KIỂM ĐỊNH QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM VAC XIN DỊCH tả vịt NHƯỢC độc ĐÔNG KHÔ sản XUẤT TRÊN môi TRƯỜNG tế bào sơ PHÔI gà

TRƯỜNG ĐẠI HỌC HẢI PHỊNG VIỆN SINH-NƠNG HỌ VÀ TÊN: ĐỖ THÀNH NHÂN Lớp: Đại Học Công Nghệ Sinh Học Khóa: K13 TÊN ĐỀ TÀI: KIỂM ĐỊNH QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM VACXIN DỊCH TẢ VỊT NHƯỢC ĐỘC ĐÔNG KHÔ SẢN XUẤT TRÊN MÔI TRƯỜNG TẾ BÀO SƠ PHÔI GÀ BÁO CÁO ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hải Phòng, năm 2016 PHẦN 1: ĐẶTVẤNĐỀ Tính cấp thiết đềtài Bệnh Dịch tả vịt bệnh truyền nhiễm cấp tính lồi vịt, ngỗng thiên nga Bệnh khơng gây nhiễm cho lồi gia cầm khác, động vật có vú người Nguyên nhân gây bệnh Herpesvirusthuộc họ Herpesviridaegây Bệnh gây cho vịt lứa tuổi với triệu chứng chủ yếu sốt cao, sưng túi mật, chảy nước mắt, sưng đầu, liệt chân, ỉa chảy phân xanh Sau nhiễm bệnh – ngày vịt chết, tỉ lệ chết cao, lên đến 100%, gây tổn thất lớn kinh tế cho người chănni Để phịng bệnh Dịch tả vịt, biện pháp an toàn, hiệu kinh tế tiêm phòngvacxin Vacxin nhược độc dịch tả vịt chủng C sản phẩm vacxin Công Ty TNHH MTV AVAC Việt Nam sản xuất cách gây nhiễm virus nhược độc dịch tả vịt chủng C phôi vịt Mỗi năm công ty sản xuất cung ứng hang triệu liều vacxin Vacxin có hiệu lực tốt tiêm thẳng vào ổ dịch Tuy nhiên, loại vacxin sản xuất công nghệ truyền thống Do vậy, sản phẩm cịn số khiếm khuyết nhỏ vacxin sản xuất cách gây nhiễm phôi vịt, mà điều kiện Việt nam trứng vịt SPF chưa sản xuất tiêu khiết khó đạt yêu cầu mong muốn Để khắc phục vấn đề tồn trên, thạc sỹ Nông nghiệp Trần Thị Thanh Xuân tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nuôi cấy virus Dịch tả vịt chủng C môi trường tế bào xơ phôi gà lớp để sản xuất vacxin nhược độc dịch tả vịt đông khô”, bước đầu thành công xây dựng quy trình sản xuất vacxin Dịch tả vịt virus Dịch tả vịt chủng C gây nhiễm tế bào xơ phôi gà lớp Công nghệ sản xuất vacxin phương pháp nuôi cấy tế bào công nghệ tiên tiến nhiều nước, nhiều cơng ty sản xuất vacxin đa quốcgiasửdụngđểchếtạocácvacxinphịngbệnhchogiasúc,giacầm.Vacxinsản xuất theo công nghệ đảm bảo tạo sản phẩm đạt đầy đủ tiêu chất lượng như: độ khiết, tính vơ trùng, tính an tồn, tính hiệu lực đặc biệt tiêu độ khiết vacxin Bên cạnh với cơng nghệ ứng dụng vào việc sản xuất vacxin theo quy mô cơng nghiệp, có thời gian sản xuất nhanh, số lượng lớn giá thànhhạ Để khẳng định chất lượng vacxin nhược độc dịch tả vịt đông khô nuôi cấy mơi trường tế bào nói trên, tơi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Kiểm định quy trình kiểm nghiệm vacxin dịch tả vịt nhược độc đông khô sản xuất môi trường tế bào công ty AVAC Việt Nam” Mục đích đềtài Xác định số tiêu vacxin Nhược độc dịch tả vịt sản xuất môi trường tế bào Ý nghĩa khoa học thực tiễn đềtài Kết nghiên cứu đề tài cung cấp thông tin cần thiết sản xuất nhược độc dịch tả vịt sản xuất môi trường tế bào Là sở khoa học cho việc xây dựng quy trình sử dụng, bảo quản vacxin góp phần phịng chống bệnh Dịch tả vịt đạt hiệu cao Phần 2: TỔNG QUAN TÀILIỆU Giới thiệu chung bệnh dịch tả vịt Bệnh dịch tả vịt (Pestisanatum): bệnh truyền nhiễm cấp tính, lây lan mạnh lồi thuỷ cầm loại Herpesvirus thuộc họ Herpesvirideae gây với