Nghiên cứu kỹ thuật tạo giống dưa chuột đơn bội nuôi cấy in vitro bao phấn

Luận văn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI ----------      ---------- ðẶNG THỊ MAI NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT TẠO CÂY DƯA CHUỘT ðƠN BỘI TỪ NUÔI CẤY IN VITRO BAO PHẤN LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: TRỒNG TRỌT Mã số: 60.62.01 Người hướng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN THỊ KIM THANH HÀ NỘI - 2009 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… i LỜI CAM ðOAN - Tôi xin cam ñoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào. - Tôi xin cam ñoan rằng, mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñược chỉ rõ nguồn gốc. Tác giả luận văn ðặng Thị Mai Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… ii LỜI CẢM ƠN ðể hoàn thành ñợc bản luận văn này tôi ñã nhận ñợc rất nhiều sự chia sẻ và giúp ñỡ. Qua ñây tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới: - TS. Nguyễn Thị Kim Thanh, người ñã tận tình hướng dẫn, tạo ñiều kiện, giúp ñỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện ñề tài và hoàn chỉnh luận văn. - Tập thể các thầy cô giáo trong bộ môn Sinh lý thực vật - Khoa Nông học - Trường ñại học Nông nghiệp Hà Nội ñã nhiệt tình giúp ñỡ tôi trong quá trình thực tập. - Tập thể cán bộ bộ môn Công nghệ sinh học - Viện nghiên cứu Rau Quả ñã tạo mọi ñiều kiện giúp ñỡ tôi hoàn thành tốt ñề tài tốt nghiệp. - Cảm ơn gia ñình, bạn bè, ñồng nghiệp và người thân ñã ñộng viên, giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình học tập. Tác giả luận văn ðặng Thị Mai Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… iii MỤC LỤC Lời cam ñoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục các chữ viết tắt v Danh mục bảng vi Danh mục hình viii 1. MỞ ðẦU 1 1.1 ðặt vấn ñề 1 1.2 Mục ñích, yêu cầu của ñề tài 3 1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài 3 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 2.1 Giới thiệu chung về cây dưa chuột 4 2.2 Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn 9 2.3 Cây ñơn bội và vị trí của cây ñơn bội trong chọn tạo giống cây trồng. 15 2.4 Những nghiên cứu về kỹ thuật nuôi cấy bao phấn tạo cây ñơn bội In vitro trên thế giới và trong nước 18 3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 3.1 Vật liệu, ñịa ñiểm và thời gian nghiên cứu 26 3.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu: Bao gồm 3 nội dung chính 26 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 35 4.1 Nghiên cứu kỹ thuật tạo callus từ nuôi cấy invitro bao phấn dưa chuột 35 4.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nền môi trường dinh dưỡng cơ bản ñến hiệu quả tạo callus từ nuôi cấy in vitro bao phấn dưa chuột 35 4.1.2 Ảnh hưởng của thời gian xử lý lạnh ở 4 o C ñến hiệu quả tạo callus bao phấn dưa chuột 39 4.1.3 Ảnh hưởng của kích thước nụ hoa ñến hiệu quả tạo callus từ nuôi cấy in vitro bao phấn dưa chuột 43 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… iv 4.1.4 Ảnh hưởng của nồng ñộ auxin ñến hiệu quả tạo callus từ nuôi cấy in vitro bao phấn dưa chuột 46 4.1.5 Ảnh hưởng của của tổ hợp auxin và cytokinin ñến hiệu quả tạo callus từ nuôi cấy in vitro bao phấn dưa chuột 57 4.2 Nghiên cứu kỹ thuật tái sinh cây từ callus của bao phấn dưa chuột 65 4.2.1 Ảnh hưởng của nồng ñộ Thidiazuron (TDZ) ñến khả năng tái sinh cây từ callus của bao phấn dưa chuột 65 4.2.2 Ảnh hưởng của nồng ñộ BAP ñến sự tái sinh từ callus của bao phấn dưa chuột 68 4.2.4 Ảnh hưởng của tổ hợp TDZ+ BAP ñến khả năng tái sinh cây từ callus của bao phấn dưa chuột 70 4.2.5 Ảnh hưởng của chất ñiều tiết sinh trưởng trong môi trường tạo callus ñến khả năng tái sinh cây 72 4.2.6 Kết quả phân tích ñộ bội của cây dưa chuột thu ñược bằng phương pháp xác ñịnh gián tiếp hàm lượng ADN bằng máy Flow cytometry 76 4.3 Nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh cây dưa chuột ñơn bội invitro. 