1.5.1. Nguyên tắc
Phương pháp mặt mục tiêu là tập hợp các kĩ thuật toán học và thống kê sử dụng để mơ hình hố và phân tích trong trường hợp hàm mục tiêu chịu ảnh hưởng của nhiều biến độc lập [4]. Trong phương pháp này, mối quan hệ giữa hàm mục tiêu và biến độc lập chưa xác định trước, vì vậy bước đầu tiên của phương pháp là xác định mối quan hệ gần đúng giữa hàm mục tiêu và các biến. Sau khi có mơ hình gần đúng, có thể tìm điều kiện tối ưu theo 2 phương pháp sau:
- Phương pháp tối ưu hóa theo mơ hình hồi qui:
Để mơ hình tính tốn có cực trị thì ít nhất phải là mơ hình bậc hai trở lên trong đó phổ biến nhất là xây dựng mơ hình bậc hai và bậc 3 từ thực nghiệm.
+ Bậc 2 đầy đủ: số hạng của phương trình hồi quy là: 2n Trong đó: n: là số nhân tố
ảnh hưởng,2: số mức được chọn đối với nhân tố.
+ Bậc 3 đầy đủ: số hạng của phương trình hồi quy là: 3n
Sau khi có phương trình hồi qui mô tả hàm mục tiêu, dựa vào hàm này để
tìm điều kiện tối ưu bằng cách quay để loại ảnh hưởng tương hỗ của các biến sau đó lấy đạo hàm theo từng biến và cho bằng 0 để tìm ra cực trị của hàm.
- Xây dựng mơ hình mặt mục tiêu
Có nhiều phương pháp tìm phương trình hồi quy bậc 2 nhưng phổ biến nhất là 2 phương pháp:
- Dùng ma trận trực giao - Dùng ma trận tâm xoay
Trong phương trình hồi qui bậc 2 có bao nhiêu số hạng thì ít nhất phải có bấy
nhiêu phương trình (lấy bấy nhiêu thực nghiệm) để tìm được các hệ số hồi qui
tương ứng cho mỗi số hạng.
Hàm mục tiêu được biểu diễn bằng một phương trình hồi qui dạng đa thức:
Y= b0.x0 +Σbi.xi +Σbij.xixi +Σbii.xi2
Phương trình hồi qui bậc 2 mô tả một mặt mục tiêu trong không gian n chiều, có lồi lõm tương ứng với các giá trị cực trị của hàm mục tiêu. Các cực trị này chính là điều kiện thực nghiệm tối ưu tìm được.
Việc thiết kế thí nghiệm, xử lý số liệu và tìm điều kiện tối ưu dựa trên lý
thuyết này hiện nay được thực hiện sử dụng các phần mềm thống kê như: Modde,
được thiết kế riêng cho mơ hình hóa thực nghiệm và được sử dụng phổ biến nhất trên thế giới [49, 55, 83, 111].
1.5.2. Phương pháp mặt mục tiêu tìm điều kiện tối ưu cho quá trình tách sắc
ký lỏng
Hiện nay, trên thế giới đã có một số nghiên cứu sử dụng phương pháp mặt
mục tiêu tìm điều kiện tối ưu cho quá trình tách sắc ký lỏng nhưng chưa có cơng bố
nào ứng dụng phương pháp này để tìm điều kiện tối ưu tách các anthocyanin và
anthocyanidin.
Tác giả Mohammad Talebi [49] đã sử dụng phương pháp mặt mục tiêu với
mơ hình Box-Behnken để tìm điều kiện tối ưu tách acid salicylic, acid acetyl
salicylic và acid ascorbic trong nền mẫu dược phẩm. Bốn biến độc lập được khảo sát đồng thời bao gồm: nồng độ ACN trong pha động, pH, nồng độ đệm và nhiệt độ.
