Anthocyanin có nhiều có nhiều ứng dụng và có hoạt tính sinh học quí nên được các nhà nghiên cứu trên thế giới cũng như ở Việt nam rất quan tâm và đã phát triển nhiều phương pháp để nhận biết và định lượng chúng trong các đối tượng thực
phẩm khác nhau. Trong số các phương pháp đã được công bố, quang phổ hấp thụ
phân tử UV-Vis tuy nhanh, đơn giản nhưng chỉ xác định được hàm lượng tổng
anthocyanin; phương pháp điện di mao quản với detector UV-Vis bị hạn chế bởi số
lượng chất phân tích và độ nhạy, phương pháp sắc ký lỏng được sử dụng phổ biến
nhất với việc sử dụng chủ yếu 2 detector DAD và MS. Sắc ký lỏng với detector khối phổ thường được sử dụng để nhận biết các anthocyanin trong các nền mẫu mới
trong khi sắc ký lỏng với detector DAD được sử dụng chủ yếu trong tách và định
lượng các anthocyanin và/hoặc anthocyanidin.
Sự tồn tại của số lượng lớn các anthocyanin trong tự nhiên với các cấu trúc vô cùng phong phú và phức tạp khiến việc tách và định lượng chúng rất khó khăn do thiếu chất chuẩn và trùng thời gian lưu. Để đơn giản q trình phân tích, cần tiến hành thủy phân để cắt toàn bộ gốc đường chuyển thành 6 anthocyanidin cơ bản bao gồm (delphinidin, cyanidin, petunidin, pelargonidin, peonidin và malvidin). Do vậy, quá trình thủy phân mẫu phải đạt hiệu suất chuyển hóa tối đa, chất phân tích khơng bị phân hủy hoặc chuyển hóa khơng hồn tồn. Q trình thủy phân các
anthocyanin bị ảnh hưởng chính bởi 3 yếu tố: nhiệt độ, nồng độ acid và thời gian.
Điều kiện chiết và thủy phân ảnh hưởng rất lớn đến dạng tồn tại của anthocyanin và
anthocyanidin. Quá trình chiết được thực hiện trong môi trường acid, nếu môi
trường acid quá mạnh sẽ thủy phân anthocyanin thành anthocyanidin, quá trình thủy phân khơng hồn tồn có thể sẽ không thủy phân hết anthocyanin thành
anthocyanidin. Do đó, trong nền mẫu sau khi thủy phân, có thể tồn tại cả dạng
anthocyanin và anthocyanidin [87]. Các công bố về điều kiện thủy phân này rất
khác nhau, việc sử dụng phương pháp khảo sát đơn biến và đánh giá hàm lượng
anthocyanin và/hoặc anthocyanidin thu được là lớn nhất, có thể chưa phản ánh đúng hàm lượng chất phân tích trong mẫu. Sự thiếu mẫu chuẩn (CRM) cho nhóm chất
nghiên cứu gây khó khăn cho việc đánh giá độ chính xác của các kết quả định lượng. Việc đánh giá hiệu suất thu hồi bằng cách thêm chuẩn anthocyanidin chỉ phản ánh được sự mất hoặc phân hủy của anthocyanidin trong suốt quá trình xử lý mẫu, chưa
phản ánh được hiệu suất chuyển hóa anthocyanin thành anthocyanidin. Để giải
quyết các vấn đề này, cần thiết phải tìm điều kiện tối ưu để chiết và thủy phân
anthocyanin thành anthocyanidin với việc khảo sát ảnh hưởng đồng thời của các
yếu tố và sự tác động tương hỗ giữa chúng, đồng thời để đánh giá hiệu suất chuyển hóa anthocyanin thành anthocyandin sử dụng các chất chuẩn anthocyanin bổ sung
vào nền mẫu để các chất chuẩn này được thủy phân như dạng tồn tại của chất phân
tích trong mẫu.
Về phương pháp định lượng, nếu chỉ lựa chọn phân tích anthocyanin hoặc
anthocyanidin có thể cho kết quả khơng chính xác do không quan sát được hết dạng
tồn tại của chất phân tích trong dịch thủy phân. Do đó, việc xác định được đồng
thời cả anthocyanin và anthocyandin cho phép:
- Kiểm sốt được q trình thủy phân giúp xác định được chính xác hàm lượng các chất có trong mẫu
- Cho biết dạng tồn tại của các chất có trong mẫu
Sự tách các anthocyanin và anthocyanidin thường được thực hiện bởi sắc ký
lỏng pha đảo (RP-HPLC). Detector mảng diod (DAD) là kỹ thuật phát hiện được sử
dụng rộng rãi nhất để nhận biết các anthocyanin do phổ UV-Vis đặc trưng của
chúng. Trong đề tài này, lựa chọn phương pháp sắc ký lỏng HPLC với detector
DAD (HPLC-DAD) và phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng với detector
MS/MS (UPLC-MS/MS) để tách và xác định đồng thời sáu anthocyanin và sáu
anthocyanidin.
Phương pháp sắc ký lỏng HPLC-DAD cho phép tách và định lượng riêng
từng chất dựa vào thời gian lưu và bước sóng hấp thụ. Đây là phương pháp phân
tích đồng thời, có độ chọn lọc, độ chính xác cao, chi phí thấp hơn rất nhiều so với
Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS cho phép phát hiện và định lượng riêng từng chất dựa theo phổ khối với độ nhạy và độ chính xác cao. Đối với LC-MS/MS khi các chất phân tích khác nhau về phổ khối chúng khơng cần phải tách nhau hồn tồn. Phương pháp cho phép xác định chính xác loại anthocyanin và anthocyanidin và có thể sàng lọc các anthocyanin khác trong nhóm, đồng thời cho
phép xác định các anthocyanidin trong dạng liên kết với gốc đường (anthocyanin)
hỗ trợ đắc lực cho quá trình khảo sát đánh giá hiệu suất quá trình thuỷ phân chuyển anthocyanin thành anthocyanidin trong nghiên cứu quá trình xử lý mẫu.
Việc đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của các anthocyanin và các nền mẫu
chứa anthocyanin được thực hiện theo nhiều phương pháp khác nhau, trong đó,
phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử sử dụng phản ứng khử gốc tự do DPPH
được sử dụng phổ biến nhất do phương pháp nhanh, đơn giản và có độ chính xác