76 4.3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng cao nấm men ñến khả năng nhân nhanh chồi dưa chuột ñơn bội 77 4.3.2 Ảnh hưởng của nồng ñộ BAP ñến khả năng nhân nhanh cây dưa chuột ñơn bội 79 4.3.3 Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và IAA ñến khả năng nhân nhanh cây dưa chuột ñơn bội (sau 6 tuần) 81 5. KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 84 5.1. Kết luận 84 5.2. ðề nghị 85 TÀI LIỆU THAM KHẢO 86 PHỤ LỤC 92 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT α-NAA α -Naphthaleneacetic acid BAP 6 - Benzylamino purine 2,4D 2,4 - dichlorophenoxi aceticacid IAA Indole -3- aceticacid KI Kinetin TDZ Thidiazuron CNM Cao nấm men MS Murashige & Skoog, 1962 CW Nước dừa B5 Gamborg (1968) N6 Chu và Cs (1975) CT Công thức CTTD Chỉ tiêu theo dõi CTTN Công thức thí nghiệm ð/C ðối chứng NXB Nhà xuất bản ppm Nồng ñộ mg/l TB Trung bình Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… vi DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 2.1. Diện tích, năng suất, sản lượng dưa chuột một số nước trên thế giới năm 2005 7 2.2. Tình hình xuất nhập khẩu dưa chuột một số nước trên thế giới năm 2005 8 4.1. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng cơ bản ñến hiệu quả tạo callus từ nuôi cấy in vitro bao phấn dưa chuột 36 4.2. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng cơ bản ñến ñộng thái tăng trưởng callus 36 4.3. Ảnh hưởng của thời gian xử lý lạnh ñến hiệu quả tạo callus từ nuôi cấy in vitro bao phấn dưa chuột 40 4.4. Ảnh hưởng của thời gian xử lý lạnh ñến ñộng thái tăng trưởng callus qua các thời ñiểm theo dõi 42 4.5. Ảnh hưởng của kích thước nụ hoa ñến hiệu quả tạo callus bao phấn dưa chuột 44 4.6. Ảnh hưởng của kích thước nụ hoa ñến ñộng thái tăng trưởng callus qua các thời ñiểm theo dõi 45 4.7. Ảnh hưởng của nồng ñộ αNAA ñến hiệu quả tạo callus từ nuôi cấy in vitro bao phấn dưa chuột 48 4.8. Ảnh hưởng của nồng ñộ αNAA ñến ñến ñộng thái tăng trưởng callus qua các thời ñiểm theo dõi 49 4.9. Ảnh hưởng của nồng ñộ IAA ñến ñến hiệu quả tạo callus từ nuôi cấy in vitro bao phấn dưa chuột 51 4.10. Ảnh hưởng của nồng ñộ IAA ñến ñộng thái tăng trưởng callus qua các thời ñiểm theo dõi 52 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… vii 4.11. Ảnh hưởng của nồng ñộ 2,4D ñến hiệu quả tạo callus từ nuôi cấy in vitro bao phấn dưa chuột 54 4.12. Ảnh hưởng của nồng ñộ 2,4D ñến ñộng thái tăng trưởng callus 55 4.13. Ảnh hưởng của tổ hợp 2,4D + KI ñến hiệu quả tạo callus bao phấn dưa chuột 58 4.14. Ảnh hưởng của 2,4D + KI ñến ñộng thái tăng trưởng callus qua các thời ñiểm theo dõi 60 4.15. Ảnh hưởng của 2,4D + BAP ñến hiệu quả tạo callus từ nuôi cấy in vitro bao phấn dưa chuột 62 4.16. Ảnh hưởng của 2,4D + BAP ñến ñộng thái tăng trưởng callus qua các thời ñiểm theo dõi 63 4.17. Ảnh hưởng của nồng ñộ TDZ ñến sự tái sinh từ callus bao phấn dưa chuột 66 4.18. Ảnh hưởng của nồng ñộ BAP ñến sự tái sinh từ callus bao phấn dưa chuột 69 4.19. Ảnh hưởng của TDZ + BAP ñến khả năng tái sinh cây từ callus của bao phấn dưa chuột 70 4.20. Ảnh hưởng của chất ñiều tiết sinh trưởng trong môi trường tạo callus ñến khả năng tái sinh cây 73 4.21. Kết quả phân tích ñộ bội của các chồi dưa chuột 76 4.22. Ảnh hưởng của hàm lượng cao nấm men ñến khả năng nhân nhanh chồi dưa chuột ñơn bội (sau 6 tuần) 77 4.23. Ảnh hưởng của nồng ñộ BAP ñến khả năng nhân nhanh cây dưa chuột ñơn bội (sau 6 tuần) 80 4.24. