(LUẬN án TIẾN sĩ) nghiên cứu phương pháp xác định đồng thời anthocyanin và anthocyanidin trong rau, củ, quả

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Vũ Thị Trang NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI ANTHOCYANIN VÀ ANTHOCYANIDIN TRONG RAU, CỦ, QUẢ LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC HÀ NỘI - 2019 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Vũ Thị Trang NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI ANTHOCYANIN VÀ ANTHOCYANIDIN TRONG RAU, CỦ, QUẢ Chun ngành: Hóa phân tích Mã số: 9440112.03 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS LÊ THỊ HỒNG HẢO PGS.TS NGUYỄN XUÂN TRUNG HÀ NỘI - 2019 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nêu luận án trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tác giả Vũ Thị Trang TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com LỜI CẢM ƠN Với tình cảm chân thành, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Lê Thị Hồng Hảo PGS.TS Nguyễn Xuân Trung người thầy tận tâm hướng dẫn, động viên tạo điều kiện giúp đỡ suốt trình thực đề tài viết luận án Tôi xin chân thành cảm ơn tới quý Thầy, Cơ Bộ mơn Hóa Phân tích, khoa Hóa Học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội tâm huyết truyền dạy cho kiến thức quý giá trình học tập thực đề tài Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Lãnh đạo Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia toàn thể cán Khoa Chất lượng, phụ gia chất hỗ trợ chế biến thực phẩm tạo điều kiện thuận lợi cho học tập thực nghiên cứu Lời sau cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới người thân gia đình, tới người bạn, đồng nghiệp, học viên, sinh viên ln động viên, chia sẻ khó khăn với tơi Hà nội, ngày tháng năm 20 Tác giả Vũ Thị Trang TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chất chống oxy hóa 1.2 Tổng quan anthocyanin anthocyanidin 1.2.1 Cấu trúc hóa học 1.2.2 Tính chất sinh lý thực vật anthocyanin 10 1.2.3 Tính chất hóa học anthocyanin anthocyanidin 11 1.2.4 Tác dụng anthocyanin 13 1.2.5 Sự phân bố anthocyanin thực vật 15 1.3 Các phương pháp xác định anthocyanin anthocyanidin 18 1.3.1 Phương pháp phổ hấp thụ phân tử UV - Vis .19 1.3.2 Phương pháp điện di mao quản .20 1.3.3 Phương pháp sắc ký lỏng 21 1.4 Các phương pháp xử lý mẫu phân tích anthocyanin anthocyanidin 30 1.5 Phương pháp mặt mục tiêu tìm điều kiện tối ưu phân tích 33 1.5.1 Nguyên tắc 33 1.5.2 Phương pháp mặt mục tiêu tìm điều kiện tối ưu cho trình tách sắc ký lỏng 35 1.5.3 Phương pháp mặt mục tiêu tìm điều kiện tối ưu cho trình xử lý mẫu xác định anthocyanidin .37 1.6 Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa 38 1.6.1 Phương pháp ứng dụng phản ứng khử gốc tự DPPH 38 1.6.2 Phương pháp ứng dụng phản ứng ức chế gốc tự NO 39 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com 1.6.3 Phương pháp ứng dụng phản ứng khử màu cation gốc tự ABTS 39 1.6.4 Phương pháp ứng dụng phản ứng khử phức sắt .40 1.6.5 Phương pháp ứng dụng khả tạo phức FTC .40 1.6.6 Phương pháp ứng dụng việc xác định tổng lực khử 40 1.7 Kết luận chung phần tổng quan 42 CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 45 2.1 Thiết bị, dụng cụ hóa chất, chất chuẩn 45 2.1.1 Thiết bị dụng cụ 45 2.1.2 Hóa chất, chất chuẩn .46 