Luận án tiến sĩ nghiên cứu phương pháp xác định đồng thời anthocyanin và anthocyanidin trong rau, củ, quả

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Vũ Thị Trang NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI ANTHOCYANIN VÀ ANTHOCYANIDIN TRONG RAU, CỦ, QUẢ LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC HÀ NỘI - 2019 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Vũ Thị Trang NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI ANTHOCYANIN VÀ ANTHOCYANIDIN TRONG RAU, CỦ, QUẢ Chun ngành: Hóa phân tích Mã số: 9440112.03 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS LÊ THỊ HỒNG HẢO PGS.TS NGUYỄN XUÂN TRUNG HÀ NỘI - 2019 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu luận án trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tác giả Vũ Thị Trang LỜI CẢM ƠN Với tình cảm chân thành, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Lê Thị Hồng Hảo PGS.TS Nguyễn Xuân Trung người thầy tận tâm hướng dẫn, động viên tạo điều kiện giúp đỡ tơi suốt q trình thực đề tài viết luận án Tôi xin chân thành cảm ơn tới q Thầy, Cơ Bộ mơn Hóa Phân tích, khoa Hóa Học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội tâm huyết truyền dạy cho kiến thức quý giá trình học tập thực đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Lãnh đạo Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia toàn thể cán Khoa Chất lượng, phụ gia chất hỗ trợ chế biến thực phẩm tạo điều kiện thuận lợi cho học tập thực nghiên cứu Lời sau cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới người thân gia đình, tới người bạn, đồng nghiệp, học viên, sinh viên ln động viên, chia sẻ khó khăn với Hà nội, ngày tháng năm 20 Tác giả Vũ Thị Trang MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chất chống oxy hóa 1.2 Tổng quan anthocyanin anthocyanidin 1.2.1 Cấu trúc hóa học 1.2.2 Tính chất sinh lý thực vật anthocyanin 10 1.2.3 Tính chất hóa học anthocyanin anthocyanidin 11 1.2.4 Tác dụng anthocyanin 13 1.2.5 Sự phân bố anthocyanin thực vật 15 1.3 Các phương pháp xác định anthocyanin anthocyanidin 18 1.3.1 Phương pháp phổ hấp thụ phân tử UV - Vis .19 1.3.2 Phương pháp điện di mao quản .20 1.3.3 Phương pháp sắc ký lỏng 21 1.4 Các phương pháp xử lý mẫu phân tích anthocyanin anthocyanidin 30 1.5 Phương pháp mặt mục tiêu tìm điều kiện tối ưu phân tích 33 1.5.1 Nguyên tắc 33 1.5.2 Phương pháp mặt mục tiêu tìm điều kiện tối ưu cho trình tách sắc ký lỏng 35 1.5.3 Phương pháp mặt mục tiêu tìm điều kiện tối ưu cho trình xử lý mẫu xác định anthocyanidin .37 1.6 Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa 38 1.6.1 Phương pháp ứng dụng phản ứng khử gốc tự DPPH 38 1.6.2 Phương pháp ứng dụng phản ứng ức chế gốc tự NO 39 1.6.3 Phương pháp ứng dụng phản ứng khử màu cation gốc tự ABTS 39 1.6.4 Phương pháp ứng dụng phản ứng khử phức sắt .40 1.6.5 Phương pháp ứng dụng khả tạo phức FTC .40 1.6.6 Phương pháp ứng dụng việc xác định tổng lực khử 40 1.7 Kết luận chung phần tổng quan 