Nếu pha động không chứa acid formic thì khơng thể rửa giải được các
anthocyanidin. Khi tăng nồng độ acid formic từ 0,05% – 0,2%, diện tích pic của các
anthocyanidin giảm, nhưng mức độ giảm của các anthocyanidin là khác nhau tùy
thuộc vào pH của dung dịch.
Khi nồng độ acid formic cao, số lượng ion đi vào buồng ion của detector MS
tăng, gây cạnh tranh với các ion của chất phân tích, làm giảm tín hiệu. Tất cả các anthocyanidin đều cho tín hiệu cao nhất tại nồng độ acid formic 0,05%. Do đó, chọn nồng độ acid formic 0,05%, nồng độ này cũng phù hợp với các hệ UPLC-MS/MS.
- Cột C18 (100mm x 4,6mm x 2,5µm)
- Pha động kênh A (acid formic 0,05%); kênh B (acetonitril) theo chương
trình gradient trong bảng 3.14.
Bảng 3.14: Chương trình gradient rửa giải các anthocyanin và anthocyanidin bằng UPLC-MS/MS Thời gian (phút) 0 10 10,10 13 % ACN 20 30 20 20 %FA 80 70 80 80 - Tốc độ dòng: 0,4 mL/phút. - Thể tích bơm mẫu: 5 µL. - Nhiệt độ cột: 30oC.
3.2. Tối ưu hóa điều kiện chiết các anthocyanin và anthocyanidin từ nền mẫu
rau, củ, quả
3.2.1 Khảo sát điều kiện chiết các anthocyanin
3.2.1.1 Khảo sát dung mơi chiết
Dung mơi có ảnh hưởng rất lớn tới hàm lượng anthocyanin chiết được. Vì
cấu trúc anthocyanin bao gồm gốc đường nên chúng phân cực và tan tốt trong dung môi phân cực, tiến hành lựa chọn methanol và nước để khảo sát điều kiện chiết. Lựa chọn mẫu vỏ đỗ đen là nền mẫu có nhiều thành phần anthocyanin nhất để khảo sát, kết quả được trình bày trong bảng 3.15.
Bảng 3.15: Ảnh hưởng của dung môi chiết đến hàm lượng anthocyanin thu được
Dung môi
Hàm lượng anthocyanin (mg/100g) Tổng
(mg/100g)
Del-3G Cya-3G Petu-3G Peo-3G Mal-3G
Nước 4,16 33,99 3,17 5,98 13,20 60,50
Methanol 4,10 33,48 3,20 5,90 12,02 58,70
hàm lượng anthocyanin khác nhau không đáng kể. Tuy nhiên, dung môi thủy phân
anthocyanin thành anthocyanidin là MeOH được acid hóa nên lựa chọn MeOH là
dung môi chiết anthocyanin.
3.2.1.2 Khảo sát thời gian chiết
Dưới điều kiện nhiệt độ cao, methanol dễ bị bay hơi và ảnh hưởng đến hiệu suất chiết. Tiến hành khảo sát thời gian từ 15 phút đến 60 phút như ở mục 2.3.2.2. Kết quả thu được biểu diễn ở hình 3.10.