Luận Văn Thạc Sĩ Nghiên Cứu Các Phương Pháp Phân Lập Zerumbon Có Chất Lượng Cao Từ Thân Rễ Cây Gừng Gió

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - LÊ THỊ THÙY NGHIÊN CỨU CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN LẬP ZERUMBON CÓ CHẤT LƢỢNG CAO TỪ THÂN RỄ CÂY GỪNG GIÓ (ZINGIBER ZERUMBERT SM) VÀ CHUYỂN HÓA ZERUMBON THÀNH CÁC HỢP CHẤT CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2011 MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Khái quát chi Gừng (Zingiber) 1.1.1 Đặc điểm thực vật chi Gừng: 1.1.2 Sinh thái, sinh trƣởng phát triển 1.2 Khái quát Gừng gió (Zingiber zerumbet Sm) 1.2.1 Đặc điểm thực vật 1.2.2 Nguồn gốc phân bố Gừng gió (Zingiber zerumbet Sm) 1.2.3 Thành phần hóa học Gừng gió (Zingiber zerumbet Sm) 1.2.3.1 Các tecpenoit tinh dầu Gừng gió 1.2.3.2 Các curcuminoit 16 1.2.3.3 Các flavonoit 17 1.3 Công dụng hoạt chất sinh học Gừng gió (Zingiber zerumbet Sm) 20 1.3.1 Gừng gió y học dân tộc Phƣơng Đông 20 1.3.2 Các hoạt chất sinh học Gừng gió (Zingiber zerumbet Sm) 20 1.3.3 Zerumbone hoạt tính sinh học 22 1.3.3.1 Zerumbone hoạt tính sinh học 22 1.3.3.2 Cơ chế oxi hóa khử [12] 24 1.3.3.3 Cơ chế thúc đẩy trình tự chết (apoptosis mechanism) 25 1.3.4 Phân lập chuyển hóa Zerumbone 27 1.3.4.1 Phân lập Zerumbone 27 CHƢƠNG 33 ĐỀ TÀI, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 33 2.1 Đề tài, mục tiêu, nội dung 33 2.1.1 Đề tài 33 2.1.2 Mục tiêu đề tài 33 2.1.3 Nhiệm vụ đề tài 33 2.2.1 Thiết bị nghiên cứu 34 2.2.2 Các hóa chất 34 2.3 Thực nghiệm 35 2.3.1 Nghiên cứu phƣơng pháp phân lập zerumbone từ thân rễ gừng gió 35 2.3.1.1 Nguyên liệu phƣơng pháp xử lý 35 2.3.1.2 Điều chế cặn chiết không phân cực 35 2.3.1.3 Phân lập Zerumbone có chất lƣợng cao từ cặn chiết không phân cực sắc ký cột 35 2.3.1.4 Phân lập Zerumbone chất lƣợng cao từ cặn chiết không phân cực phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng điều chế (SKLMĐC) 36 2.3.1.5 Điều chế zerumbone có chất lƣợng cao từ cặn chiết phần không phân cực phƣơng pháp kết tinh phân đoạn 38 2.3.2 Điều chế dẫn xuất Zerumbone 39 2.3.2.1 Điều chế amino zerumbone ( ZerNH2) 39 2.3.2.2 Điều chế 3- isopropylaminozerumbone 39 2.4 Khảo sát hoạt tính chống ung thƣ dẫn xuất Zerumbone 39 CHƢƠNG 41 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 41 3.1 Điều chế Zerumbone chất lƣợng cao ( 99%) 41 3.1.1 Nguyên liệu cho điều chế zerumbone 41 3.1.2 Điều chế phần không phân cực (dầu Zerumbone) zerumbone tinh khiết 41 3.2 Tổng hợp số dẫn xuất zerumbone khảo sát hoạt tính chống ung thƣ chúng 46 3.2.1 Tổng hợp 3- amino 10- amino Zerumbone 46 3.2.2 