42 CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 45 2.1 Thiết bị, dụng cụ hóa chất, chất chuẩn 45 2.1.1 Thiết bị dụng cụ 45 2.1.2 Hóa chất, chất chuẩn .46 2.3 Đối tượng phương pháp nghiên cứu 48 2.3.1 Đối tượng nghiên cứu .48 2.3.2 Phương pháp nghiên cứu 49 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 66 3.1 Nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện phân tích hệ HPLC-DAD xác định đồng thời anthocyanin anthocyanidin kết hợp sử dụng UPLC-MS/MS để nhận biết 66 3.1.1 Khảo sát sơ số điều kiện phân tích HPLC-DAD để xác định đồng thời anthocyanin anthocyanidin 66 3.1.2 Tối ưu hóa điều kiện HPLC-DAD xác định đồng thời anthocyanin anthocyanidin theo phương pháp mặt mục tiêu (RSM) 70 3.1.3 Tối ưu hóa điều kiện UPLC-MS/MS để nhận biết đồng thời anthocyanin anthocyanidin .81 3.2 Tối ưu hóa điều kiện chiết anthocyanin anthocyanidin từ mẫu rau, củ, 87 3.2.1 Khảo sát điều kiện chiết anthocyanin .87 3.2.2 Khảo sát điều kiện tối ưu để thủy phân anthocyanin thành anthocyanidin .90 3.2.3 Tối ưu hóa quy trình chiết anthocyanidin phương pháp mặt mục tiêu (RSM) 93 3.3 Thẩm định phương pháp xác định anthocyanin anthocyanidin HPLC-DAD 103 3.3.1 Khoảng tuyến tính đường chuẩn 103 3.3.2 Giới hạn phát (MDL) giới hạn định lượng (MQL) phương pháp104 3.3.3 Đánh giá độ lặp lại 106 3.3.4 Đánh giá độ 107 3.4 Phân tích hàm lượng anthocyanin, anthocyanidin số mẫu rau, củ, bước đầu thử hoạt tính chống oxy hóa chúng 112 3.4.1 Phân tích hàm lượng anthocyanin, anthocyanidin số mẫu rau, củ, 112 3.4.2 Thử hoạt tính chống oxy hóa anthocyanin, anthocyanidin số mẫu rau, củ, .118 KẾT LUẬN 124 TÀI LIỆU THAM KHẢO 127 PHỤ LỤC 140 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Các anthocyanin xuất tự nhiên vị trí cấu trúc .8 Bảng 1.2: Thành phần hàm lượng anthocyanidin số thực vật .17 Bảng 1.3: Hàm lượng anthocyanin tổng số có số thực vật Việt Nam 18 Bảng 1.4: Điều kiện LC-DAD-MS/MS phân tích anthocyanin anthocyanidin 22 Bảng 1.5: Điều kiện HPLC-DAD phân tích anthocyanin anthocyanidin 26 Bảng 1.6: Một số điều kiện chiết anthocyanin 31 Bảng 1.7: Một số điều kiện chiết thủy phân anthocyanin thành anthocyanidin 33 Bảng 1.8: Hoạt tính chống oxy hóa anthocyanin .41 Bảng 2.1: Mức sở yếu tố ảnh hưởng trình tách sắc ký 51 Bảng 2.2: Mức sở yếu tố ảnh hưởng trình xử lý mẫu .56 Bảng 3.1: Chương trình gradient rửa giải anthocyanin anthocyanidin 69 Bảng 3.2: Mức sở khoảng biến thiên yếu tố theo mơ hình bậc hai tâm xoay tối ưu điều kiện tách HPLC 71 Bảng 3.3: Kết thực nghiệm theo mơ hình bậc hai tâm xoay 72 Bảng 3.4: Kết phân tích ANOVA hàm Y1 73 Bảng 3.5: Kết phân tích ANOVA hàm Y1 sau loại bỏ yếu tố khơng có nghĩa 74 Bảng 3.6: Phương trình hồi quy độ xác mơ hình 75 Bảng 3.7: Các thông số cài đặt để tìm điều kiện tối ưu 77 Bảng 3.8: So sánh kết thực nghiệm mơ hình 78 Bảng 3.9: Giá trị hàm CRF theo ma trận thực nghiệm .79 Bảng 3.10: Kết phân tích ANOVA hàm CRF .80 Bảng 3.11: Chương trình gradient tách đồng thời