Các hàm mục tiêu là độ phân giải của hai cặp pic và thời gian lưu của các chất
nghiên cứu. Sử dụng phần mềm Design Expert 6.0.6 để thiết kế thí nghiệm với mỗi biến tại ba mức thu được tổng số 27 thí nghiệm. Các thí nghiệm được tiến hành theo trật tự ngẫu nhiên để tránh các sai số. Mơ hình thu được phù hợp và chính xác với
hệ số tương quan R2 > 0,92; độ chụm (CV < 10%), độ chính xác đầy đủ (Adequate
precision) > 4. Cài đặt các khoảng giá trị (range) với các mục tiêu (target) và tầm
quan trọng (importance) nhất định, thu được điều kiện tách tối ưu: pha động bao
gồm ACN/amoni acetat 22mM, pH 4,4 (82:12) và nhiệt độ cột 28oC. Phương pháp
được thẩm định về độ đặc hiệu, độ chọn lọc, khoảng tuyến tính, độ chụm và độ
đúng đạt yêu cầu.
Để tìm điều kiện sắc ký tối ưu tách moxifloxacin và ketorolac tromethamine trong thuốc nhỏ mắt, tác giá S. Gananadhamu [55] đã sử dụng thiết kế thực nghiệm
và mơ hình bậc hai tâm trực giao FCC. Ba biến độc lập ảnh hưởng đến quá trình
tách được khảo sát bao gồm: tốc độ dòng, pH pha động, thành phần MeOH trong
pha động với các hàm: thời gian lưu của chất được rửa giải sau (ketorolac
nghiệm với 15 thí nghiệm, trong đó có 5 thí nghiệm ở tâm được thiết kế sử dụng phần mềm Design Expert 8.0.4.1. Kết quả đánh giá thống kê cho thấy mơ hình hồn
tồn phù hợp với hệ số tương quan R2 > 0,96, độ chụm (CV) từ 1,42 – 6,36%, độ
chính xác đầy đủ (Adequate precision) 26,962 – 28,28. Tối ưu đa mục tiêu được
thực hiện sử dụng công cụ hàm Derringer (Derringer’s desirability function): thời gian lưu với mục tiêu (target) = 6, tầm quan trọng 4 và hệ số kéo đuôi với khoảng giới hạn 2 và tầm quan trọng 2. Kết quả điều kiện tách sắc ký tối ưu: pha động gồm MeOH/đệm phosphate 25mM, pH 3,2, TEA 0,5%) tỉ lệ 60/40 và tốc độ dòng 1,2 mL/phút.
Nhóm tác giả Yan Jiang, Hui-Jun Li [111] đã xây dựng phương pháp tối ưu
để đánh giá chất lượng và phân loại hoàng liên (Coptidis Rhizoma) bằng sắc ký lỏng cặp ion kết hợp phương pháp mặt mục tiêu với mơ hình Box-Behnken. Bốn biến độc lập được đánh giá bao gồm: tỉ lệ ACN trong pha động, nồng độ của chất tạo cặp
natri hepta sulfonat, nồng độ phosphat và pH của pha động, mỗi biến với 3 mức.
Thiết kế thí nghiệm và phân tích thống kê được thực hiện sử dụng phần mềm
Design Expert 8.0.6 với 30 thí nghiệm, trong đó có 6 thí nghiệm ở tâm. Hàm mục tiêu là độ phân giải của các pic và thời gian lưu của chất được rửa giải cuối cùng.
Phương trình hồi quy mơ tả mặt mục tiêu với hệ số R2 > 0,86%, độ chụm (CV) <
7,36%, độ chính xác phù hợp 15,23 - 68,20. Điều kiện tối ưu được cài đặt với mục tiêu: độ phân giải 1,3 – 1,5 và thời gian lưu của chất được rửa giải cuối cùng: 20 –
60 phút sử dụng chế độ hàm tối ưu hóa số học trong phần mềm Design Expert thu
được: X1 = 35,82%, X2 = 25,24 g/L, X3 = 0,05 mol/L.