2.3 Đối tượng phương pháp nghiên cứu 48 2.3.1 Đối tượng nghiên cứu .48 2.3.2 Phương pháp nghiên cứu 49 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 66 3.1 Nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện phân tích hệ HPLC-DAD xác định đồng thời anthocyanin anthocyanidin kết hợp sử dụng UPLC-MS/MS để nhận biết 66 3.1.1 Khảo sát sơ số điều kiện phân tích HPLC-DAD để xác định đồng thời anthocyanin anthocyanidin 66 3.1.2 Tối ưu hóa điều kiện HPLC-DAD xác định đồng thời anthocyanin anthocyanidin theo phương pháp mặt mục tiêu (RSM) 70 3.1.3 Tối ưu hóa điều kiện UPLC-MS/MS để nhận biết đồng thời anthocyanin anthocyanidin .81 3.2 Tối ưu hóa điều kiện chiết anthocyanin anthocyanidin từ mẫu rau, củ, 87 3.2.1 Khảo sát điều kiện chiết anthocyanin .87 3.2.2 Khảo sát điều kiện tối ưu để thủy phân anthocyanin thành anthocyanidin .90 3.2.3 Tối ưu hóa quy trình chiết anthocyanidin phương pháp mặt mục tiêu (RSM) 93 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com 3.3 Thẩm định phương pháp xác định anthocyanin anthocyanidin HPLC-DAD 103 3.3.1 Khoảng tuyến tính đường chuẩn 103 3.3.2 Giới hạn phát (MDL) giới hạn định lượng (MQL) phương pháp104 3.3.3 Đánh giá độ lặp lại 106 3.3.4 Đánh giá độ 107 3.4 Phân tích hàm lượng anthocyanin, anthocyanidin số mẫu rau, củ, bước đầu thử hoạt tính chống oxy hóa chúng 112 3.4.1 Phân tích hàm lượng anthocyanin, anthocyanidin số mẫu rau, củ, 112 3.4.2 Thử hoạt tính chống oxy hóa anthocyanin, anthocyanidin số mẫu rau, củ, .118 KẾT LUẬN 124 TÀI LIỆU THAM KHẢO 127 PHỤ LỤC 140 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Các anthocyanin xuất tự nhiên vị trí cấu trúc .8 Bảng 1.2: Thành phần hàm lượng anthocyanidin số thực vật .17 Bảng 1.3: Hàm lượng anthocyanin tổng số có số thực vật Việt Nam 18 Bảng 1.4: Điều kiện LC-DAD-MS/MS phân tích anthocyanin anthocyanidin 22 Bảng 1.5: Điều kiện HPLC-DAD phân tích anthocyanin anthocyanidin 26 Bảng 1.6: Một số điều kiện chiết anthocyanin 31 Bảng 1.7: Một số điều kiện chiết thủy phân anthocyanin thành anthocyanidin 33 Bảng 1.8: Hoạt tính chống oxy hóa anthocyanin .41 Bảng 2.1: Mức sở yếu tố ảnh hưởng trình tách sắc ký 51 Bảng 2.2: Mức sở yếu tố ảnh hưởng trình xử lý mẫu .56 Bảng 3.1: Chương trình gradient rửa giải anthocyanin anthocyanidin 69 Bảng 3.2: Mức sở khoảng biến thiên yếu tố theo mơ hình bậc hai tâm xoay tối ưu điều kiện tách HPLC 71 Bảng 3.3: Kết thực nghiệm theo mơ hình bậc hai tâm xoay 72 Bảng 3.4: Kết phân tích ANOVA hàm Y1 73 Bảng 3.5: Kết phân tích ANOVA hàm Y1 sau loại bỏ yếu tố khơng có nghĩa 74 Bảng 3.6: Phương trình hồi quy độ xác mơ hình 75 Bảng 3.7: Các thông số cài đặt để tìm điều kiện tối ưu 77 Bảng 3.8: So sánh kết thực nghiệm mơ hình 78 Bảng 3.9: Giá trị hàm CRF theo ma trận thực nghiệm .79 Bảng 3.10: Kết phân tích ANOVA hàm CRF .80 Bảng 3.11: Chương trình gradient tách đồng thời anthocyanin anthocyanidin 81 Bảng 3.12: Các thông số tối ưu hóa điều kiện phân mảnh .82 Bảng 3.13: Chương trình rửa giải gradient tách anthocyanin anthocyandin UPLC-MS/MS 84 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Bảng 3.14: Chương trình gradient rửa giải anthocyanin anthocyanidin UPLC-MS/MS 87 Bảng 3.15: Ảnh hưởng dung môi chiết đến hàm lượng anthocyanin thu 87 Bảng 3.16: Mức sở