anthocyanin anthocyanidin 81 Bảng 3.12: Các thông số tối ưu hóa điều kiện phân mảnh .82 Bảng 3.13: Chương trình rửa giải gradient tách anthocyanin anthocyandin UPLC-MS/MS 84 Bảng 3.14: Chương trình gradient rửa giải anthocyanin anthocyanidin UPLC-MS/MS 87 Bảng 3.15: Ảnh hưởng dung môi chiết đến hàm lượng anthocyanin thu 87 Bảng 3.16: Mức sở khoảng biến thiên yếu tố theo mơ hình bậc hai tâm xoay tối ưu hóa q trình chiết anthocyanidin 95 Bảng 3.17: Tổng hàm lượng anthocyanidin theo mơ hình bậc hai tâm xoay 96 Bảng 3.18: Kết phân tích ANOVA hàm Y 97 Bảng 3.19: Kết phân tích ANOVA hàm Y sau loại bỏ yếu tố khơng có nghĩa 98 Bảng 3.20: Các thơng số cài đặt để tìm điều kiện tối ưu 100 Bảng 3.21: Hàm lượng anthocyanidin đỗ đen điều kiện tối ưu 102 Bảng 3.22: Phương trình hồi quy anthocyanin anthocyanidin 104 Bảng 3.23: MDL, MQL anthocyanin anthocyanidin 105 Bảng 3.24: Độ lặp lại anthocyanin .106 Bảng 3.25: Hiệu suất thủy phân anthocyanin 108 Bảng 3.26: Hiệu suất chiết anthocyanidin………………………………… 108 Bảng 3.27: Hàm lượng anthocyanidin số mẫu rau, củ, 113 Bảng 3.28: Hoạt tính chống oxy hóa số anthocyanin anthocyanidin 120 Bảng 3.29: Hàm lượng anthocyanidin hoạt tính chống oxy hóa số mẫu thực phẩm 122 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Sơ đồ cấu trúc phenol tự nhiên Hình 1.2: Cấu trúc chung anthocyanin diglucosid acyl hóa Hình 1.3: Cấu trúc hóa học anthocyanidin phổ biến 10 Hình 1.4: Sự thay đổi cấu trúc hóa học cyanidin theo pH 12 Hình 3.1: Phổ hấp thụ phân tử anthocyanidin anthocyanin 66 Hình 3.2: Sắc ký đồ rửa giải anthocyanin 15 phút FA 0,1% 68 Hình 3.3: Ảnh hưởng nồng độ FA đến tổng diện tích pic thời gian lưu Del-3G 69 Hình 3.4: Sắc ký đồ phân tích anthocyanin anthocyanidin FA 10% 70 Hình 3.5: Đồ thị mặt mục tiêu (độ phân giải) theo yếu tố ảnh hưởng 76 Hình 3.6: Sắc ký đồ 12 chất phân tích điều kiện tối ưu 78 Hình 3.7: Sắc ký đồ UPLC-MS/MS anthocyanin anthocyanidin 84 Hình 3.8: Ảnh hưởng tốc độ dịng tới diện tích pic anthocyanidin 85 Hình 3.9: Ảnh hưởng nồng độ acid formic tới diện tích pic anthocyanidin 86 Hình 3.10: Ảnh hưởng thời gian chiết đến hàm lượng anthocyanin thu 88 Hình 3.11: Ảnh hưởng khối lượng mẫu đến hàm lượng anthocyanin thu 89 Hình 3.12: Ảnh hưởng nhiệt độ chiết đến hàm lượng anthocyanin 89 Hình 3.13: Sắc ký đồ phân tích anthocyanin mẫu vỏ đỗ đen 90 Hình 3.14: Ảnh hưởng nồng độ HCl đến hàm lượng anthocyanidin thu 91 Hình 3.15: Ảnh hưởng nhiệt độ đến hàm lượng anthocyanidin thu 91 Hình 3.16: Ảnh hưởng thời gian thủy phân đến hàm lượng anthocyanidin 92 Hình 3.17: Sắc ký đồ anthocyanidin vỏ đỗ đen 93 Hình 3.18: Ảnh hưởng khối lượng cân đến hàm lượng anthocyanidin 94 Hình 3.19: Sắc ký đồ mẫu đỗ đen điều kiện (nhiệt độ 100oC, HCl 1M thời gian thủy phân 60 phút) 95 Hình 3.20: Đồ thị mặt mục tiêu hàm lượng anthocyanidin theo nhiệt độ nồng độ acid 99 Hình 3.21: Tương quan thực nghiệm mơ hình hàm lượng anthocyanidin100 %Ức chế DPPH Phụ lục F: Thử hoạt tính chống oxy hóa y = -1.76x + 99.28 R² = 0.99882 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 10 20 30 40 50 60 Nồng độ Cya-glu (µM) Hình F1: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ Cya-3G đến % Ức chế 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Hình F2: Đồ thị biểu diễn phụ thuộc độ hấp thụ quang vào thời gian 80 y = 7.4645x - 3.051 R² = 0.99873 %Ức chế DPPH 70 60 50 40 30 20 10 0 10 12 C (ppm) Hình F3: Đồ thị biểu diễn phụ thuộc % ức chế DPPH vào nồng độ Vitamin C PL 19 %ức chế 50 45 40 35 30 25 20 15 10 y = 53.901x + 3.1847 R² = 0.99399 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 C (ppm) Hình F4: Đồ thị biểu diễn phụ thuộc % ức chế DPPH vào nồng độ Cya-3G 30 y = 5.3274x + 3.5516 R² = 0.99956 %Ức chế 25 20 15 10 0 C (ppm) Hình F5: Đồ thị biểu diễn phụ thuộc % ức chế DPPH vào nồng độ Pelar-3G 60 y = 41.19x + 2.1825 R² = 0.99531 %Ức chế 50 40 30 20 10 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.2 1.4 C (ppm) Hình F6: Đồ thị biểu diễn phụ thuộc % ức chế DPPH vào nồng độ Cyanidin PL 20 70 y = 16.56x + 15.8 R² = 0.99265 %Ức chế 60 50 40 30 20 10 0 0.5 1.5 2.5 C (ppm) Hình F7: Đồ thị biểu diễn phụ thuộc % ức chế DPPH vào nồng độ Delphinidin PL 21 Phụ lục G: Bảng thông tin mẫu STT Tên mẫu Địa điểm lấy mẫu Ngày lấy mẫu Rau chua Học viện Nông nghiệp Việt nam – Trâu Quỳ Gia Lâm - Hà nội 14/10/2017 Bắp chuối Chợ Đồng Xa – Mai Dịch – Hà nội 16/10/2017 Bụp giấm Chợ Thương – Trần Phú – Tp Bắc Giang – tỉnh Bắc Giang 12/10/2017 Lược vàng Chợ Đà Lạt – Tp Đà Lạt 15/10/2017 Rau cải sâm Học viện Nông nghiệp Việt nam – Trâu Quỳ Gia Lâm - Hà nội 14/10/2017 Rau dền đỏ Chợ Đồng Xa – Mai Dịch – Hà nội 21/4/2017 Bắp cải tím Siêu thị Big C Thăng Long – Hà nội 15/10/2017 Lá tía tơ Chợ Đồng Xa – Mai Dịch – Hà nội 21/4/2017 Rau bớp Xã Vạn Yên (Cái Bầu) - Vân Đồn – Quảng Ninh 20/4/2017 10 Lạc đỏ Chợ Đồng Xa – Mai Dịch – Hà nội 16/10/2017 11 Hành tây tím Siêu thị Big C Thăng Long – Hà nội 25/4/2017 12 Tỏi tím Siêu thị Big C Thăng Long – Hà nội 24/5/2018 13 Su hào tím Siêu thị Big C Thăng Long – Hà nội 25/4/2017 14 Khoai lang tím Chợ Đồng Xa – Mai Dịch – Hà nội 24/5/2018 15 Củ dền Chợ Đà Lạt – Tp Đà Lạt 15/10/2017 16 Quả lựu Chợ Đồng Xa – Mai Dịch – Hà nội 16/10/2017 17 Dâu tây Chợ Đà Lạt – Tp Đà Lạt 15/10/2017 18 Cà chua đen Chợ Đà Lạt – Tp Đà Lạt 15/10/2017 19 Đậu bắp tím Siêu thị Big C Thăng Long – Hà nội 15/10/2017 20 Quả mồng tơi Học viện Nông nghiệp Việt nam – Trâu Quỳ Gia Lâm - Hà nội 14/10/2017 PL 22 21 Nho tím Siêu thị Vinmart+, Phú Diễn – Hà nội 24/5/2018 22 Nho đen Siêu thị Vinmart+, Phú Diễn – Hà nội 24/5/2018 23 Cà chua Chợ Đồng Xa – Mai Dịch – Hà nội 16/10/2017 24 Mận Siêu thị Big C Thăng Long – Hà nội 24/5/2018 25 Đỗ đen Chợ Đồng Xa – Mai Dịch – Hà nội 24/5/2018 26 Quả roi Siêu thị Vinmart+, Phú Diễn – Hà nội 24/5/2018 27 Cà tím Chợ Đồng Xa – Mai Dịch – Hà nội 24/5/2018 28 Đậu đỏ Chợ Đồng Xa – Mai Dịch – Hà nội 24/5/2018 29 Táo đỏ Siêu thị Vinmart+, Phú Diễn – Hà nội 24/5/2018 