n-hexan Việc so sánh thành phần hàm lượng cấu tử có dịch chiết với dung môi etyl axetat dung môi n-hexan thể cụ thể bảng 3.8 Bảng 3.8 So sánh thành phần hàm lượng hợp chất có dịch chiết với dung môi etyl axetat dung môi n-hexan Tên hợp chất 33 34 35 36 2-(4-Methoxy-2,5-dimethylphenyl)-9-methyl-2Hbenzo[g]indazole Chưa ñịnh danh Footer Page 10 of 126 22,62 1,57 TT 0,32 0,13 01 02 03 04 05 06 07 08 C21H20N2O 21,95 2,93 22,24 4,47 09 10 11 α-Pinene 4(10)-Thujene β-Pinene D-Limonene 3-Carene Benezeneacetaldehyde Acetin,mono2,7-Dimethyl-3,6-dimethylene-1,7octadiene 3-methyl-3,4-divinyl-1-cyclohexene Hydroquinone 1-(3-methyl-cyclopent-2-enyl)- Hàm lượng (%) Dịch chiết etyl axtat 1,11 0,12 0,56 0,17 0,14 0,04 0,37 0,27 1,63 1,09 0,26 0,06 - 1,93 0,45 1,22 3,68 Dịch chiết nhexan Header Page 11 of 126 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 21 cyclohexene p-Menth-3-ene,2-isopropenyl-1-vinyl,(1S,2R)-(-)Copaene p-Mentha-l,8-diene, (S)-(-)Caryophylene α-Caryophylene (+)-Epi-biclosesquiphellandrene β-Phellandrene Cadina-3,9-diene o-Menth-8-ene-4methanol,α,αdimethyl-1vinyl-,(1S,2S,4R)-(-) n-hexadecanoic acid Phytol α-Amyrin 5-Hydroxy-4’,7-dimethoxyflavanone All-trans-squalene 4-Hydroxy-3-(4-methoxycinnamoyl)-6methyl-2H-pyran-2-one -Methyl-5,6-divinyl-1 –cyclohexene Ethanone,1-(3,4,5-trimethoxyphenyl)2-(4-methoxy-2,5-dimethyl-phenyl)-9methyl-2H-benzo[g]indazole Cyclohexene,3,4-diethyenyl-3-methylα-Cubebene 2-propen-1-one,3-(4-hydroxyphenyl)1-(2-hydro-3,4,6-trimethoxyphenyl)- 22 36 0,59 0,28 2,32 5,19 1,34 8,98 3,71 0,66 3,95 0,18 8,80 2,24 0,20 6,27 0,75 0,75 1,50 6,60 1,10 8,45 11,56 2,71 1,68 18,43 - 4,97 5,57 0,30 2,93 37 38 39 40 41 42 43 44 45 Flavone,3,4’,5-Trihydroxy-3’,7dimethoxyσ- Muurolene σ-Elemene Germacrene D-4-ol (-)-Spathulenol Caryophyllene oxide Ledol α –Cadinol α- Eudesmol Platambin 1,81 - - 3,95 0,34 0,73 0,31 0,38 0,15 0,32 0,38 0,13 46 Hexanedioic acid, bis(2ethylhexyl)ester - 1,17 47 σ-Tocopherol - 1,57 48 α - Sitosterol - 2,62 Qua bảng so sánh ta thấy có khoảng 13 cấu tử trùng khác hàm lượng Trong thành phần hai dịch chiết ñều chứa All-trans-Squalene dịch chiết n-hexan thành phần lớn (18,43%) dịch chiết etyl axetat chiếm 8,45 % Các thành phần lại dịch chiết n-hexan 2,99 2,58 0,27 - : Germacrene D (16,43%); Caryophylene (8,80%); Cadina-3,9-diene (6,27%), cấu tử dịch chiết etyl axetat.Một số cấu tử dịch chiết etyl axetat dịch chiết n-hexan : 4-Hydroxy-3-(4- 33 dl-α-Tocopherol 3,96 - 34 35 Germacrene D Flavone,4’,5,6,7-tetramethoxy- 2,86 16,25 - methoxycinnamoyl)-6-methyl-2H-pyran-2-one (11,56%); (+)-Epibiclosesquiphellandrene (8,98%); α-Amyrin (6,60%); Ethanone,1- Footer