Quy trình nuôi cấy virus dịch tả vịt chủng C trên môi trường tế bào xơ phôi gà và sản xuất vắc xin dịch tả vịt nhược độc đông khô

Lịch sử và tình hình bệnh dịch tả vịt trên thế giới và Việt Nam Bệnh dịch tả vịt là bệnh truyền nhiễm do herpesvirus gây ra trên vịt,

Virus dịch tả vịt có trong máu, phủ tạng và các chất bài tiết như phân, nước mũi, nước mắt từ vịt bệnh hoặc từ các loài thủy cầm hoang dã di trú theo mùa có mang trựng virus dịch tả vịt ủược bài thải ra và tồn tại trong cỏc nguồn nước ao, hồ. Theo tác giả Nguyễn Lân Dũng (1972) [7], sau 36 giờ gây nhiễm virus cường ủộc trờn tế bào xơ phụi vịt ủó xuất hiện bệnh tớch tế bào: tế bào co trũn lại, thoái hóa và rụng khỏi thành bình tạo thành khoảng trống, xung quanh là những sợi bào (synciticum) như những dải ủăng ten.

Virus giống và cỏc ủặc ủiểm của virus giống

23 Người ta cú thể xỏc ủịnh hàm lượng khỏng thể trong cơ thể vịt sau khi ủược tiờm vacxin cựng với những chỉ tiờu trờn làm căn cứ ủể xỏc ủịnh thời gian cần thiết cho việc tiờm nhắc lại ủối với loại vacxin ủú. Giống virus nờn ủược kiểm tra ủể phỏt hiện bất kỳ một khả năng nào làm tăng cường ủộc lực trở lại của virus. Giống dịch tả vịt ủược sản xuất bằng cỏch gõy nhiễm trờn màng niệu ủệm, hoặc trờn mụi trường tế bào và nuụi cấy ở nhiệt ủộ 37oC.

Dịch niệu ủược thu hoạch từ mỗi trứng và ủược trộn ủều với dung dịch muối ủệm, sau ủú ủem ly tõm với tốc ủộ chậm.

Cỏc tiờu chuẩn kiểm nghiệm ủối với vacxin dịch tả vịt

Vacxin dịch tả vịt ủược chế từ cỏc chủng virus nhược ủộc bằng cỏch cấy truyền nhiều ủời qua trứng cú phụi. Tiến hành kiểm tra an toàn của vacxin dịch tả vịt trên môi trường nuôi cấy tế bào theo TCN 183 – 93 ôVacxin thỳ y – Quy trỡnh kiểm nghiệm vacxin Dịch tả vịt nhược ủộcằ [3]. Theo tiờu chuẩn của ASEAN, ủể kiểm tra chỉ tiờu an toàn của vacxin dịch tả vịt, sử dụng 10 vịt mẫn cảm một ngày tuổi, mỗi con 10 liều vacxin sử dụng tiờm theo ủường ủề nghị.

Vacxin ủược kiểm tra hiệu lực bằng hai cỏch: thử thỏch với chủng virus cường ủộc hoặc chuẩn ủộ hiệu giỏ virus trong mỗi liều vacxin.

Cơ sở của việc tiêm phòng bằng vacxin

Ở giai ủoạn này, hệ thống mỏy hỳt chõn khụng của mỏy ủụng khụ họat ủộng liờn tục ủể tạo ủiều kiện thăng hoa cho cỏc phõn tử nước ủồng thời cũng tạo ủiều kiện chõn khụng trong buồng làm khụ sản phẩm trỏnh ủược cỏc phản ứng oxy húa khử trong quỏ trỡnh ủụng khụ. Gần ủõy, do sự hiểu biết về lý thuyết miễn dịch, sự khụng ngừng cải tiến trong kỹ thuật chẩn đốn, sự phát triển liên tục của những sản phẩm mới và phương thức sử dụng vacxin mới ủó làm cho việc phũng bệnh bằng vacxin ủược giải quyết một cỏch hoàn thiện. Cơ sở của sự tiờm phũng bằng vacxin là phải nhận thức ủược vacxin khụng loại trừ mối ủe doạ nào của tất cả cỏc bệnh truyền nhiễm do virus, vi khuẩn gây ra, vacxin chỉ có ích trong việc giúp con vật tránh sự tấn công ồ ạt của những dịch bệnh nghiêm trọng.