Tổng hợp 3- isopropylamino zerumbone 51 3.3 Khảo sát hoạt tính chống ung thƣ 3-isopropylaminozerumbone 54 KẾT LUẬN 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 LỜI MỞ ĐẦU Gừng gió (Zingiber zerumbet Sm) thuốc dân tộc tiếng từ lâu đời không nƣớc ta mà nhiều nƣớc Đông Nam Á nhƣ Indonexia, Thái Lan, Miến Điện… Gừng gió mọc hoang dại phổ biến nƣớc ta từ Bắc tới Nam, đặc biệt tỉnh miền núi nƣớc ta Hợp chất có hoạt tính sinh học gừng gió Zerumbone- chất có hoạt tính phịng ngừa chống ung thƣ mạnh 10 loại ung thƣ khác nhau, đặc biệt ung thƣ gan ung thƣ vú Vì vậy, gần 20 năm trở lại đây, Zerumbone nhận đƣợc quan tâm nhiều nhà khoa học giới, đặc biệt nhà khoa học Nhật Bản Mỹ Ngoài nghiên cứu gần nhà khoa học chứng minh dẫn xuất zerumbone có hoạt tính phịng ngừa chống ung thƣ mạnh Chính mà chúng tơi đặc biệt quan tâm tới việc điều chế zerumbone có chất lƣợng cao từ gừng gió để chuyển hóa zerumbone thành chất khác nhằm tạo đƣợc hợp chất có hoạt tính sinh học phục vụ cho ngành y dƣợc Đấy lí mà chọn đề tài:“ Nghiên cứu phương pháp phân lập zerumbone có chất lượng cao từ thân rễ gừng gió( Zingiber zerumbet Sm) chuyển hóa zerumbone thành hợp chất có hoạt tính sinh học.” CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Khái quát chi Gừng (Zingiber) Họ Gừng (Zingiberaceae) có nhiều chi nhiều lồi khác Hầu hết loại thuộc họ Gừng phân bố chủ yếu nƣớc Đông Nam Á, Trung Quốc, Ấn Độ Nhật Bản… Theo tác giả Võ Văn Chi Dƣơng Đức Tiến tổng kết, họ Gừng có 45 chi gồm 1300 lồi, phân bố vùng nhiệt đới cận nhiệt đới Riêng Việt Nam, họ Gừng có chi gồm 25 loài khác phân bố rải rác từ Bắc tới Nam [4,5] Chi Gừng (Zingiber) gồm khoảng 100 loài, phân bố chủ yếu khu vực nhiệt đới Châu Á Châu Úc Trung tâm phong phú chi Gừng nƣớc Đông Nam Á 1.1.1 Đặc điểm thực vật chi Gừng: - Các thuộc chi Gừng loại thân thảo, sống nhiều năm, cao khoảng từ 0,5-3,5 m Thân rễ mập, phân nhánh nhiều, tạo thành củ nằm ngang mặt đất Thịt củ nạc, thơm có vị cay - Lá mọc so le theo hai phía đối xứng thân; phiến hình mác, thn đến bầu dục dài hình đƣờng chỉ; cuống ngắn hầu nhƣ khơng có; bẹ ngun xẻ hai thuỳ; có mùi thơm nhẹ - Cụm hoa bơng, thƣờng mọc từ thân rễ, “thân giả” Các hoa mọc sít hoa đƣợc bao bắc xếp nhƣ dạng vẩy cá từ dƣới lên trên; lúc đầu thƣờng có màu xanh, sau chuyển dần sang màu vàng, đỏ nhạt, vàng sáng đỏ Cánh hoa hình ống mảnh, màu trắng, vàng hồng; bao phấn thƣờng có dạng hình ống bao lấy vịi nhụy, bầu ba nhẵn có lơng dày Quả nang ơ, hạt nhiều, hình trứng hay hình xoan, màu nâu đỏ, màu đen, trắng hay vàng [7] 1.1.2 Sinh thái, sinh trƣởng phát triển Các lồi chi Gừng (Zingiber) thƣờng thích nghi với điều kiện ẩm, đƣợc che bóng nhiệt độ khơng q cao (khoảng 27-300C ban ngày 17-180C ban đêm) Chúng sinh trƣởng dƣới tán rừng thứ sinh, rừng bụi, rừng tre, rừng tếch, khe núi, thung lũng ven bìa rừng… Chúng ƣa đất tốt, màu mỡ sinh trƣởng tốt khu vực có độ cao dƣới 1500m so với mặt nƣớc biển Một số lồi mọc đất có lẫn sỏi đá, bãi đất trống rừng tới độ cao 3000m so với mặt nƣớc biển Thân, rễ loại thuộc chi Gừng phát triển nhanh Từ chồi giống ban đầu, chúng phân nhánh, đâm chồi, tăng sinh khối phát triển thành bụi lớn vài năm Ở nƣớc ta, chi Gừng phong phú Chúng sinh trƣởng chủ yếu vùng núi hầu hết tỉnh từ Bắc vào Nam Theo Phạm Hoàng Hộ [7], chi Gừng Việt Nam có 11 lồi nhƣ sau: Bảng 1.1 Các lồi Gừng có Việt Nam TT Tên khoa học Tên Việt Nam Phân bố Zingiber officinale Roscoe Gừng Phân bố rộng Zingiber acuminatum Valeton Gừng nhọn Zingiber conchichinensis Gagn Gừng Nam Bộ Zingiber eberhardtii Gagn Gừng Eberhardt Lâm Đồng Zingiber gramineum Bl Gừng lúa, Ngải trặc Biên Hòa Zingiber monophyllum Gagn Gừng Ninh Bình Zingiber pellitum Gagn Gừng bọc da Bà Rịa Zingiber purpureum Roscoe Gừng tía Phân bố rộng Zingiber rubens Roxb Gừng đỏ Lâm Đồng 10 Zingiber rufopilosum Gagn Gừng lông Hà Nội 11 Zingiber zerumbet (L.) J.E Sm Gừng gió Phân bố rộng Tây Nguyên, Trung Bộ Bà Rịa- Vũng Tàu Trong 11 lồi Gừng thƣờng thấy nƣớc ta, có loài đƣợc nhân dân ta dùng nhiều:  Gừng (Zingiber purpureum Roscoe): gọi Khƣơng, Sinh khƣơng (Gừng tƣơi), Can khƣơng (Gừng khô), đƣợc trồng khắp ba miền Bắc, Trung, Nam để làm mứt, gia vị, thuốc chữa bệnh đƣờng ruột Cây cao 0,5-1m Củ màu vàng, thơm, cay Phát hoa đất, hình bầu dục cọng dài 5-10cm Lá hoa xanh sau ngả sang đỏ Hoa vàng, cánh mơi to 2cm, có sọc đỏ Nỗn sào khơng long  Gừng tía (Zingiber montanum (Koanig) Dietrich): đƣợc dân gian gọi Gừng dại, Gừng đỏ… Ở nƣớc ta Gừng tía mọc tự nhiên Cúc Phƣơng (Ninh Bình), Ba Vì (Hà Nội) tỉnh phía Nam Gừng tía đƣợc dùng làm gia vị thay Gừng công nghiệp chế biến thực phẩm dùng làm thuốc chữa bệnh Cây cao đến 2m Củ màu vàng cam, vị nóng, đắng, thơm Phát hoa gốc, xoan hay bầu dục Lá hoa màu đỏ  Gừng gió (Zingiber zerumbet Sm ): xem mục 1.2 Cơng dụng lồi thuộc chi Gừng Hầu hết lồi thuộc chi Gừng (Zingiber) có chứa tinh dầu, đƣợc coi nguồn nguyên liệu có giá trị để làm gia vị làm thuốc Thân rễ đƣợc làm gia vị chế biến thực phẩm, nguyên liệu chế biến rƣợu bia, mứt Gừng… Trong dân gian, Gừng vị thuốc giúp kích thích tiêu hóa, dùng trƣờng hợp ăn, ăn uống không tiêu, chữa đau dày, cảm mạo, phong hàn, làm thuốc mồ hôi, chữa ho tiếng, mụn nhọt, đau đầu, đau nhức xƣơng… Gừng đƣợc dân gian dùng để chữa ho cho gia súc nhƣ trâu, bị, voi, ngựa bị đau mắt đỏ, ăn khơng nuốt đƣợc… 1.2 Khái quát Gừng gió (Zingiber zerumbet Sm) Cây Gừng gió có tên khoa học Zingiber zerumbet (L) J E Sm (hay Zingiber zerumbet Sm) thuộc chi Gừng (Zingiber), họ Gừng (Zingiberaceae) Ngoài ra, cịn có số tên đồng nghĩa sau: Amoum zerumbet L (1753); Zingiber amaricans Blume (1872); Z aromaticum Valeton (1918); Z littorale Valeton (1918) [9] Ở nƣớc, Gừng gió đƣợc gọi với nhiều tên riêng nhƣ: Riềng dại, Ngải mặt trời, Ngải xanh (Việt Nam), Khuhet phtu, Prateal vongatit (Campuchia), Gingembre fou (Pháp) Phong Khƣơng (Trung Quốc) [4, 5, 7, 8, 9] 1.2.1 Đặc điểm thực vật Gừng gió (Zingiber zerumbet.Sm) đƣợc xếp vào loại trồng quý cần đƣợc bảo tồn theo qui định số 80/2005/QĐ-BNN ký ngày 05/12/2005 Bộ NN & PTNT Nó thuộc danh mục 1, danh mục nguồn gien trao đổi quốc tế trƣờng hợp đặc biệt Gừng gió thuộc dạng thảo, cao khoảng 1,2-1,7 m Thân rễ (hay cịn gọi củ) phân nhánh, vỏ ngồi màu vàng nhạt, thịt củ màu vàng sáng, có mùi thơm nhẹ Ống bẹ xếp sít tạo thành thân giả, gần nhƣ khơng cuống; phiến hình mác thn, kích thƣớc 25-40 x 4-8 cm, thon gốc, chóp hình nhọn, mặt xanh lục đậm, mặt dƣới xanh nhạt có lơng rải rác Cụm hoa bơng, hình trụ hay trứng, kích thƣớc 6-14 x 4-5 cm, chóp tù, mọc từ thân rễ, cán dài 10-30 cm, thẳng, có nhiều vẩy xếp lợp lên bao quanh Cụm hoa có nhiều bắc xếp lớp lên nhau, bắc gần giống hình trứng, kích thƣớc 3-4 x 2,5 cm Khi cịn non có màu xanh, già chuyển sang màu đỏ Hoa mọc kẽ bắc; đài hình ống, dài 2,5 cm, ngắn bắc, màu trắng, tràng hoa hình ống, dài từ 5-5,5 cm với thùy hình mác dài, màu vàng chanh; có thùy, thùy phía lƣng lớn hơn, kích thƣớc 2,5 x cm; thùy bên nhỏ, kích thƣớc 1,6 x 0,7 cm; môi dài cm, mép có trịn, màu trắng vàng, bao phấn màu vàng nhạt; bầu Quả nang hình trụ hay bầu dục, dài 1,5 cm, chín có màu đỏ; hạt ít, màu đen, áo hạt có màu trắng [9] Tại Đông Nam Á dựa vào đặc điểm cụm hoa, năm 1996 Thailade mô tả xếp dạng khác lồi Gừng gió (Z zerumbet) vào thứ (var): Var amaricans (Blume) Thailade; Var aromaticum (Valeton) Thailade; var zerumbet; var littorale (Valeton) Thailade [9] Do đa dạng hình thái nên nghiên cứu thành phần hóa học tinh dầu Gừng gió phân bố vùng, nƣớc khác thay đổi giới hạn rộng Và suất thu hái “củ” thứ Gừng gió khác nhau, suất “củ” tƣơi var zerumbet khoảng từ 20-32 tấn/ha/năm, thứ khác thấp [9] Hình 1.1 Cây Gừng gió (Zingiber zerumbet Sm) 1.2.2 Nguồn gốc phân bố Gừng gió (Zingiber zerumbet Sm) Nhiều tác giả cho Gừng gió có nguồn gốc từ Ấn Độ, đƣợc ngƣời dân trồng phổ biến rộng rãi