30 Măng cụt Chợ Đồng Xa – Mai Dịch – Hà nội 21/4/2017 31 Quả mai Xã Vạn Yên (Cái Bầu) - Vân Đồn – Quảng Ninh 20/4/2017 PL 23 Phụ lục H: Quy trình phân tích XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ANTHOCYANIN VÀ ANTHOCYANIDIN TRONG THỰC PHẨM BẰNG HPLC-DAD VÀ XÁC NHẬN BẰNG LC-MS/MS Nguyên tắc Anthocyanin chiết khỏi mẫu methanol 100oC 30 phút Anthocyanidin thu thủy phân dịch chiết anthocyanin môi trường HCl 2,4M/MeOH 90oC 60 phút chiết trực tiếp mẫu môi trường HCl 2,17M/MeOH 90oC 99 phút Anthocyanin và/hoặc anthocyanidin phân tích hệ thống HPLC-DAD xác nhận lại UPLC-MS/MS Phạm vi áp dụng Quy trình áp dụng cho loại mẫu: rau, củ, quả, bột nguyên liệu Thiết bị dụng cụ 3.1 Thiết bị 3.1.1 Hệ thống thiết bị sắc ký lỏng hiệu cao HPLC (Model: LC 20AD) hãng Shimadzu trang bị detector mảng diod (Model: SPD-M20A) 3.1.2 Hệ thống sắc ký lỏng siêu hiệu năng, detector khối phổ (UPLC-MS/MS) bao gồm: hệ thống sắc ký lỏng siêu hiệu UPLC (Model: I-Class) hệ thống khối phổ (Model: Xevo TQD) hãng Waters 3.1.3 Thiết bị quang phổ hấp thụ phân tử UV – Vis Shimadzu (Model: UV-2401 (PC) S (dải bước sóng: 200 – 800 nm) 3.1.4 Cột sắc ký Xbridge® BEH C18 (100 mm x 4,6 mm x 2,6 µm) tiền cột tương ứng 3.1.5 Cột sắc ký Sun Fire Waters C18 (250mm ì 4,6mm ì 5àm) v tin cột tương ứng 3.1.6 Cân phân tích Mettler Toledo (Model: AL204) có độ xác d = ± 0,0001 g 3.1.7 Máy đo pH Mettler Toledo (Model: SevenCompact), độ xác 0,01 PL 24 3.1.8 Máy lắc vortex IKA (Model: Vortex 3) 3.1.9 Máy xay Philips 3.1.10.Bể rung siêu âm ELMA (Model: S180H) 3.1.11.Bể cách thủy Memmert (Model: WNB22) 3.2 Dụng cụ 3.2.1 Bình thủy tinh chịu nhiệt, SCHOTT DURAN, dung tích 50 mL 3.2.2 Bình định mức loại A 5mL, 10 mL, 50 mL, 100 mL, 1000 mL 3.2.3 Cốc chia vạch 50 – 500 mL 3.2.4 Pipet tự động dung tích 200 µL, 1000 µL, 5000 µL đầu tip tương ứng 3.2.5 Ống ly tâm dung tích 50 mL, 15 mL 3.2.6 Màng lọc dung môi cỡ lỗ 0,45 µm 3.2.7 Màng lọc mẫu cỡ lỗ 0,2 µm 3.2.8 Ống đong chia vạch 100 mL – 1000 mL 3.2.9 Lọ đựng mẫu 2mL, bao gồm nắp vặn chặt, dùng cho tiêm mẫu tự động 3.2.10.Pipiet Pasteur 3.2.11.Giấy lọc băng xanh Hóa chất thuốc thử 4.1 Chất chuẩn anthocyanidin 4.1.1 Cyanidin chlorid (hãng: Sigma Aldrich; Code: 79457-1MG-F; Lot: BCBL9403V, BCBQ1825V; độ tinh khiết: 99,4%; lọ 1mg) 4.1.2 Delphinidin chlorid (hãng: Sigma Aldrich, Code: 43725-1MG-F, Lot: BCBM8761V, độ tinh khiết: 99,4%; lọ 1mg) 4.1.3 Pelargonidin chlorid (hãng: Sigma Aldrich; Code: P1659-5MG; Lot: SLBJ2650V, SLBQ7707V; độ tinh khiết: ≥ 98,7%; lọ 5mg) 4.1.4 Malvidin chlorid (hãng: Sigma Aldrich; Code: 68120-1MG-F; Lot: BCBP8824V, BCBM4521V; độ tinh khiết: 98,5%; lọ 1mg) 4.1.5 Petunidin chlorid (hãng: Chromadex; Code: ASB-00016414-001; Lot: 00016414-307; độ tinh khiết: 99,5%; lọ 1mg) PL 25 4.1.6 Peonidin chlorid (hãng: Phytolab; Code: 80085; Lot: 9184; độ tinh khiết: 99,0%; lọ 1mg) 4.2 Chất chuẩn anthocyanin 4.2.1 Pelargonidin - - O - glucosid (Callistephin chlorid; hãng: Sigma Aldrich; Code: 