Để tìm điều kiện tối ưu cho quá trình tách sắc ký lỏng với mục tiêu đạt được độ phân giải mong muốn, pic sắc ký cân đối và thời gian phân tích phù hợp cho tất
cả các chất nghiên cứu, nhóm tác giả Biljana Jancic Stojanovic và cộng sự [83] đã
sử dụng hàm chung CRF (chromatographic response function) để tách hỗn hợp 6
chất trong nhóm thuốc chống trầm cảm. Ba biến độc lập được khảo sát đồng thời
thực nghiệm bậc ba với ba nhân tố được thực hiện bởi phần mềm Statistica 7 đưa ra
30 thí nghiệm. Hàm CRF là hàm tổng hợp của các yếu tố: độ phân giải, thời gian
lưu của chất được rửa giải cuối cùng và độ rộng chân pic. CRF được tính tốn dựa trên số liệu thực nghiệm của 30 thí nghiệm cho tất cà 6 chất phân tích, với giá trị thu được trong khoảng 1,56 - 8,72. CRF càng nhỏ, điều kiện sắc ký thu được càng tốt, nghĩa là: độ phân giải tốt, thời gian phân tích ngắn, độ rộng chân pic nhỏ. Phân tích phương sai cho thấy ảnh hưởng có nghĩa của các yếu tố và ảnh hưởng tương hỗ giữa
chúng. Giá trị CRF nhận được thấp nhất trong vùng mà các yếu tố có giá trị cao
nhất: pH 6,0 và nồng độ đệm 60 mM, thành phần ACN 86%.
Như vậy, quá trình tách sắc ký lỏng đã được tối ưu hóa sử dụng mơ hình thực nghiệm với phương pháp mặt mục tiêu cho thấy nhiều ưu điểm với việc giảm thiểu
số thí nghiệm, đánh giá được ảnh hưởng tương hỗ của các yếu tố, điều kiện tối ưu
tìm được là điều kiện tối ưu của đồng thời nhiều mục tiêu cho kết quả tách sắc ký lỏng với độ phân giải tốt, thời gian phân tích phù hợp và pic sắc ký cân đối.
1.5.3. Phương pháp mặt mục tiêu tìm điều kiện tối ưu cho quá trình xử lý mẫu xác định anthocyanidin xác định anthocyanidin
Hiện nay, một số công bố thường tìm điều kiện tối ưu để thủy phân
anthocyanin thành anthocyanidin theo phương pháp đơn biến. Nhược điểm của
phương pháp là chỉ biến đổi một biến trong khi giữ cố định giá trị các biến cịn lại nên số thí nghiệm cần thực hiện nhiều, trong nhiều trường hợp không phản ánh đầy đủ các yếu tố ảnh hưởng do có sự tương tác giữa các biến, nên hiệu quả chiết thấp, thời gian thí nghiệm kéo dài.
Nhằm tránh các hạn chế của phương pháp đơn biến, một số cơng trình trên
thế giới đã sử dụng phương pháp quy hoạch thực nghiệm theo mơ hình hồi quy đa
biến để tìm điều kiện tối ưu quá trình thủy phân [27, 29, 68, 82]…Các nghiên cứu
chủ yếu sử dụng phương pháp mặt mục tiêu (RSM) để mơ hình hóa, tìm điều kiện
đánh giá mức độ ảnh hưởng từng yếu tố khảo sát, đánh giá sự ảnh hưởng tương hỗ giữa các yếu tố, đồng thời cho phép dự đoán kết quả dựa trên phương trình hồi qui.
Theo kết quả nghiên cứu của Pinho [82] khi sử dụng mặt mục tiêu để tối ưu
quá trình thủy phân rượu vang đỏ theo phương pháp chưng cất hồi lưu nhận thấy
ảnh hưởng đáng kể của bậc nhất các yếu tố là nhiệt độ, thời gian và nồng độ acid,
ảnh hưởng bậc hai của nhiệt độ, thời gian và ảnh hưởng tương hỗ của nhiệt độ với
thời gian đến quá trình thủy phân các anthocyanin thành anthocyanidin. Cũng bằng
phương pháp này, Steven W. Lloyd [69] tối ưu điều kiện thủy phân anthocyanin
trong quả việt quất ở điều kiện tối ưu tìm được là nồng độ acid HCl 3,7M tại nhiệt
độ 99oCvới thời gian 6,4 phút theo hai phương pháp chưng cất hồi lưu và thủy phân
trong bình kín có sự ảnh hưởng tương hỗ giữa nhiệt độ với thời gian, nhiệt độ và
nồng độ acid, ảnh hưởng bậc nhất của thời gian và nồng độ acid, ảnh hưởng bậc hai của nhiệt độ và nồng độ acid.