sang nhiều nƣớc Châu Á nhƣ: Việt Nam, Trung Quốc, Ấn Độ, Malaixia, Lào, Campuchia, Thái Lan Gừng gió lồi có nguồn gen đa dạng, sinh trƣởng nhanh, khả chống chịu khỏe nên tự nhiên hóa mạnh [8, 9] Ở Việt Nam, mọc rải rác tỉnh trung du, vùng núi thấp đơi có đồng Cây ƣa chịu ẩm, chịu bóng thƣờng mọc ven rừng, dƣới tán cây, rừng kín Ở vùng trung du đồng bằng, mọc lẫn lùm bụi dƣới chân đồi làng [4] 1.2.3 Thành phần hóa học Gừng gió (Zingiber zerumbet Sm) 1.2.3.1 Các tecpenoit tinh dầu Gừng gió Gừng gió nguyên liệu sản xuất công nghiệp chế biến thực phẩm, hƣơng liệu nên thành phần hóa học tinh dầu Gừng gió đƣợc nghiên cứu kĩ số nƣớc nhƣ Nhật Bản, Trung Quốc, Philippin … Ở nƣớc ta, Nguyễn Xuân Dũng cộng [21] nghiên cứu thành phần hóa học tinh dầu củ, thân, hoa Gừng gió vùng Bình Trị Thiên-Việt Nam i.Thành phần hóa học tinh dầu củ Gừng gió Tinh dầu Gừng gió chủ yếu tập trung phận củ, tinh dầu củ Gừng gió có mùi thơm nồng [6] Tinh dầu củ Gừng gió mọc vùng Bình Trị Thiên Đắc Lắc -Việt Nam có số hóa học đƣợc dẫn bảng 1.2 [6] Bảng 1.2 Một số số hóa học tinh dầu củ Gừng gió vùng Bình Trị Thiên Đắc Lắc-Việt Nam Vùng Chỉ số xà phịng hóa Chỉ số axit Chỉ số este Bình Trị Thiên 8,9790 5,8796 3,0994 Đắc lắc 8,5392 5,8769 2,6623 Thành phần hóa học củ Gừng gió vùng Bình Trị Thiên-Việt Nam đƣợc bảng 1.3 [6, 21]: Bảng 1.3 Thành phần hóa học tinh dầu củ Gừng gió vùng Bình Trị Thiên- Việt Nam Hàm TT Tên chất lƣợng Hàm TT Tên chất (%) lƣợng (%) Zerumbone 72,3 17 Myrcen 0,2 α-Humulene 4,2 18 α-Terpineol 0,2 Trên phổ DEPT (phụ lục 14 trang 75) cho thấy rõ nhóm CH có nhóm CH olefin vùng 120- 155ppm nhóm CH cacbon liên kết với nhóm amino nằm vùng 40-47 ppm, có nhóm CH2 nhóm CH3 vùng trƣờng mạnh Đáng ý nhóm CH3 dạng dublet có C= 8,2 ppm, H= 1,50ppm nhóm CH3 dạng singlet có C= 16,30ppm , H= 1,60ppm Kết hợp loại phổ nhận đƣợc hợp chất A sản phẩm nhờ dublet nhóm methyl vị trí 2, triblet proton vị trí có C= 40,02 ppm H= 2,08 ppm proton olefin vị trí 10 11 dạng E có C=155,4ppm, H= 6,7ppm; 1H,t,J = 16,2 C= 126,10ppm, H = 6,00ppm 1H,t,J= 16,2 Điều đƣợc khẳng định phổ COSYGP (phụ lục 15 trang 76) Hình 3.4: Cơng thức cấu tạo hợp chất A Bảng 3.3 : Dữ liệu phổ NMR hợp chất A 13 Số C C C ppm C* ppm 202.3 202.0 42.1 H H ppm Độ bội Số H J.Hz 55.3 2.51 qd 1H 7.3;1.6 40.2 53.1 2.08-2.02 m 1H 37.7 30.6 2.11-2.19 m 2H 48 38.4 38.0 2.32-2.43 m 2H 135.6 138.0 126.1 122.0 5.89 dd 1H 40.1 41.3 2.52-2.59 m 2H 40.1 39.9 10 155.5 151.7 6.76 d 1H 16.2 11 126.2 128.1 6.00 d 1H 16.2 12 8.2 6.0 1.54 d 3H 5.5 13 16.6 16.5 1.10 s 3H 14 26.2 22.9 1.06 s 3H 15 26.1 29.0 1.04 S 3H 16.0;2.9 (C* ppm : độ chuyển dịch cacbon 13C hợp chất A phổ 13CNMR theo tài liệu Takashi Kitsayama et al.,Tetrahedron 59(2003)) Hợp chất B hỗn hợp ZerNH2 đƣợc xác định vào tín hiệu singlet gây CH3 triblet proton C10: H = 2,16ppm, J=2,4Hz triblet proton C3 có C= 126,1ppm H= 6,00ppm; J= 3,3Hz Các liệu quang phổ 1H-NMR 13C-NMR hợp chất B đƣợc thể bảng 3.4 Trong phổ NOEISY thể có tồn tƣơng tác proton C10 proton C14, điều có nghĩa B cấu hình R Nhƣ vậy, kết luận tên hợp chất B là: (R)- (2E, 6E)- 10- amino-2,6,9,9tetramethylcycloundeca-2,6-dien-1-one 49 Hình 3.5: Công thức cấu tạo hợp chất B Bảng 3.4: Số liệu phổ NMR hợp chất B Số C 13 C C ppm H-NMR H ppm Độ bội Số H J.Hz 3.3 201.5 121.5 126.1 6.00 t 1H 32.1 2.34 m 2H 33.5 2.89 m 2H 121.2 120.8 5.12 dd 1H 33.4 2.55; 2.59 m 2H 33.3 10 37.5 2.16 t 1H 7.3 11 33.5 2.57 d 2H 7.4 12 16.3 1.60 s 3H 13 27.4 1.04 s 3H 14 26.2 1.06 s 3H 15 26.1 1.04 s 3H 50 6.6; 6.3 Hàm lƣợng chất A B hỗn hợp đƣợc xác định tỷ lệ điện tích pic proton H3 hợp chất A H10 hợp chất B tổng điện tích pic proton Kết tính tốn cho thấy A chiếm 39,43% hỗn hợp B chiếm 60,67% hỗn hợp Cơ chế phản ứng cộng hợp NH3 vào Zerumbone tạo hợp chất A đƣợc Takashi Kitayama cộng đề cập đến năm 2003[38] cấu hình sản phẩm đƣợc tác giả xác định tia X X: -NH2; - NMe2 Hình 3.3: Phƣơng trình phản ứng amin zerumbone Trong phổ NOESY sản phẩm (phụ lục 18 trang 79) không thấy có tƣơng tác proton vị trí với proton nhóm methyl C12- điều có nghĩa H3 anti với nhóm CH3 nhóm amin(X) proton C2 syn với nhƣ hình 3.4 3.2.2 Tổng hợp 3- isopropylaminozerumbone Trong tài liệu công bố dẫn xuất 3- amino; NH2; CH3NH; (CH3)2N; BuNH2; phenylNH; nhƣng chƣa có 3- isopropylaminozerumbone Vì chúng tơi tổng hợp dẫn xuất Khi cho isopropylamin tƣơng tác với zerumbone axetonitril khuấy thời gian ngày nhiệt độ 28-300C tinh chế sản phẩm thu đƣợc sản phẩm 3-isopropyl- 2,6,9,9- tetramethyl- (E,E)- 6,10- cycloundecadien- 1- one 51 (3- isopropylaminozerumbone) có lẫn zerumbone Sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi n-hexan/ EtOAc 8/2(v/v) cho vệt rõ rệt, vệt zerumbone có Rf = 0,8 màu vàng chanh, vệt sản phẩm có Rf = 0,65 màu xanh nâu với vanillin/H2SO4 đặc 0,2% Hình 3.6: Phƣơng trình phản ứng isopropylamin zerumbone Khối phổ sản phẩm (phụ lục 20,21 trang 81,82) cho pic phân tử lƣợng [M]+ = 219 [M]+ = 277, tƣơng ứng với phân tử lƣợng Zerumbone 3isopropylaminozerumbone Phổ IR sản phẩm (phụ lục 19 trang 80) cho thấy rõ nhóm amin bậc NH = 3455 cm-1, nhóm C=O có C=O 1727cm-1, liên kết đơi C=C=1661cm-1 CH = 833cm-1 Phổ 13 C-NMR (phụ lục 23 trang 84 )cho thấy có 33 nguyên tử cacbon, tổng