53489-1MG; Lot: BCBT0291; độ tinh khiết: 98,5%; lọ 1mg) 4.2.2 Cyanidin - - O – glucosid (Kuromanin chlorid; hãng: Sigma Aldrich; Code: 52976-1MG-F; Lot: BCBR1934V; độ tinh khiết: 99,6%; lọ 1mg) 4.2.3 Peonidin - - O - glucosid (hãng: Sigma Aldrich; Code: 42008-1MG-F; Lot: BCBQ2212V; độ tinh khiết: 99,0%; lọ 1mg) 4.2.4 Malvidin - - O - glucosid (Oenin chlorid; hãng: Sigma Aldrich; Code: 72813-1MG-F; Lot: BCBR8610V; độ tinh khiết: 97,2%; lọ 1mg) 4.2.5 Petunidin - - O - glucosid (hãng: Phytolab; Code: 89755; Lot: 11983; độ tinh khiết: 99,6%; lọ 1mg) 4.2.6 Delphinidin - - O - glucosid (hãng: Phytolab; Code: 89627; Lot: 12394; độ tinh khiết: 99,2%; lọ 1mg) 4.3 Cách pha dung dịch chuẩn anthocyanidin 4.3.1 Dung dịch chất chuẩn gốc 100 µg/mL: sử dụng pipet Pasteur (3.2.10) thêm lượng nhỏ dung dịch MeOH chứa 0,1% HCl vào lọ chứa 1mg chất chuẩn (Cya, Del, Pelar, Petu, Mal, Peo), hòa tan chuyển dần vào bình định mức 10 mL, định mức tới vạch MeOH chứa 0,1% HCl, lắc kỹ Bảo quản -20oC, tránh ánh sáng 4.3.2 Dung dịch chuẩn trung gian 10 µg/mL: sử dụng pipet tự động (3.2.4) hút mL dung dịch chuẩn gốc (4.3.1) vào bình định mức 10 mL định mức tới vạch MeOH chứa 0,1% HCl, lắc kỹ Bảo quản -20oC, tránh ánh sáng 4.4 Cách pha dung dịch chuẩn anthocyanin 4.4.1 Dung dịch chất chuẩn gốc 100 µg/mL: sử dụng pipet Pasteur (3.2.10) thêm lượng nhỏ dung dịch MeOH vào lọ chứa 1mg chất chuẩn (Cya-3G, Del-3G, Pelar-3G, Petu-3G, Mal-3G, Peo-3G), hòa tan PL 26 chuyển dần vào bình định mức 10 mL, định mức tới vạch MeOH, lắc kỹ Bảo quản -20oC, tránh ánh sáng 4.4.2 Dung dịch chuẩn trung gian 10 µg/mL: sử dụng pipet tự động (3.2.4) hút mL dung dịch chuẩn gốc (4.4.1) vào bình định mức 10 mL, định mức tới vạch MeOH, lắc kỹ Bảo quản -20oC, tránh ánh sáng 4.5 Đường chuẩn anthocyanin anthocyanidin Từ dung dịch chuẩn gốc dung dịch chuẩn trung gian 4.3, 4.4, tiến hành pha dung dịch đường chuẩn có nồng độ 0,2; 0,5; 1; 2; 5; 10 µg/mL vial mL 4.6 Hóa chất dung mơi khác 4.6.1 Acid hydrochloric (HCl) Merck, Đức 4.6.2 Acid formic (FA) Merck, Đức 4.6.3 Methanol (MeOH) Merck, Đức 4.6.4 Acetonitril (ACN) Merck, Đức Các bước tiến hành 5.1 Chuẩn bị mẫu 5.1.1 Đồng kỹ mẫu máy đồng mẫu (3.1.9) 5.1.2 Chiết anthocyanin: Cân xác khoảng 0,5g-1g mẫu sau đồng cân phân tích (3.1.6) vào bình thủy tinh chịu nhiệt có nắp đậy kín (3.2.1) Thêm 30 mL MeOH (4.6.3) Lắc vortex (3.1.8) để trộn mẫu Thủy phân bể cách thủy (3.1.11) 100oC 30 phút Làm nguội đến nhiệt độ phòng, lọc gạn vào bình định mức 50 mL, thêm MeOH (4.6.3) vào phần cặn, lắc gộp dịch vào bình định mức 50 mL Định mức đến vạch MeOH Lọc qua giấy lọc (3.2.11) vào ống ly tâm 15 mL (3.2.5), bỏ vài mL dịch lọc đầu, thu lấy phần dịch lọc Tiếp tục lọc qua màng lọc 0,2 µm vào lọ đựng mẫu tiêm mẫu tự động (3.2.9) đặt vào hệ thống sắc ký PL 27 5.1.3 Thủy phân anthocyanin thành anthocyanidin: Lấy xác 1mL dung dịch chiết anthocyanin (5.1.2) vào lọ mL có nắp đậy kín (3.2.9) Thêm xác 250 µL HCl đặc (4.6.1), thủy phân bể