nuôi cấy virus dịch tả vịt chủng c trên môi trường tế bào xơ phôi gà một lớp và bước đầu sản xuất vắc xin dịch tả vịt nhược độc đông khô

luận văn thạc sĩ, tiến sĩ, cao học, luận văn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI TRẦN THỊ THANH XUÂN NUÔI CẤY VIRUS DỊCH TẢ VỊT CHỦNG C TRÊN MÔI TRƯỜNG TẾ BÀO XƠ PHÔI GÀ MỘT LỚP VÀ BƯỚC ðẦU SẢN XUẤT VẮC XIN DỊCH TẢ VỊT NHƯỢC ðỘC ðÔNG KHÔ LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành : Thú y Mã số : 60.62.50 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. CÙ HỮU PHÚ PGS.TS. NGUYỄN HỮU NAM HÀ NỘI – 2011 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………. i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan ñây là ñề tài nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực, do tôi khảo sát nghiên cứu, có sự giúp ñỡ của các ñồng nghiệp trong cơ quan và chưa từng ñược sử dụng công bố trong bất kỳ công trình khoa học nào. Tôi xin cam ñoan, các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñược chỉ rõ nguồn gốc. Tác giả luận văn Trần Thị Thanh Xuân Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………. ii LỜI CẢM ƠN ðể hoàn thành bản luận văn này, ngoài sự cố gắng, nỗ lực hết mình của bản thân còn có sự hướng dẫn tận tình của thầy hướng dẫn khoa học PGS. TS. Cù Hữu Phú, PGS. TS Nguyễn Hữu Nam. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc ñến các thầy hướng dẫn, người ñã giành nhiều thời gian quý báu tận tình giúp ñỡ, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn: - Ban giám ñốc Xí nghiệp thuốc thú y Trung Ương. - Tập thể cán bộ công nhân viên trong phân xưởng vacxin virus ñông khô – Xí nghiệp thuốc thú y Trung Ương - Viện ñào tạo sau ñại học – Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội. ðã tận tình giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Nhân dịp này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia ñình, người thân, bạn bè, ñồng nghiệp - Những người luôn tạo ñiều kiện, ñộng viên, giúp ñỡ tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Hà Nội, ngày … tháng … năm 2011 Tác giả luận văn Trần Thị Thanh Xuân Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………. iii MỤC LỤC Lời cam ñoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt v Danh mục bảng vi Danh mục hình viii 1 MỞ ðẦU 1 1.1 Tính cấp thiết của ñề tài 1 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2 1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài 2 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1 Giới thiệu chung về bệnh 3 2.2 Miễn dịch học bệnh dịch tả vịt 16 2.3 Những yêu cầu cơ bản trong sản xuất vacxin dịch tả vịt 23 2.4 ðông khô vacxin 25 2.5 Phòng bệnh bằng vacxin 28 3. ðỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 3.1 ðối tượng nghiên cứu 33 3.2 Nội dung 33 3.3 Nguyên liệu nghiên cứu 34 3.4 Phương pháp nghiên cứu 35 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 41 4.1 Kết quả nuôi cấy virus dịch tả vịt chủng C trên môi trường tế bào xơ phôi gà một lớp 41 4.1.1 Khảo sát ñặc tính gây phá hủy tế bào của virus giống dịch tả vịt Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………. iv chủng C trên môi trường tế bào xơ phôi gà một lớp 41 4.1.2 Xác ñịnh hiệu giá virus giống trên môi trường tế bào xơ phôi gà một lớp (TCID50) 45 4.1.3 Kết quả xác ñịnh hiệu giá virus giống sau các lần cấy chuyển. 