triệu chứng chủ yếu: sốt cao, chảy nước mắt, sưng đầu, liệt chân, ỉa chảy phân xanh Bệnh tích đặc trưng thường thấy đường tiêu hóa: thực quản, ổ nhớp xuất huyết, dày tuyến, xuất huyết, gan sưng hoại tử (Nguyễn Như Thanh Cs, 2001) 1.1 Lịch sử phân bố bệnh giới Việt Nam • Trên giới Bệnh dịch tả vịt xuất vào năm 1923 Hà Lan, vịt có triệu chứng sốt cao, ủ rũ, khát nước chết sau -5 ngày Sau đó, bệnh xuất nhiều nước Pháp, Trung Quốc, Bỉ, Ấn Độ, Mỹ… Bệnh dịch tả vịt bệnh lây lan mạnh, gây tử vong cao đến 80% - 100% đàn thủy cầm mẫn cảm Đối với đàn vịt đẻ, sản lượng trứng giảm từ 25- 40% Baudet (1923) nghiên cứu bệnh khơng tìm thấy vi khuẩn gây bệnh cho vịt khỏe nước chiết phủ tạng vịt ốm sau qua nến lọcChamberland L3 Sau ơng tiếp tục gây bệnh cho thỏ gà không thành công Năm 1930, Hà Lan, De Zeeuw mô tả trường hợp bệnh tương tự xảy đàn vịt 150 Năm 1942, dịch tái phát đất nước làm chết 2600 tổng số 5700 vịt Vịt ốm, ỉa phân xanh, mổ khám vịt chết thấy xuất huyết tim, dày tuyến, tá tràng, viêm kiểu bạch hầu cuống họng lỗ huyệt Lần này, Boss (1943) phân lập virus cấy truyền 18 đời vịt Năm 1949, Hội nghị thú y giới lần thứ XIV, vào kết nghiên cứu chủng virus Boss (1943) phân lập được, Jansen Kunst đề nghị gọi tên bệnh Duck virus enteritis (DVE) (OIE, 2000) Bệnh dịch tả vịt cịn có tên gọi khác như: Endenpest (Hà Lan), Pets du canard (Pháp), Enteupest (Đức) (Nguyễn Xuân Bình, 2006) Vào tháng giêng tháng hai năm 1973, Mỹ, bệnh dịch tả vịt xuất lần đầu đàn vịt hoang dại, thuộc vùng lân cận hồ Andes, miền nam Dakota Từ hồ Andes, dịch bệnh lan mạnh nhanh chóng phá hủy đàn vịt Khoảng 40% tổng số 100.000 vịt hoang dại, phần lớn vịt trời bị chết đợt dịch Cao điểm đợt dịch, ngày làm chết 1000 chim, Brand, C J • Tại Việt Nam Năm 1963, bệnh phát Cao Bằng làm chết 3000 vịt (Đặng TrầnDũng, 1963), sau bệnh lây lan có mặt hầu hết tỉnh thành nước Theo thống kê OIE (2006), Việt Nam nước bị bệnh dịch tả vịt gây thiệt hại nặng nề Năm 1999, bệnh làm chết 51.752 tổngsố123.851 vịt Năm 2000 có 2.964 con, năm 2002 có 15.680 năm 2004 có 22447 vịt chết vìbệnh Vào năm 1969, bệnh phát đàn vịt ni Hà Nội, từ xuất rộng rãi nhiều tỉnh thuộc đồng Bắc tỉnh Nam Năm 1971, dịch lại phát ạt tỉnh Ninh Bình, Quảng Ninh, Lạng Sơn, Hà Bắc (cũ) thành phố Hải Phòng Đến năm 1980, dịch phát mạnh mẽ Hà Nam Ninh (cũ), Thanh Hóa đồng sơng Cửu Long Từ dịch lan tới tận Nghệ Tĩnh, Kiên Giang, Hậu Giang, ĐồngTháp Bệnh dịch tả vịt thường truyền lây tiếp xúc trực tiếp đàn vịt bệnh vịt khỏe, tiếp xúc gián tiếp qua mơi trường có mầm bệnh nguồn nước, người chăn nuôi, dụng cụ chăn ni, Virus dịch tả vịt có máu, phủ tạng chất tiết phân, nước mũi, nước mắt từ vịt bệnh từ loài thủy cầm hoang dã di trú theo mùa có mang trùng virus dịch tả vịt thải tồn nguồn nước ao, hồ Những đàn vịt cảm thụ khác đến sinh sống nguồn nước bị nhiễm bệnh Ở đồng sông Cửu Long, bệnh dịch tả vịt thường xảy quanh năm cao từ tháng đến tháng Vì vậy, bệnh dịch tả vịt cần quan tâm nghiên cứu nhiều nhằm tìm giải pháp giảm thiệt hại cho người chăn nuôi 1.2 Virus dịch tảvịt 1.2.1 Phânloại Virus dịch tả vịt thuộc họ Herpesvirideae họ Alphaherpesvirinae, giống Herpesvirus nhóm Herpes Virus có serotyp biết đến có nhiều chủng có độc lực