Những trường hợp sử dụng vacxin một cách vội vã trong khi thụng tin về những vacxin này khụng ủầy ủủ gõy nờn sự bất lợi cho việc nghiờn cứu lưu hành bệnh trong ủàn, bởi vỡ khi ủó dựng vacxin rồi thỡ việc phân biệt kháng thể do tiêm vacxin kích thích tạo ra hay kháng thể do bản thõn gia sỳc ủó nhiễm bệnh mà cú rất khú khăn, ủặc biệt là trong trường hợp sử dụng vacxin virus nhược ủộc.

Các loại vacxin dịch tả vịt a. Vacxin vô hoạt

Tác giả còn nghiên cứu chế thử 4 loại vacxin vụ hoạt và ủưa ra kết luận: Vacxin vụ hoạt cũng tạo ủược miễn dịch cho ủàn vịt nhưng ủỏp ứng miễn dịch khụng mạnh mà giỏ thành lại cao. Nguyễn ðức Hiền (1999) [10] nghiên cứu và kết luận phương pháp nhỏ mắt hoặc tiờm bắp hoặc kết hợp cả hai ủều cho ủỏp ứng miễn dịch tương ủối giống nhau và ủạt tỷ lệ bảo hộ hơn 70%. Những vacxin này ủược sản xuất bằng cỏch gõy nhiễm virus dịch tả vịt vào xoang niệu nang của phôi vịt ấp 9 – 12 ngày tuổi hoặc gây nhiễm vào mụi trường tế bào xơ phụi gà.

Vịt ủược miễn dịch với chủng virus này và sau 21 ngày cụng cường ủộc với liều cao chủng cường ủộc, tất cả vịt miễn dịch ủều sống và khụng cú bất kỳ triệu chứng nào của bệnh dịch tả vịt, trong khi tất cả vịt ủối chứng ủều chết.

Khảo sỏt ủặc tớnh gõy phỏ hủy tế bào của virus giống dịch tả vịt chủng C trên môi trường tế bào xơ phôi gà một lớp

Quan sát trên kính hiển vi soi ngược cho thấy: sau khi gây nhiễm, virus dịch tả vịt gõy hủy hoại tế bào rất rừ (thể hiện ở hỡnh 4.1), cỏc tế bào co cụm, tập trung thành từng ủỏm. Với lụ ủối chứng chỉ cú tế bào và mụi trường Eagle MEM, khụng ủược gây nhiễm virus, toàn bộ 12 giếng tế bào phát triển bình thường, tế bào phủ kớn diện tớch ủỏy giếng và hoàn toàn khụng biểu hiện CPE. Theo tỏc giả Nguyễn Thị Kim ðịnh [26], khi cấy truyền 12 ủời virus dịch tả vịt chủng C trên môi trường tế bào xơ phôi gà một lớp, ở lần cấy chuyển ủầu tiờn, sau 120 giờ virus mới tạo biến ủổi bệnh lý tế bào (CPE).

Như vậy, trong thí nghiệm này, với cùng một liều gây nhiễm là 0,1 ml, ở cỏc ủộ pha loóng khỏc nhau thỡ tỷ lệ gõy bệnh tớch tế bào ở cỏc thời ủiểm cũng khỏc nhau và ủều cho kết quả phỏ hủy tế bào hoàn toàn.