48 4.1.4 Kiểm tra các chỉ tiêu thuần khiết, an toàn và hiệu lực của lô giống gốc thích ứng trên môi trường nuôi cấy tế bào 51 4.2 Xây dựng quy trình sản xuất vacxin 56 4.2.1 Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất vacxin dịch tả vịt nhược ñộc ñông khô nuôi cấy trên môi trường tế bào. 56 4.2.2 Xác ñịnh liều gây nhiễm thích hợp của virus dịch tả vịt chủng C trên môi trường nuôi cấy tế bào 58 4.2.3 Xác ñịnh thời ñiểm thích hợp ñể thu hoạch huyễn dịch sau khi gây nhiễm virus dịch tả vịt chủng C 60 4.2.4 Xác ñịnh tỷ lệ phối trộn chất bổ trợ và huyễn dịch virus 62 4.3 ðánh giá chất lượng vacxin dịch tả vịt ñược sản xuất trên môi trường tế bào xơ phôi gà một lớp 64 4.3.1 Kết quả kiểm tra ñộ ẩm và chân không của vacxin ñông khô 65 4.3.2 Kết quả kiểm tra vô trùng 67 4.3.3 Kết quả kiểm tra an toàn 68 4.3.4 Kết quả kiểm tra hiệu lực 70 5 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 80 5.1 Kết luận 80 5.2 ðề nghị 80 TÀI LIỆU THAM KHẢO 81 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………. v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ADN Acid deoxyribonucleic CAM CEF Chorioallantoic membrane (Màng nhung niệu) Chicken embryo fibroblast (Tế bào xơ phôi gà) CEK Chick embryo kidney (Tế bào thận phôi gà) CEL Chick embryo liver (Tế bào gan phôi gà) CK Chick kidney (Tế bào thận gà) CPE DEF Cytopathic effect (Bệnh lý tế bào) Duck Embryo Fibroblast DVE Duck virus enteritis EID 50 50% Egg-infective dose (Liều gây nhiễm trứng 50%) LD 50 50 percent Lethal Dose M Membran (Protein màng) MEM Minimal essential medium (Môi trường cần thiết tối thiểu) OIE Office International des Epizooties PBS Phosphate buffered saline (Dung dịch muối ñệm) PCR SPF TCID 50 TCN TN Polymerase chain reaction Specific pathogen free (Sạch bệnh) Median tissue culture infective dose (Liều gây nhiễm tế bào 50%) Tiêu chuẩn ngành Thí nghiệm VN Virus Neutralization Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………. vi DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 4.1 Kết quả khảo sát ñặc tính gây phá hủy tế bào của virus giống dịch tả vịt chủng C trên môi trường tế bào xơ phôi gà một lớp 42 4.2 Kết quả gây nhiễm virus ở các nồng ñộ khác nhau trên môi trường tế bào xơ phôi gà 45 4.3 Xác ñịnh hiệu giá virus giống dịch tả vịt trên môi trường tế bào xơ phôi gà 47 4.4 Kết quả xác ñịnh hiệu giá virus giống sau các lần cấy chuyển 49 4.5 Kết quả kiểm tra vô trùng lô giống gốc dịch tả vịt chủng C trên môi trường nuôi cấy tế bào 51 4.6 Kết quả kiểm tra tạp nhiễm virus viêm gan vịt 52 4.7 Kết quả kiểm tra an toàn lô giống gốc dịch tả vịt chủng C trên môi trường nuôi cấy tế bào 54 4.8 Kết quả kiểm tra chỉ tiêu hiệu lực của lô giống gốc dịch tả vịt chủng C trên môi trường nuôi cấy tế bào 55 4.9 Kết quả xác ñịnh liều gây nhiễm thích hợp của virus dịch tả vịt chủng C trên môi trường nuôi cấy tế bào 58 4.10 Kết quả xác ñịnh thời ñiểm thích hợp ñể thu hoạch huyễn dịch virus 61 4.11 Kết quả xác ñịnh tỷ lệ chất bổ trợ trong vacxin dịch tả vịt nhược ñộc ñông khô trên môi trường nuôi cấy tế bào 63 4.12 Kết quả kiểm tra ñộ ẩm và chân không của vacxin ñông khô 66 4.13 Kết quả kiểm tra vô trùng các lô vacxin dịch tả vịt trên môi trường nuôi cấy tế bào 68 4.14 Kết quả kiểm tra an toàn vacxin dịch tả vịt chủng C trên môi Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………. vii trường nuôi cấy tế bào. 69 4.15 Kết quả kiểm tra hiệu lực các lô vacxin dịch tả vịt