khác tồn tự nhiên Virus khơng có đặc tính gây ngưng kết hồngcầu 1.2.2 Hình thái, cấu trúc virus dịch tả vịt Nhìn qua kính hiển vi điện tử thấy: Virus hồn chỉnh có hình thái gần trịn, bên ngồi lớp vỏ bọc có lõi Ở tế bào gây nhiễm virus, sau 24 thấy hạt virus nhân nguyên sinh chất Thể vùi nhân tập hợp khơng có hình thù, trông giống bụi Trong nhân tế bào có khơng vùi xuất khoảng trống, có virus tập hợp virus có capxit hình cầu sáu cạnh Nucleocapxit có đường kính 93,5 nm, sau qua màng nhân vào nguyên sinh chất, đường kính hạt virus tăng lên đo 136 nm Khi vào khơngbào virus thành thục có đường kính khoảng 250 nm Virus qua lọc Chamberland, Berkefeld không qua màng lọc Seitz Bằng phương pháp lọc qua màng lọc, Hessdardiri (1968) nhận xét, virus nhược độc dịch tả vịt chủng Jansen virus cường độc có kích thước từ150– 250nm.Nhưvậychúngthuộcnhómviruscókíchthướctrungbình Virus dịch tả vịt có hệ gen AND sợi đôi gồm 180 Kbp Trọng lượng phân tử 19 x 106Dalton Virus có vỏ bọc ngồi Hình 2.1: Herpes virus 1.2.3 Đặc tính ni cấy virus dịch tả vịt • Ni cấy virus phơitrứng Theo Jansen (1968) virus dịch tả vịt sau tiêm truyền phơi vịt dễ dàng thích nghi phơigà Virus dịch tả vịt ni cấy vào phôi trứng vịt Bắc Kinh ấp nhiệt độ 39,5 – 41,5oC, hay tế bào xơ phôi gan thận vịt màng niệu đệm củaphôi vịt ấp – 14 ngàytuổi Theo tác giả Trần Minh Châu (1980) cho màng nhung niệu đường tiêm truyền tốt Nguyễn Như Thanh (2001), ni cấy virus màng niệu đệm xoang niệu mô (alantoid) thai vịt ấp 12 ngày tuổi Sau – ngày thai chết với bệnh tích: xuất huyết da vùng lưng, rìa cánh, đầu, gan, tối có điểm xuất huyết hoại tử, màng nhung niệu sưng dày lên Nếu tiếp truyền 12 đời liên tiếp phơi gà, virus thích nghi, từ đời truyền thứ ba phôi gà chết sau – ngày tiêm vào màng niệu đệm chết sau – ngày tiêm vào xoang niệumô Qua nhiều lần cấy truyền virus phôi vịt phôi gà, độc lực virus giảm dần vịt Từ đó, người ta sử dụng chủng virus nhược độc qua phôi vịt, phôi gà để chếvacxin • Nuôi cấy virus môi trường tế bào xơ phơi lớp Virus dịch tả vịt ni cấy môi trường tế bào xơ phôi vịt, phôi gà lớp gây biến đổi bệnh lý cho tế bào (Jansen, 1968) Burgess (1981) công bố virus dịch tả vịt có khả nhân lên loại tế bào xơ phôi vịt, xơ phôi ngan, gan phơi ngan, xơ phơi gà Theo Ronald Atlanasio khơng quan sát thấy biến đổi bệnh lý tế bào ni cấy virus tế bào thận lợn dịng PK 15, tế bào WI – 38, RD Hela, Hep – 2, Vero, LleMK, BGM BD (Trần Minh Châu, 1987) Theo nghiên cứu tác giả Trần Minh Châu (1980), đem chủng virus T nuôi cấy tế bào phôi vịt, sau cấy virus vào 36 giờ, tế bào bắt đầu có biến đổi, co trịn phồng lên Đến 48 mặt lớp tế bào có ổ thối hóa, tế bào rụng khỏi thànhbình Theo Nguyễn Như Thanh (2001), ni cấy virus dịch tả vịt môi trường tế bào xơ phôi gà phôi vịt lớp Virus gây hủy hoại tế bào sau 48 gây nhiễm Quan sát Plague virus dịch tả vịt, người ta nhận thấy: sau 48 gây nhiễm Plague bắt đầu hình thành phát triển tối đa sau ngày Với chủng virusnhượcđộc,Plaqueđềugọnvàsángrõ,ởngày thứ3cóđườngkính3mm,sau6 ngày – mm sau 14 ngày 10 mm Theo Dardini Hess (1968), Plague virus dịch tả vịt cường độc hình trịn, to nhỏ khơng đều, có đường kính từ – mm Plaque virus nhược độc dịch tả vịt hơn, có bờ gọn