Page 11 of 126 (3,4,5-trimethoxyphenyl)- (4,97%) Nguyên nhân khác Header Page 12 of 126 24 23 ñộ phân cực hai dung môi khác Tóm lại ta thấy dung môi etyl axetat n-hexan ñã hoà tan (L1) với số cấu tử có thời gian lưu tỉ lệ phần trăm ñược trình bày bảng 3.9 ñược nhiều cấu tử chứa cỏ lào khô, chưa xác ñịnh hết Bảng 3.9 Thành phần hoá học dịch chiết L1 Thời gian lưu (phút) 2,92 3,66 5,48 7,47 9,55 9,85 10 11 10,45 12,31 18,47 20,52 11,83 12 14,51 ñược tất hợp chất cỏ lào, phần ñã xác ñịnh thành phần có Trong ñó hợp chất TT chiếm tỉ lệ lớn ñều có hoạt tính sinh học cao ví dụ All-transsqualene có hoạt tính kháng khuẩn, chống oxi hoá, chống khối u có khả ngừa ung thư [19] Hợp chất anpha-Amirin có tác dụng chống viêm khớp, hạ ñường huyết an thần [20], [21] Hợp chất Công thức phân tử M=350 C17H16O6 M=316 Germacrene D có tác dụng kháng khuẩn cao, có khả tiêu diệt khuẩn E.coli, khuẩn S.aureus, khuẩn B.cereus…[17] Điều ñã góp phần giải thích kinh nghiệm dân gian việc sử dụng *C18H18O6 *C17H14O7 M=330 cỏ lào ñể chữa bệnh, mở khả ứng dụng việc chữa bệnh nan y, ví dụ bệnh ung thư 3.4 XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN, HÀM LƯỢNG MỘT SỐ HỢP CHẤT FLAVONOID CÓ TRONG DỊCH CHIẾT LÁ CỎ LÀO TƯƠI Mẫu L1: Lá cỏ lào tươi, cắt nhỏ, tiến hành chiết soxhlet với dung môi etanol:nước (1:1) thời gian giờ, dịch chiết thu ñược có màu nâu ñen (phần sau chiết có màu trắng), lọc bỏ cặn bẩn Cô ñuổi dung môi, rút 1ml mẫu thổi khô, ñịnh mức lại metanol, pha loãng, tiếp tục lọc áp suất thấp giấy lọc 0,45µm ñược phân tích thiết bị sắc ký lỏng – khối phổ liên hợp (LCMS) Agilent M=372 M=342 *C19H20O6 *C18H16O7 M=344 M=356 M=288 M=324 M=304 M=288 C18H16O6 M=328 Tên gọi chưa ñịnh danh 6,7-dihydroxy-5,4’dimetoxyflavanon *4,2′-dihydroxy-4′,5′,6′trimethoxychalcone *3,5,4’-trihydroxy-3’,7dimetoxyflavon *Obuin chưa ñịnh danh chưa ñịnh danh *Odoratin *3,5-dihydroxy-4’,3’,7trimetoxyflavon chưa ñịnh danh chưa ñịnh danh chưa ñịnh danh chưa ñịnh danh chưa ñịnh danh 5-hydroxy-4’,6,7trimetoxyflavon Tỉ lệ % 16,03 23,04 2,15 17,3 0,63 10,92 6,43 7,48 5,37 10,68 1,79 5,35 Kết từ sắc kí ñồ - khối phổ thu ñược cho thấy dịch chiết L1 Nhận xét: Qua việc phân tích LC-MS dịch chiết cỏ lào tươi, có nhiều cấu tử, so sánh với tài liệu tham khảo bước ñầu ta thấy hợp chất flavonoid chiếm tỉ lệ cao thành phần thống kê ñược số cấu tử với hàm lượng ñáng kể Thành hoá học cỏ lào Tuy ña số hợp chất chưa ñược ñịnh danh phần hoá học dịch chiết cỏ lào tươi phương pháp soxhlet ñã nhận diện ñược cấu tử chiếm tỉ lệ cao Footer Page 12 of 126 Header Page 13 of 126 25 26 dimetoxyflavanon (23,04%); 3,5-dihydroxy-4’,3’,7-trimetoxyflavon KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ (10,92%); 5-hydroxy-4’,6,7-trimetoxyflavon (5,35%) * KẾT LUẬN Qua trình nghiên cứu thực nghiệm, rút số * KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu theo hướng sâu hơn: chạy sắc kí cột ñể kết luận sau: Lá cỏ lào có: ñộ ẩm trung bình 61,022%; hàm lượng tro 2+ 2+ 10,515%, hàm lượng kim loại nặng (Zn : 119mg/kg; Cu : 2+ tách ñược cấu tử tinh khiết từ dịch chiết cỏ lào, ño cộng hưởng từ ñể xác ñịnh cấu trúc hợp chất Làm giàu cấu tử thử hoạt tính sinh học nghiên cứu phản ứng chuyển hóa chúng 34,8mg/kg; Pb : 0,92mg/kg) Xác ñịnh ñược thành phần tinh dầu cỏ lào Có thể nghiên cứu mở rộng xác ñịnh thành phần chất có ñịa bàn tỉnh Bình Định có khoảng 52 cấu tử Trong ñó có cấu tử thân, rể hoa cỏ lào so sánh với thành phần chất ñã ñược ñịnh danh xác ñịnh hàm lượng: isocaryophyllen có cỏ lào Từ ñó, lựa chọn ñược nguồn nguyên liệu tối ưu (19,22%); Germacrene D (18,67%); Dispiro2.0.2.5 undecan,8- ñể tiếp tục nghiên cứu hoạt tính sinh học phục vụ cho y học methylene (14,15%); vinyl-(1S,2S,4R) O-menth-8-ene-4-methanol,α,α-dimethyl-1- (6,15%); Cadina-3,9-diene (6,00%); Alpha- caryophyllen (4,12%) Xác ñịnh ñược thành phần hoá học cỏ lào ñịa bàn tỉnh Bình Định dịch chiết khô phương pháp soxhlet với hai dung môi etyl axetat n-hexan Trong dịch chiết etyl axetat có cấu tử là: 4-Hydroxy-3-(4-methoxycinnamoyl)-6-methyl2H-pyran-2-one (11,56%); (+)-Epi-biclosesquiphellandrene (8m98%); All-trans-squalene (8,45%); α-Amyrin (6,6%); 2-(4-methoxy-2,5dimethyl-phenyl)-9-methyl-2H-benzo[g] indazole (5,57%); Caryophylene (5,19%) Trong dịch chiết n-hexan có cấu tử là: All-trans-Squalene (18,43%); Germacrene-D (16,25%); Caryophylene (8,80%); Cadina-3,9-diene (6,27%) Bằng phương pháp LC-MS xác ñịnh ñược thành phần hàm lượng hợp chất flavonoid dịch chiết tươi chiết phương pháp soxhlet với dung môi etanol:nước (1:1) Bước ñầu xác ñịnh ñược hợp chất có hàm lượng lớn là: 6,7-dihydroxy-5,4’- Footer Page 13 of 126  ... NƯỚC 2.5 XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN, HÀM LƯỢNG VÀ CTCT CÁC CHẤT CÓ TRONG TINH DẦU LÁ CỎ LÀO VÀ DỊCH CHIẾT BẰNG PHƯƠNG PHÁP GC-MS 2.6 PHƯƠNG PHÁP CHIẾT ĐỂ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CỦA LÁ CÂY CỎ LÀO 2.7... sánh thành phần hóa học tinh dầu cỏ lào Bình Định với tinh dầu cỏ lào Nghệ An, Hà Tĩnh Phú Yên ñược thể cụ thể bảng 3.5 Ta nhận thấy thành phần hóa học tinh C15H24 17,561 0,50 dầu cỏ lào Bình Định. .. sinh học nghiên cứu phản ứng chuyển hóa chúng 34,8mg/kg; Pb : 0,92mg/kg) Xác ñịnh ñược thành phần tinh dầu cỏ lào Có thể nghiên cứu mở rộng xác ñịnh thành phần chất có ñịa bàn tỉnh Bình Định