chủng C trên môi trường nuôi cấy tế bào. 71 4.16 Kết quả xác ñịnh hiệu giá virus các lô vacxin dịch tả vịt trên môi trường nuôi cấy tế bào 74 4.17 Kết quả ñánh giá ñộ dài miễn dịch của vịt sau khi tiêm vacxin bằng phương pháp công cường ñộc 75 4.18 Kết quả nghiên cứu thời gian bảo quản vacxin dịch tả vịt chủng C trên môi trường nuôi cấy tế bào 78 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………. viii DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 1.1 Gan sưng, hoại tử 12 1.2 Tim sưng, xuất huyết mỡ vành tim 13 1.3 Dạ dày tuyến xuất huyết 13 4.1 Bệnh tích tế bào do virus dịch tả vịt chủng C gây ra 43 4.2 Tế bào xơ phôi gà một lớp không gây nhiễm virus 44 4.3 Hiệu giá virus dịch tả vịt sau các lần cấy chuyển 50 4.4 Sơ ñồ quy trình sản xuất vacxin dịch tả vịt chủng C nhược ñộc ñông khô bằng công nghệ nuôi cấy tế bào 56 4.5 Hiệu giá virus dịch tả vịt của các liều gây nhiễm 60 4.6 Hiệu giá virus tại các thời ñiểm sau khi gây nhiễm virus dịch tả vịt chủng C trên môi trường nuôi cấy tế bào 62 4.7 Kết quả kiểm tra ñộ ẩm và ñộ chân không của vacxin dịch tả vịt trên môi trường nuôi cấy tế bào nhược ñộc ñông khô 67 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………. 1 1. MỞ ðẦU 1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ðỀ TÀI Việt Nam là nước ñứng thứ 2 trên thế giới, sau Trung Quốc về tổng ñàn vịt nuôi. Theo số liệu thống kê của FAO, năm 2003: tổng số vịt của Việt Nam là 60 triệu con và ñến năm 2009 [16] là 84 triệu con. Cùng với sự phát triển của ñàn vịt nuôi ñã làm gia tăng các bệnh truyền nhiễm, gây thiệt hại lớn về kinh tế ñối với chăn nuôi vịt theo hướng công nghiệp. Bệnh dịch tả vịt là một trong những bệnh quan trọng nhất và gây thiệt hại nặng nề cho ngành chăn nuôi vịt. Là một bệnh truyền nhiễm cấp tính, gây tử vong cao cho vịt, bệnh có triệu chứng chủ yếu là sốt cao, sưng ñầu, chân mềm yếu, bại liệt, ỉa phân xanh. Bệnh gây ảnh hưởng nghiêm trọng ñến kinh tế ñối với các ñàn thuỷ cầm vì nó gây tỷ lệ chết cao lên ñến 90%, sự loại thải cao và gây giảm sản lượng trứng từ 25 – 40% ở những ñàn vịt ñẻ. ðể phòng bệnh dịch tả vịt, biện pháp duy nhất và hiệu quả nhất là thực hiện các biện pháp an toàn sinh học và sử dụng vacxin phòng bệnh. Hiện nay trên thế giới cũng như ở Việt Nam ñang sử dụng rộng rãi các loại vacxin dùng virus dịch tả vịt thích ứng trên phôi vịt, phôi gà và trên tế bào xơ phôi gà. Vacxin dịch tả vịt nhược ñộc ñông khô là vacxin truyền thống của Xí nghiệp thuốc thú y Trung ương ñược sản xuất bằng công nghệ cấy chuyển virus dịch tả vịt chủng C vào xoang niệu nang của phôi vịt ấp 9 – 12 ngày tuổi. Mỗi năm xí nghiệp sản xuất và cung ứng khoảng trên 20 triệu liều vacxin. Vacxin có hiệu lực rất tốt và có thể tiêm thẳng vào ổ dịch. Tuy nhiên, ñây là loại vacxin sản xuất bằng công nghệ truyền thống. Do vậy, sản phẩm vẫn còn một số khiếm khuyết nhỏ ñó là vacxin ñược sản xuất bằng cách gây nhiễm trên trứng vịt có phôi, mà trong ñiều kiện Việt nam trứng vịt SPF vẫn chưa sản xuất ñược do vậy chỉ tiêu thuần khiết rất khó ñạt ñược yêu cầu như mong muốn. . tài: Nuôi c y virus dịch tả vịt chủng C trên môi trường tế bào xơ phôi gà một lớp và bư c ñầu sản xuất v c xin dịch tả vịt như c ñ c ñông khô . 1.2. M C TIÊU. rãi c c loại vacxin dùng virus dịch tả vịt thích ứng trên phôi vịt, phôi gà và trên tế bào xơ phôi gà. Vacxin dịch tả vịt như c ñ c ñông khô là vacxin