sáng, đường kính – mm Theo tác giả Nguyễn Lân Dũng (1972), sau 36 gây nhiễm virus cường độctrên tế bào xơ phôi vịt xuất bệnh tích tế bào: tế bào co trịn lại, thối hóa vàrụng khỏi thànhbìnhtạo thành khoảng trống, xung quanh sợi bào(synciticum) dải đăng ten Lớp tế bào bị phá hủy hoàn toàn vào ngàythứ Trong bình ni cấy nồng độ pha lỗng, phát Plague Trên môi trường nuôi cấy khác nhau, xuất Plague khác Sự nhân lên hình thành Plague virus cường độc đẹp môi trường tế bào xơ phôi ngan uyên ương, sau đến xơ phơi vịt Bắc Kinh, vịt đen vịt đầu đỏ, Plague tế bào xơ phôi vịt mốc vịt bãi Virus nhược độc dịch tả vịt Hà Lan lại có thứ tự mơi trường thích hợp khác: tế bào xơ phôi vịt Bắc Kinh, tế bào xơ phôi gà, trĩ Mông Cổ, cun cút (Ronald Atlanasio, Robert Olson, James, C Johnson, 1980) (Trần Minh Châu, 1987) Đối với virus nhược độc dịch tả vịt chủng Jansen, theo nghiên cứu môn Vi sinh vật – Truyền nhiễm – Bệnh lý, trường ĐHNNHN nhận thấy virus thích ứng môi trường nuôi tế bào xơ phôi gà Chỉ sau 24 cấy virus, tế bào bắt đầu có tượng hủy hoại, bệnh tích tế bào chủ yếu thể tượng tế bào bị biến dạng, co trịn, phình to ra, tập trung thành đám, nhìn rõ kính hiển vi quanghọc • Ni cấy động vật cảmthụ Có thể dùng vịt ngày tuổi để nuôi cấy virus Sau – 12 ngày gây nhiễm, vịt chết với triệu chứng, bệnh tích điển hình bệnh dịch tả vịt Ngồi vịt dùng ngan con, ngỗng con, gà nở để gây bệnh 1.2.4 Độc lực virus dịch tả vịt Đã xác định số chủng virus dịch tả vịt có độc lực khác nhau: Hà Lan có chủng O độc lực mạnh nhất, sau đến chủng W59, W60 (Jansen, 1968) Ở Việt Nam có chủng 769, 880 có độc lực mạnh nhất, sau chủng NH, NB, C, T (Trần Minh Châu, 1987) Theo Nguyễn Đức Hiền (2005) phân lập chủng virus gây bệnh dịch tả vịt Cần Thơ cho biết chủng virus có độc lực cao, có khả gây bệnh gây chết vịt phịng thí nghiệm tiêm bắp với liều 10 3ELD50/ ml Năm 2005, tác giả Nguyễn Ngọc Điểm (2005) [8] phân lập thành công chủng virus cường độc dịch tả vịt VG – 2004 Qua bước đầu khảo sát đặc tính sinh học chủng virus này, tác giả cho biết virus dịch tả vịt VG – 2004 có độc lực mạnh virus dịch tả vịt chủng 769 tác giả Trần Minh Châu phân lập 1.2.5 Sức đề kháng virus dịch tả vịt Virus nhạy cảm với ête chloroform (Hess, 1968) Cồn 75 oC diệt virus – 30 phút, axit phenic 0,5% diệt virus sau 30 phút Ở 22 oC NaOH 2%, NH4OH 0,5% giết chết virus sau 30 phút Với nhiệt độ: virus khả gây nhiễm nhiệt độ 56 oC sau 10 phút 50oC sau 90 – 120 phút Ở nhiệt độ phịng (22 oC) virus tồn 30 ngày (Hess, 1968) Trong điều kiện lạnh -10 oC ñến -20oC virus tồn hàng năm Làm đơng khơ chất chứa virus máu, tim, gan, màng nhung niệu phơi trứng vịt giữ virus nhiều năm mà không độc lực Virus ổn định độ pH từ – 10 bị bất hoạt pH < pH >10 1.3 Bệnh dịch tảvịt 1.3.1 Loài mắcbệnh Bệnh dịch tả vịt bệnh nhiều loài vịt: vịt trời, vịt mỏ nhọn, vịt đầu đỏ, Các loài thủy cầm khác ngan, ngỗng, thiên nga số loài chim hoang dã cảm nhiễm bệnh (Friend, 1973), (Docherty, D E Franson, C J.,1992) Vịt loài cảm nhiễm nhất, giống vịt lứa tuổi mắc bệnh Tỷ lệ vịt mắc bệnh chết khoảng – 100% Mức độ cảm nhiễm khác tùy theogiốngvịt Lồi vịt nhọn coi lồi mẫn cảm với bệnh (Sandhu, T S Leibovitz, L., 2003) Các động vật khác bồ câu, cơng, động vật có vú người khơng cảm thụ vớibệnh Theo Friend (1973), báo cáo bệnh dịch tả vịt xảy hồ Andes, miền nam Dakota vào năm 1973, ước tính có 43,000 vịt ngỗng 10 độc dịch tả vịt sản xuất môi trường tế bào Chỉ tiêu khiết vacxin nhược độc dịch tả vịt sản xuất mơi trường tế bào ngồi kiểm tra tạp nhiễm nấm, vi khuẩn phải kiểm tra tạp nhiễm virus viêm gan vịt Để kiểm tra tạp nhiễm virus viêm gan vịt vacxin áp dụng quy trình kiểm nghiệm vacxin nhược độc dịch tả vịt TCN 183 - 93 Ở tiêu này, lô vacxin dùng mẫu vacxin theo quy trình lấy mẫu 10TCN 160-92, mẫu vacxin đơng khơ hồn ngun trở lại nước muối sinh lý vơ trùng, sau tiêm vào da cho vịt nở, 10 liều vacxin sử dụng, 10 vịt không tiêm làm đối chứng theo dõi 14 ngày Kết trình bày bảng 4.3 Bảng 4.3: kết kiểm tra nhiễm virus viêm gan vịt vacxin nhược độc dịch tả vịt sản xuất môi trường tế bào sơ phôi Lô vacxi n I II III Số mẫu vacxi n kiểm tra Đối tượng Lứa Tổng tuổi số vịt/ vịt mẫu (ngày) (con) Liều tiêm (liều ) Vị trí tiêm Thời gian theo dõi (ngày) Vịt TN 15 10 Dưới da 14 Vịt ĐC Vịt TN 1 15 -10 -Dưới da 14 14 Vịt ĐC Vịt TN 1 15 -10 -Dưới da 14 14 Vịt ĐC 14 3 Kết Bình thườn g Bình thườn g Bình thườn g Ghi chú: Vịt TN: Vịt thí nghiệm Vịt ĐC: vịt đối chứng Kết bảng 4.3 chothấy: Lô vacxin I: Kiểm tra mẫu vacxin Ở lơ thí nghiệm, mẫu vacxin tiêm cho vịt ngày tuổi, 10 liều vacxin tiêm da.Theo dõi 50 vịt 14 ngày thấy 15 vịt tiêm vacxin khỏe mạnh, hoạt động bình thường giống vịt lơ đối chứng Lô vacxin II, III, kiểm tra mẫu vacxin cho lơ Ở lơ thínghiệm, mẫu vacxin tiêm cho 15 vịt ngày tuổi, 10 liều vacxin tiêm da Sau tiêm theo dõi 14 ngày thấy 15 vịt thí nghiệm lơ khỏe mạnh, hoạt động bình thường vịt đối chứng  Như vậy, lô vacxin nhược độc dịch tả vịt đông khô sản xuất môi trường tế bào sơ phôi gà lớp không bị nhiễm virus viêm gan vịt  Cả lô vacxin kiểm tra đạt yêu cầu tiêu khiết: không nhiễm vi khuẩn, nấm virus viêm gan vịt 3.1.3 Kết kiểm tra tiêu an toàn vacxin nhược độc dịch tả vịt sản xuất mơi trường tếbào An tồn tiêu quan trọng vacxin Một vacxin sử dụng phòng bệnh cho động vật phải đạt tiêu Một vacxin đánh giá an toàn tiêm cho động vật phịng thí nghiệm liều vacxin cao gấp nhiều lần liều sử dụng, động vật khơng có có phản ứng sau tiêm (phản ứng mức độ cho phép), vật sống, hoạt động bìnhthường Phương pháp kiểm tra tiêu an toàn khuyến cáo nên kiểm tra động vật sử dụngvacxin Với lô vacxin nhược độc dịch tả vịt sản xuất môi trường tế bào kiểm tra tiêu an toàn dùng vịt ngày tuổi vịt có trọng lượng 0.7 – 1kg Mỗi lô vacxin kiểm tra mẫu, mẫu vacxin đơng khơ sau hồn ngun với nước muối sinh lí, tiêm da cho vịt ngày tuổi với 10 liều vacxin/con, tiêm da cho vịt có trọng lượng 0.7 – kg với 50 liều vacxin/con ( Tiêu chuẩn ngành TCN 183- 93 Quy trình kiểm nghiệm vacxin Nhược độc dịch tả vịt) Theo dõi phản ứng cục nơi tiêm sau 24 giờ, phản ứng toàn thân sau 14 ngày Kết thu trình bày bảng 4.4 51 Bảng 4.4: Kết kiểm tra tiêu an tồn phịng thí nghiệm vacxin nhược độc dịch tả vịt sản xuất môi trường tế bào Số Lô mẫu vacxin kiểm tra Đối tượng thí nghiệm Tổng số vịt/ mẫu (con) Số liều vacxin/ (liều) Thời gian theo dõi (ngày) Kết Tỷ lệ an tồn (%) Có Bình phản thường ứng I II III Vịt 10 14 0/9 9/9 100 Vịt 