Kết quả xỏc ủịnh hiệu giỏ virus giống sau cỏc lần cấy chuyển

52 Qua kết quả kiểm tra trờn bảng 4.5 cho thấy, sau 7 ngày theo dừi, cả 3 mẫu giống gốc dịch tả vịt chủng C ủược kiểm tra vụ trựng trờn cỏc loại mụi trường thạch mỏu, nước thịt, nước thịt gan yếm khớ và thạch nấm ủều cho kết quả âm tính (-), không có vi khuẩn mọc trên các môi trường kiểm tra. Với lô giống gốc dịch tả vịt chủng C nuôi cấy trên môi trường tế bào ủược chỳng tụi kiểm tra an toàn trực tiếp trờn vịt nuụi và ủược tiến hành theo tiờu chuẩn ngành 183 – 93 ôVacxin thỳ y – Quy trỡnh kiểm nghiệm vacxin Dịch tả vịt nhược ủộcằ [3]. Theo kết quả kiểm tra trên bảng 4.7 cho thấy: Sau khi tiêm virus giống gốc dịch tả vịt chủng C nuụi cấy trờn mụi trường tế bào và theo dừi trong 14 ngày, tất cả số vịt ủược tiờm ủều sống khoẻ, phỏt triển bỡnh thường, khụng cú phản ứng cục bộ cũng như phản ứng toàn thân.

Ở cả 3 lụ thớ nghiệm, với những vịt ủược tiờm virus giống gốc dịch tả vịt chủng C thích nghi trên môi trường tế bào xơ phôi gà, qua thời gian theo dừi 14 ngày, tất cả vịt ủều sống khỏe mạnh, ăn uống và hoạt ủộng bỡnh thường.

Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất vacxin dịch tả vịt nhược ủộc ủụng khụ nuụi cấy trờn mụi trường tế bào

- Giống gốc virus dịch tả vịt chủng C nuôi cấy trên môi trường tế bào vô trùng, không tạp nhiễm với virus viêm gan vịt, an toàn và hiệu quả. Sử dụng panh, kộo vụ trựng cắt bỏ ủầu thai, chân, cánh, loại bỏ hết nội tạng, rửa sạch bằng dung dịch PBS-. Giống virus dịch tả vịt chủng C ủược pha loóng vào mụi trường phỏt triển Eagle MEM và gõy nhiễm vào tế bào xơ phụi gà 1 lớp ủó nuụi cấy 48 giờ.

Chọn những chai nguyên dịch virus dịch tả vịt trên môi trường nuôi cấy tế bào vụ trựng và cú hiệu giỏ virus từ 106TCID50/ 0,1 ml trở lờn ủể pha ủụng khụ.

Xỏc ủịnh liều gõy nhiễm thớch hợp của virus dịch tả vịt chủng C trên môi trường nuôi cấy tế bào

59 Qua bảng 4.9 cho thấy: ở cỏc nồng ủộ pha loóng virus khỏc nhau tương ủương với cỏc liều gõy nhiễm khỏc nhau thỡ thời gian xuất hiện bệnh tớch tế bào và bị phá hủy hoàn toàn (CPE 100%) cũng khác nhau. Với nồng ủộ pha loóng virus 10-4 (tương ủương với liều gõy nhiễm 103TCID50) cũng thỡ sau 48 giờ bắt ủầu xuất hiện bệnh tớch tế bào nhưng thời gian tế bào bị phỏ hủy hoàn toàn ủó rỳt ngắn xuống 72 giờ. Nồng ủộ pha loóng virus 10-3 (tương ủương với liều gõy nhiễm 104TCID50) bệnh tích tế bào xuất hiện sớm nhất là 24 giờ sau khi gây nhiễm virus và ủến 72 giờ tế bào bị phỏ hủy hoàn toàn.

Ở lụ ủối chứng: cỏc chai ủối chứng khụng gõy nhiễm virus, theo dừi ủến 120 giờ, tế bào vẫn nguyờn vẹn, nhưng ủó cú tế bào già bong ra khỏi thành chai nuôi.

Xỏc ủịnh thời ủiểm thớch hợp ủể thu hoạch huyễn dịch sau khi gõy nhiễm virus dịch tả vịt chủng C

Từ những kết quả nghiên cứu trên chúng tôi rút ra kết luận: Liều gây.