cách thủy (3.1.11) 90oC 60 phút Để nguội đặt vào hệ thống sắc ký 5.1.4 Chiết anthocyanidin: Cân xác khoảng 0,5g-1g mẫu sau đồng cân phân tích (3.1.6) vào bình thủy tinh chịu nhiệt có nắp đậy kín (3.2.1), thêm 35 mL MeOH chứa HCl 2,17 M Đậy kín nắp thủy phân bể cách thủy (3.1.11) 90oC 99 phút Làm nguội đến nhiệt độ phịng, lọc gạn vào bình định mức 50 mL, thêm HCl 2,17M/MeOH vào phần cặn, lắc gộp dịch vào bình định mức 50 mL Định mức đến vạch HCl 2,17M/MeOH Lọc qua giấy lọc (3.2.11) vào ống ly tâm 15 mL (3.2.5), bỏ vài mL dịch lọc đầu, thu lấy phần dịch lọc Tiếp tục lọc qua màng lọc 0,2 µm vào lọ đựng mẫu tiêm mẫu tự động (3.2.9) đặt vào hệ thống sắc ký 5.2 Điều kiện phân tích HPLC - Detector DAD quét phổ khoảng 190 – 800 nm, định lượng 520 nm - Cột sắc ký: cột Sun Fire hãng Waters C18 (250 mm ì 4,6 mm ì àm) v tiền cột tương ứng - Pha động: A (acid formic 10%), B (ACN) theo chương trình gradient sau: Thời gian (phút) 0,01 10,00 10,01 20,00 20,01 25,00 %ACN 10 12 19 19 10 10 %FA 90 88 - Tốc độ dòng: 0,8 mL/phút 81 81 90 90 - Nhiệt độ cột: nhiệt độ phịng - Thể tích tiêm mẫu: 20 àL 5.3 iu kin xỏc nhn trờn LC-MS/MS ã Điều kiện LC - Cột C18 (100mm x 4,6mm x 2,5µm) PL 28 - Pha động kênh A (acid formic 0,05%); kênh B (acetonitril) theo chương trình gradient sau: Thời gian (phút) 10 10,10 13 % ACN 20 30 20 20 %FA 80 70 80 80 - Tốc độ dịng: 0,4 mL/phút - Thể tích tiêm mẫu: µL - Nhiệt độ cột: 30oC • Điều kiện MS - Thế mao quản (Capillary Voltages): 0,83 kV - Thế đầu phun (Cone Voltages): 65V - Nhiệt độ loại dung mơi (Delsolvation temp): 500oC - Tốc độ khí loại dung môi (Desolvation- gas flow): 1000L/hr Ion (m/z) Năng lượng Năng lượng phân ion hóa (eV) mảnh (eV) STT Ion mẹ (m/z) Del-3G 465 303 44 30 127 44 72 Pelar-3G 433 271 40 20 121 40 64 Cya-3G 449 287 34 18 137 34 62 Petu-3G 479 317 44 30 302 44 30 Peo- 3G 463 301 34 20 286 34 42 Mal – 3G 493 331 36 22 315 36 52 Del 303 127 60 50 76 60 64 Cya 137 72 34 PL 29 STT Ion (m/z) Ion mẹ (m/z) Năng lượng Năng lượng phân ion hóa (eV) mảnh (eV) 287 109 72 42 Mal 315 56 30 331 287 56 28 10 Pelar 271 121 60 38 93 60 42 11 Peo 301 286 58 24 258 58 30 Petu 302 58 26 317 203 58 38 12 Tính tốn kết 6.1 Hàm lượng loại anthocyanin mẫu theo quy trình (5.1.2) tính sau: != #×%×&×0,1 * Trong đó: W: hàm lượng anthocyanin mẫu (mg/100g); C: nồng độ anthocyanin tính theo đường chuẩn (µg/mL) V: thể tích định mức (mL) m: khối lượng mẫu cân (g) K: hệ số pha loãng 6.2 Hàm lượng loại anthocyanidin mẫu theo quy trình (5.1.3) tính sau: != #×%×&×0,1×1,25 * Trong đó: W: hàm lượng anthocyanidin mẫu (mg/100g); C: nồng độ anthocyanidin tính theo đường chuẩn (µg/mL) PL 30 V: thể tích định mức (mL) m: khối lượng mẫu cân (g) K: hệ số pha loãng 1,25: hệ số pha loãng (từ mL dịch mẫu thêm 0,25 mL HCl đặc thành 1,15 mL) 6.3 Hàm lượng loại anthocyanidin mẫu theo quy trình (5.1.4) tính sau: != #×%×&×0,1 * Trong đó: W: hàm lượng anthocyanidin mẫu (mg/100g); C: nồng độ anthocyanidin tính theo đường chuẩn (µg/mL) V: thể tích định mức (mL) m: khối lượng mẫu cân (g) K: hệ số pha loãng 6.4 Quy đổi hàm lượng anthocyanidin sang hàm lượng anthocyanin (anthocyanidin-3-glucosid) theo cơng thức sau: !