0,7-1kg 50 14 0/9 9/9 100 Vịt 10 14 0/9 9/9 100 Vịt 0,7-1kg 50 14 0/9 9/9 100 Vịt 10 14 0/9 9/9 100 Vịt 0,7-1kg 50 14 0/9 9/9 100 3 Kết bảng 4.4 cho thấy: Lô vacxin I: với mẫu vacxin, kiểm tra sau tiêm vacxin cho vịt ngày tuổi, với 10 liều vacxin/1 con, theo dõi sau 14 ngày vịt phát triển bình thường, tỷ lệ an tồn 100% Với vịt có trọng lượng 0,7 – 1kg, tiêm 50 liều vacxin/1con Theo dõi sau 14 ngày vịt khỏe mạnh, hoạt động bình thường Tỷ lệ an tồn đạt100%  Như lô vacxin I, qua kiểm tra tiêu an toàn đạt tỷ lệ an toàn là100% Lô vacxin II: tiến hành kiểm tra mẫu vacxin, tiêm 10 liều vacxin cho vịt ngày tuổi 50 liều vacxin cho vịt có trọng lượng 0,7 – kg Sau tiêm theo dõi 14 ngày thấy tất vịt ngày tuổi vịt có trọng lượng 0,7 – kg khỏe mạnh hoạt động bình thường, tỷ lệ an tồn đạt 100% 52 Lơ vacxin III: sau kiểm tra đạt tỷ lệ an toàn 100% bảng số liệu thểhiện  Như vậy, lô vacxin qua kiểm tra tiêu an toàn đạt yêu cầu Sau kiểm tra tiêu an tồn lơ vacxin nhược độc dịch tả vịt sản xuất môi trường tế bào điều kiện phịng thí nghiệm đạt u cầu, tiến hành kiểm tra tiêu an toàn lô vacxin đàn vịt con, vịt đẻ nuôi địa phương: thuộc huyện Từ Liêm Hoài Đức, Hà Nội Mỗi vịt tiêm liều vacxin, theo dõi đàn vịt sau 14 ngày Kết thu trình bày bảng 4.5 Bảng 4.5: Kết kiểm tra tiêu an toàn vacxin dịch tả vịt sản xuất tế bào địa phương ( Từ Liêm, Hồi Đức, Hà Nội) Lơ vacxin Số mẫu vacxin kiểm tra I II III Tổng hợp 18 Đối tượng Số đàn Số vịt (con) Kết Vịt 270 Có phản ứng Vịt đẻ Vịt 3 280 210 0 280 210 Vịt đẻ Vịt 3 340 220 0 340 220 Tỷ lệ an toàn (%) Bình thường 270 100 100 100 Vịt đẻ Vịt Vịt đẻ 310 310 18 1630 1630 100 53 Kết bảng 4.5 chothấy: Lô vacxin I : Với mẫu vacxin tiến hành tiêm cho đàn vịt có số lượnglà270convà3đànvịtđẻcósốlượnglà280con.Mỗivịttiêmdướida1liềuvacxin, theo dõi vịt sau 14 ngày thấy 270 vịt 280 vịt đẻ khỏe mạnh, hoạt động bình thường Tỷ lệ an tồn đạt 100% Lơ vacxin II: với mẫu vacxin tiến hành tiêm cho đàn vịt số lượng 210 đàn vịt đẻ có số lượng 340 liều vacxin da theo dõi sau tiêm 14 ngày Kết 210 vịt 340 vịt đẻ sống khỏe mạnh hoạt động bình thường Tỷ lệ bảo an tồn 100% Lơ vacxin III kiểm tra với mẫu vacxin 220 vịt 310 vịt đẻ kết tỷ lệ an toàn đạt 100%  Với 18 mẫu lô vacxin nhược độc dịch tả vịt sản xuất môi trường tế bào, sử dụng cho 1630 vịt con, vịt đẻ nuôi thực địa đạt tỷ lệ an toàn là100%  Như kiểm tra tiêu an tồn lơ vacxin nhược độc dịch tả vịt sản xuất môi trường tế bào xơ phơi gà phịng thí nghiệm thực địa đạt yêu cầu theo tiêu chuẩn ngành 183 – 93 54 Hình 4.5: Gan sưng, tụ máu, hoạitử Hình 4.4: Vịt chết mắc dịchtảvịt Kết kiểm tra tiêu hiệu lực vacxin nhược độc dịch tả vịt sản xuất môi trường tếbào Hiệu phòng bệnh vacxin phụ thuộc vào nhiều yếu tố, hiệu lực vacxin đánh giá yếu tố định Vì vậy, kiểm tra hiệu lực khâu thiếu kiểm nghiệm loại vacxinnào Để kiểm tra tiêu hiệu lực lô vacxin nhược độc dịch tả vịt sản xuất môi trường tế bào sử dụng phương pháp công cường độc Kiểm tra tiêu hiệu lực vacxin phịng thí nghiệm, với lô vacxin, lô kiểm tra mẫu, mẫu vacxin dùng vịt có trọng lượng 0,7 – 1kg/con, tiêm vacxin da cho vịt với liều vacxin cho con, 15 cho lần thí nghiệm, khôngtiêmvacxinlàmđốichứng.Saukhitiêmvacxin14ngày,sửdụngchủng vịt