khoảng biến thiên yếu tố theo mơ hình bậc hai tâm xoay tối ưu hóa trình chiết anthocyanidin 95 Bảng 3.17: Tổng hàm lượng anthocyanidin theo mô hình bậc hai tâm xoay 96 Bảng 3.18: Kết phân tích ANOVA hàm Y 97 Bảng 3.19: Kết phân tích ANOVA hàm Y sau loại bỏ yếu tố khơng có nghĩa 98 Bảng 3.20: Các thơng số cài đặt để tìm điều kiện tối ưu 100 Bảng 3.21: Hàm lượng anthocyanidin đỗ đen điều kiện tối ưu 102 Bảng 3.22: Phương trình hồi quy anthocyanin anthocyanidin 104 Bảng 3.23: MDL, MQL anthocyanin anthocyanidin 105 Bảng 3.24: Độ lặp lại anthocyanin .106 Bảng 3.25: Hiệu suất thủy phân anthocyanin 108 Bảng 3.26: Hiệu suất chiết anthocyanidin………………………………… 108 Bảng 3.27: Hàm lượng anthocyanidin số mẫu rau, củ, 113 Bảng 3.28: Hoạt tính chống oxy hóa số anthocyanin anthocyanidin 120 Bảng 3.29: Hàm lượng anthocyanidin hoạt tính chống oxy hóa số mẫu thực phẩm 122 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Sơ đồ cấu trúc phenol tự nhiên Hình 1.2: Cấu trúc chung anthocyanin diglucosid acyl hóa Hình 1.3: Cấu trúc hóa học anthocyanidin phổ biến 10 Hình 1.4: Sự thay đổi cấu trúc hóa học cyanidin theo pH 12 Hình 3.1: Phổ hấp thụ phân tử anthocyanidin anthocyanin 66 Hình 3.2: Sắc ký đồ rửa giải anthocyanin 15 phút FA 0,1% 68 Hình 3.3: Ảnh hưởng nồng độ FA đến tổng diện tích pic thời gian lưu Del-3G 69 Hình 3.4: Sắc ký đồ phân tích anthocyanin anthocyanidin FA 10% 70 Hình 3.5: Đồ thị mặt mục tiêu (độ phân giải) theo yếu tố ảnh hưởng 76 Hình 3.6: Sắc ký đồ 12 chất phân tích điều kiện tối ưu 78 Hình 3.7: Sắc ký đồ UPLC-MS/MS anthocyanin anthocyanidin 84 Hình 3.8: Ảnh hưởng tốc độ dịng tới diện tích pic anthocyanidin 85 Hình 3.9: Ảnh hưởng nồng độ acid formic tới diện tích pic anthocyanidin 86 Hình 3.10: Ảnh hưởng thời gian chiết đến hàm lượng anthocyanin thu 88 Hình 3.11: Ảnh hưởng khối lượng mẫu đến hàm lượng anthocyanin thu 89 Hình 3.12: Ảnh hưởng nhiệt độ chiết đến hàm lượng anthocyanin 89 Hình 3.13: Sắc ký đồ phân tích anthocyanin mẫu vỏ đỗ đen 90 Hình 3.14: Ảnh hưởng nồng độ HCl đến hàm lượng anthocyanidin thu 91 Hình 3.15: Ảnh hưởng nhiệt độ đến hàm lượng anthocyanidin thu 91 Hình 3.16: Ảnh hưởng thời gian thủy phân đến hàm lượng anthocyanidin 92 Hình 3.17: Sắc ký đồ anthocyanidin vỏ đỗ đen 93 Hình 3.18: Ảnh hưởng khối lượng cân đến hàm lượng anthocyanidin 94 Hình 3.19: Sắc ký đồ mẫu đỗ đen điều kiện (nhiệt độ 100oC, HCl 1M thời gian thủy phân 60 phút) 95 Hình 3.20: Đồ thị mặt mục tiêu hàm lượng anthocyanidin theo nhiệt độ nồng độ acid 99 Hình 3.21: Tương quan thực nghiệm mơ hình hàm lượng anthocyanidin100 TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com ... - Vũ Thị Trang NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI ANTHOCYANIN VÀ ANTHOCYANIDIN TRONG RAU, CỦ, QUẢ Chun ngành: Hóa phân tích Mã số: 9440112.03 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Người hướng... đề tài: ? ?Nghiên cứu phương pháp xác định đồng thời anthocyanin anthocyanidin rau, củ, quả? ?? với ba mục tiêu: TIEU LUAN MOI download : skknchat@gmail.com Nghiên cứu phát triển phương pháp sắc ký... (HPLC-DAD) để xác định đồng thời anthocyanin anthocyanidin Nghiên cứu xây dựng quy trình xử lý mẫu để tách, chiết anthocyanin anthocyanidin rau, củ, Áp dụng phương pháp để nhận biết, định lượng