-./ = !-./0 × 1-./ 1-./0 WACN: hàm lượng anthocyanin (mg/100g) WACND: hàm lượng anthocyanidin (mg/100g) MACN: khối lượng phân tử anthocyanidin-3-glucosid (g/mol) MACND: khối lượng phân tử anthocyanidin (g/mol) 6.5 Trong trường hợp khơng sẵn có chuẩn anthocyanin/anthocyanidin, tính tổng hàm lượng anthocyanin/anthocyanidin thông qua chất chuẩn đánh dấu: cyanidin cyanidin-3-glucoside Trong trường hợp này, tính tổng diện tích pic anthocyanidin dựa vào đường chuẩn cyanidin để tính tổng hàm lượng anthocyanidin quy theo cyanidin; tính tổng diện tích pic anthocyanin dựa vào đường chuẩn cyanidin-3-glucoside để tính tổng hàm lượng anthocyanin quy theo cyanidin-3-glucoside PL 31 Kiểm soát chất lượng 7.1 Đánh giá tính phù hợp hệ thống a) Kiểm tra nhiễm chéo, độ phân giải, hệ số cân xứng pic Tiêm dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ µg/mL tiêm mẫu trắng Kiểm tra cẩn thận pic nhiễm chéo mẫu trắng Tính tốn độ phân giải (Rs), hệ số cân xứng pic (Tailing) tự động theo phần mềm xử lý số liệu thiết bị Các pic phải đảm bảo độ phân giải Rs ³ hệ số kéo phía (Tailing) khoảng 1± 0,5 b) Độ tuyến tính đường chuẩn Phân tích điểm chuẩn làm việc dựng đường chuẩn Hệ số tương quan tuyến tính (R2) chất chuẩn phải ³ 0,99 Nếu không đạt độ tuyến tính chuẩn bị lại dung dịch chuẩn làm việc c) Độ lặp lại hệ thống Phân tích lặp lại lần dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ µg/mL Tính lại nồng độ lần phân tích tính giá trị trung bình, độ lệch chuẩn (SD), độ lệch chuẩn tương đối (RSD) Giá trị RSD thời gian lưu diện tích pic pic phải nhỏ 2% 7.2 Đánh giá độ chụm Thực phân tích lần song song mẫu Độ lệch hai lần phân tích so với giá trị trung bình khơng q 10% Nếu khơng đạt u cầu này, phải tiến hành phân tích lại 7.3 Xác nhận LC-MS/MS Các chất phân tích xác nhận có mặt mẫu khi: - Thời gian lưu phù hợp với thời gian lưu chuẩn tương ứng (sai lệch thời gian lưu khơng q 2%) PL 32 - Có mảnh ion tương ứng tỉ lệ mảnh ion định tính/ion định lượng mẫu chuẩn theo bảng sau: Cường độ tương ứng Sai lệch cho phép (so với ion chính) > 50% ± 20% >20 - 50% ± 25% > 10 - 20% ± 30% £ 10% ± 50% PL 33 ... - Vũ Thị Trang NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI ANTHOCYANIN VÀ ANTHOCYANIDIN TRONG RAU, CỦ, QUẢ Chun ngành: Hóa phân tích Mã số: 9440112.03 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Người hướng... ? ?Nghiên cứu phương pháp xác định đồng thời anthocyanin anthocyanidin rau, củ, quả? ?? với ba mục tiêu: Nghiên cứu phát triển phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao với detector DAD (HPLC-DAD) để xác định. .. Đối tượng phương pháp nghiên cứu 48 2.3.1 Đối tượng nghiên cứu .48 2.3.2 Phương pháp nghiên cứu 49 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 66 3.1 Nghiên cứu tối ưu