virus cường độc dịch tả vịt 769 tiêm cho vịt thí nghiệm vịt đối chứng với liều 102LD50 /ml/con Theo dõi vịt sau công 14 ngày Hiệu lực vacxin đánh giá dựa vào tỷ lệ bảo hộ cho vịt Sau kiểm tra tiêu hiệu lực phịng thí nghiệm lô vacxin 55 nhược độc dịch tả vịt sản xuất mơi trường tế bào đạt u cầu,cịn kiểm tra tiêu đàn vịt có trọng lượng 0,7 – kg nuôi địa phương Mỗi lô vacxin tiêm cho2đànvịt,mỗicon1liềuvacxin.Saukhitiêmvacxin14ngày,bắtngẫunhiênmỗi đàn 10 mang phịng thí nghiệm Vịt tiêm vacxin vịt đối chứng thử thách với chủng virus dịch tả vịt cường độc 769, liều dùng 102 LD50/ml/con Theo dõi vịt sau công cường độc 14 ngày Kết kiểm tra hiệu lực lô vacxin nhược độc dịch tả vịt sản xuất tế bào trình bày bảng4 Bảng 4.6: kết kiểm tra hiệu lực vacxin nhược độc dịch tả vịt sản xuất mơi trường tế bào sơ phơi Địa điểm Lơ thí nghiệm I (3) Phịng thí nghiệm II (3) III (3) I Thực địa II III Đối tượng Tổng số vịt/3 mẫu (con) Kết Tỷ lệ bảo hộ (%) Vịt TN 15 Số vịt sống (con) 15 Số vịt chết (con) 100 Vịt ĐC Vịt TN 15 15 0 100 Vịt ĐC Vịt TN 15 15 0 100 Vịt ĐC Vịt TĐ 20 20 0 100 Vịt ĐC Vịt TĐ 20 20 0 100 Vịt ĐC Vịt TĐ 20 20 0 100 Vịt ĐC 5 56 57 Ghichú:TN:Vịtthínghiệm TĐ: VịtThực địa ĐC: Vịt đốichứng Kết bảng 4.6 − Tại phịng thí nghiệm: Khi kiểm tra tiêu hiệu lực lô vacxin cho thấy: - Lô vacxin I: Với 15 vịt tiêm vacxin, sau công cường độc theo dõi sau 14 ngày, 15 khỏe mạnh bình thường, tỷ lệ bảo hộ đạt 100% Trong đó, vịt đối chứng không tiêm vacxin, sau công cường độc 7ngàycả5vịtđềucónhữngtriệuchứngđiểnhìnhcủabệnhdịchtảvịt:sốt,rũ, 3– chảy nước mắt, liệt, ỉa chảy phân xanh, tỷ lệ chết 100% Mổ khám vịt thấy bệnh tích đặc trưng bệnh dịch tả vịt: thực quản, dày tuyến xuất huyết, trực tràng xuất huyết, loét Viêm ngoại tâm mạc, xuất huyết, bao tim viêm, tích nước màng Gan sưng hoại tử, túi mật sưng  Như lô vacxin I đạt tiêu hiệu lực - Lô vacxin II: Với 15 vịt tiêm vacxin, sau công cường độc theo dõi 14 ngày 15 khỏe mạnh bình thường, tỷ lệ bảo hộ đạt 100% Cả vịt đối chứng sau công – ngày xuất triệu chứng điển hình bệnh dịch tả vịt chết với tỷ lệ 100% Sau mổ khám thấy bệnh tích đặc trưng bệnh dịch tả vịt  Như vậy, lô vacxin II đạt tiêu hiệu lực - Lô vacxin III: Với 15 vịt tiêm vacxin, sau công cường độc theo dõi 14 ngày 15 khỏe mạnh bình thường, tỷ lệ bảo hộ đạt 100% Cả vịt đối chứng sau công – ngày xuất triệu chứng điển hình bệnh dịch tả vịt chết với tỷ lệ 100% Sau mổ khám thấy bệnh tích đặc trưng bệnh dịch tả vịt 58  Như vậy, lô vacxin III đạt tiêu hiệu lực  Cả lô vacxin nhược độc dịch tả vịt sản xuất môi trường tế bào sử dụng cho vịt cho vịt cho tỷ lệ bảo hộ cao Vacxin đạt tiêu hiệu lực theo tiêu chuẩn ngành TCN 183 – 93 " Quy trình kiểm nghiệm vacxin nhược độc dịch tả vịt” • Trên thực địa: Khi kiểm tra tiêu hiệu lực lô vacxin cho thấy: - Lô vacxin I: Với 20 vịt đàn tiêm vacxin, sau công cường độc theo dõi sau 14 ngày, 20 khỏe mạnh bình thường, tỷ lệ bảo hộ đạt 100% Cả vịt đối chứng, sau công – ngày vịt xuất triệu chứng điển hình bệnh dịch tả vịt chết với tỷ lệ 100% Sau mổ khám thấy bệnh tích đặc trưng bệnh dịch tả vịt Như vậy, lô vacxin I đạt tiêu hiệu lực kiểm tra thực địa - Lô vacxin II III cho kết tỷ lệ bảo hộ 100% với vịt tiêm vacxin tỷ lệ chết 