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và IAA ñến khả năng nhân nhanh cây dưa chuột ñơn bội (sau 6 tuần) 82 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… viii DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 4.1. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng cơ bản ñến tỷ lệ bao phấn tạo callus 37 4.2. Ảnh hưởng của thời gian xử lý lạnh ñến tỷ lệ bao phấn tạo callus 40 4.3. Ảnh hưởng của thời gian xử lý lạnh ñến ñộng thái tăng trưởng của callus qua các thời ñiểm theo dõi 42 4.4. Ảnh hưởng của chiều dài nụ hoa ñến ñộng thái tăng trưởng của callus qua các thời ñiểm theo dõi 45 4.5. Ảnh hưởng của nồng ñộ αNAA ñến tỷ lệ bao phấn tạo callus 48 4.6. Ảnh hưởng của nồng ñộ IAA ñến tỷ lệ bao phấn tạo callus 51 4.7. Ảnh hưởng của nồng ñộ 2,4D ñến tỷ lệ bao phấn tạo callus 54 4.8. Ảnh hưởng của nồng ñộ 2,4D ñến ñộng thái tăng trưởng của callus qua các thời ñiểm theo dõi 56 4.9. Ảnh hưởng của tổ hợp 2,4D+KI ñến tỷ lệ bao phấn tạo callus 58 4.10. Ảnh hưởng của tổ hợp 2,4D+ BAP ñến tỷ lệ bao phấn tạo callus 62 4.11. Sự tái sinh callus từ bao phấn dưa chuột 64 4.12. Ảnh hưởng của nồng ñộ TDZ ñến tỷ lệ mẫu tái sinh 66 4.13. Ảnh hưởng của nồng ñộ BAP ñến tỷ lệ mẫu tái sinh 69 4.14 Ảnh hưởng của chất ñiều tiết sinh trưởng trong môi trường tạo callus ñến tỷ lệ mẫu tái sinh của callus bao phấn dưa chuột 73 4.15. Các dạng tái sinh của callus bao phấn dưa chuột 74 4.16. Kết quả phân tích ñộ bội của cây dưa chuột thu ñược bằng máy Flow cytometry 75 4.17 Ảnh hưởng của hàm lượng cao nấm men ñến khả năng nhân nhanh cây dưa chuột 78 4.18. Ảnh hưởng của nồng ñộ BAP ñến hệ số nhân chồi sau 6 tuần 80 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 1 1. MỞ ðẦU 1.1 ðặt vấn ñề Cây dưa chuột (Cucumis sativus L.) là loại cây rất quen thuộc ở nước ta. Quả có thể dùng ăn tươi hoặc chế biến ñược nhiều món ăn ngon. Ngoài ra, dưa chuột còn có giá trị như một vị thuốc quý, trong quả dưa chuột có chứa hàm lượng vitamin C khá cao và một số men có lợi cho kích thích tiêu hoá rất tốt cho sức khỏe. ðặc biệt, quả dưa chuột ñã ñược chế biến thành nhiều mặt hàng ña dạng như: ñóng lọ, thái lát, muối mặn . xuất khẩu sang một số nước châu Âu, châu Mỹ, châu Á: Hoa Kỳ, Hàn Quốc, ðài Loan, Trung Quốc, Nhật Bản, Singapo . [10] Trong những năm gần ñây mặc dù ñã có nhiều có gắng trong công tác chọn, tạo giống nhưng bộ giống dưa chuột ở nước ta vẫn còn nhiều hạn chế. Các giống dưa chuột dùng cho ăn tươi, tiêu thụ nội ñịa thì năng suất, hiệu qủa kinh tế thấp. Các giống dùng cho chế biến công nghiệp, xuất khẩu còn quá ít không ñủ ñáp ứng cho nhu cầu sản xuất. Trước yêu cầu của thực tế sản xuất, việc chọn tạo những giống dưa chuột có năng suất cao, phẩm chất tốt phục vụ cho nhu cầu ăn tươi và chế biến là rất cần thiết. Ở hầu hết các nước việc chọn tạo các giống dưa mới ñều theo hướng tạo ra các giống dưa F1 có ưu thế lai cao từ các dòng bố mẹ thuần chủng. Nhưng dưa chuột có ñặc ñiểm là cây ñơn tính cùng gốc, giao phấn chủ yếu nhờ côn trùng nên việc tạo ra các dòng thuần bằng phương pháp truyền thống thường tốn rất nhiều thời gian và công sức. Dòng thuần ñược tạo ra bằng cách tự thụ phấn và chọn lọc qua nhiều thế hệ (7 - 8 thế hệ). Mặc dù vậy phương pháp này nhiều khi vẫn không ñạt ñược dòng bố mẹ ñồng hợp tử ở tất cả các cặp alen. Chính vì vậy, việc rút ngắn thời gian chọn tạo dòng thuần là một yêu cầu rất quan trọng trong công tác chọn tạo giống mới nói chung và chon tạo giống dưa chuột nói riêng.