100% với vịt đối chứng sau thử thách với chủng dịch tả vịt cường độc 769  Như vậy, lô vacxin II III đạt tiêu hiệu lực  Sau thí nghiệm kiểm tra phịng thí nghiệm thực địa huyện Từ Liêm Hoài Đức, Hà Nội thu kết cho thấy lô vacxin nhược độc dịch tả vịt sản xuất môi trường tế bào đạt tiêu hiệu lực, đạt tỷ lệ bảo hộ cho vịt100% Các kết thể rõ thêm hình 4.6: 59 Hình 4.6: Tỷ lệ bảo hộ vịt sau dùng vacxin nhược độc dịch tả vịt sản xuất môi trường tếbào 60 PHẦN 5: KẾTLUẬNVÀĐỀNGHỊ Kếtluận  Hiệu giá virus lô vacxin nhược độc dịch tả vịt sau nuôi cấy môi trường tế bào xơ phôi gà đạt yêu cầu kỹ thuật dao động từ 106,4 TCID50/0,1 ml - 106,8 TCID50/0,1ml  Các lô vacxin qua kiểm nghiêm đạt theo tiêu chuẩn ngành 10 TCN 183 -93: - Vacxin khiết, không nhiễm vi khuẩn, nấm không bị tạp nhiễm virus viêm ganvịt - Vacxin an toàn sử dụng cho vịt sử dụng với 10 liều vacxin/con an toàn cho vịt ≥ 0,7kg với 50 liều vacxin/con - Vacxin có hiệu lực tốt, sử dụng cho vịt cho tỷ lệ bảo hộ đạt100% Đềnghị  Xác định hàm lượng kháng thể bị động vịt sinh từ vịt mẹ tiêm phòng vacxin nhược độc dịch tả vịtchủng C để định thời điểm tiêm mũi thích hợpnhất  Do thời gian nghiên cứu có hạn nên chưa kiểm tra chất lượng vacxin sau thời gian lưu kho sau tháng, 12 tháng 15 tháng, đề nghị đề tài tiến hành để đưa thời gian bảo quản vacxin thích hợp 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU Nguyễn Thị Kim Dung ( 2010),“ Kiểm nghiệm số tiêu vacxin nhược độc dịch tả vịt sản xuất xí nghiệp thuốc thú y trung ương ứng dụng phòng, can thiệp dịch” luận văn thạc sỹ nơng nghiệp Nguyễn Xn Bình cộng (2006), “43 bệnh gia cầm cách phòng trị”, NXB Nông nghiệp, Hà Nội Bộ Nông nghiệp CNTP (1994), Tiêu chuẩn ngành 10 TCN 183 – 93, Quy trình kiểm nghiệm vacxin nhược độc dịch tả vịt, NXB Nông Nghiệp Hà Nội Trần Minh Châu (1980), Chủng virus cường độc 769 sử dụng vacxin để phòng bệnh, Luận án PTS Khoa học Nông nghiệp, Trường Đại học Nông nghiệp I, HàNội Trần Minh Châu (1987), Bệnh dịch tả vịt, NXB Nông nghiệp, Hà Nội Danh mục vacxin, chế phẩm sinh học, vi sinh vật, hoá chất dùng Thú y lưu hành Việt Nam (Ban hành kèm theo thông tư số : 19/2009/TT-BNN PTNT ngày 30 tháng năm 2009 Nguyễn Đức Hiền (2005), “Bệnh tích đại thể, vi thể siêu vi thể bệnh dịch tả vịt thuỷ cầm gây bệnh thực nghiệm”, Tạp chí KHKT Nơng Lâm nghiệp, số 3/2005, Đại học Nơng Lâm Tp.Hồ Chí Minh Lê Hồng Mận (1999), Bệnh vịt biện pháp phòng trị, NXB Nông nghiệp, Hà Nội Trần Thị Thanh Xuân (2011), “ Nuôi cấy virus dịch tả vịt chủng C môi trường tế bào xơ phôi gà lớp bước đầu sản xuất vắc xin nhược độc dịch tả vịt đông khô”, luận văn thạc sỹ nông nghiệp Viện khoa học nơng nghiệp Việt Nam, “Tình hình chăn nuôi giới khu vực” http://www.fcri.com.vn/article_d/c153-166/tinh-hinh-chan-nuoi-thegioi-va- khu-vuc 62 Trang web http://sachviet.edu.vn/threads/10-tcn-183-1993-vacxin-thu-y-quy-trinh-kiemnghiem-vacxin-dich-ta-vit-nhuoc-doc.29535/ http://thuvienphapluat.vn/TCVN/Nong-nghiep/10-TCN-183-1993-vacxin-thuy-quy-trinh-kiem-nghiem-vacxin-dich-ta-vit-nhuoc-doc-903425.aspx http://www.channuoithuybg.com/vn/kinh-nghiem/p135/Benh-Dich-ta-vit http://sonnptnt.namdinh.gov.vn/Home/tyt/2015/615/Benh-dich-ta-vit-va-bienphap-phong-chong.aspx 63