số cacbon phân tử 3-isopropylamino zerumbone zerumbone, có nhóm cacbonyl C = 202,23ppm 201,48ppm, 10cacbon olefin vùng trƣờng yếu 120-160ppm tổng cacbon olefin phân tử sản phẩm, 11 cacbon no nằm vùng trƣờng mạnh từ 42ppm  1ppm Phổ DEPT (phụ lục 24 trang 85) cho thấy có nhóm CH, có nhóm CH olefin trƣờng thấp120-160ppm CH trƣờng mạnh nhóm CH C1 C2, nhóm CH2 nhóm CH3, số liệu phù hợp với tổng số liệu nhóm methyl metylen phân tử Phổ 1H-NMR (phụ lục 22 trang 83)cho thấy rõ proton vùng từ 5,1ppm đến 9,8ppm 52 Sự kết hợp phổ 1H-NMR 13 C-NMR phổ HSQC (phụ lục 27 trang 88) cho thấy proton olefin C7 3-isopropylaminozerumbone có H = 5,12 proton C7 zerumbone có H = 5,23ppm Nhờ cƣờng độ proton mà tính đƣợc hàm lƣợng 3-isopropylaminozerumbone sản phẩm 64,06% Công thức 3-isopropylaminozerumbone Số liệu phổ 13C 1H-NMR đƣợc cho bảng dƣới Bảng 3.5: Dữ liệu phổ NMR sản phẩm 13 Số C 3-isopropylamino zerumbone C zerumbon H 3-isopropylamino zerumbone zerumbon 202.23 201.48 32.13 137.97 2.58; q; 1H; 7,4 42.44 148.76 2.59; tb; 1H, 7.3; 1.7 6.00; t; 1H; 11.3 29.69 22.68 2.0; m 1.9, m 31.57 37.86 2.23; m 1.91, m 135.63 136.27 121.22 125.0 5.12, tb, 1H, 7.6, 1.2 5.23; dd; 1H; 11.0, 5.30 33.49 37.52 2.05, d, 1H, 7.5 53 2.35; t; 2H; 8.0 40.16 39.46 10 155.48 160.71 5.97, d, 1H, 6.4 6.78; d; 1H; 6.2 11 127.18 126.19 5.86, d, 1H, 6.4 5.98; d; 1H; 6.2 12 1.00 8.18 1.25, s, 3H 1.09; s; 3H 13 14.08 11.76 1.25, s, 3H 1.23; s; 3H 14 29.43 24.19 1.80, s, 3H 1.67; s; 3H 15 26.18 24.40 1.60, s, 3H 1.54; s; 3H 16 42.44 37.52 2.35, m, 1H 17 16.29 22.68 1.11, d, 3H, 7.3 18 15.20 16.29 1.09, d, 3H, 7.3 3.3 Khảo sát hoạt tính chống ung thƣ 3-isopropylaminozerumbone Nhằm làm rõ hiệu hoạt tính chống ung thƣ: ung thƣ gan HepG2; ung thƣ phổi- Lu ung thƣ tim RD dẫn xuất 3-isopropylaminozerumbone so với zerumbone chúng tơi khảo sát hoạt tính chống ung thƣ hợp chất dòng ung thƣ kể Kết đƣợc thể bảng 3.6 Bảng 3.6: Khả gây độc tế bào 3-isopropylaminozerumbone Zerumbone Ký hiệu mẫu IC50 (g/mL) HepG2 Lu RD Zerumbone 0,31 1,00 0,36 3-isopropylamino-Zerumbone 2,23 >5 >5 Kết cho thấy hoạt tính chống ung thƣ dẫn xuất 3-isopropylaminozerumbone yếu nhiều so với Zerumbone dòng ung thƣ thử Điều cho thấy hệ thống liên kết đôi liên hợp với nhóm cacbonyl phân tử zerumbone bị giảm hoạt tính chống ung thƣ zerumbone dòng ung thƣ HepG2,Lu RD bị giảm 54 KẾT LUẬN Từ ba phƣơng pháp điều chế zerumbone tinh khiết sắc ký cột (CC), sắc ký lớp mỏng điều chế (PTLC), kết tinh phân đoạn (FCr), chúng tơi xây dựng đƣợc quy trình sản xuất Zerumbone chất lƣợng cao (>99,5%) từ thân rễ khô gừng gió vùng Tam Đảo đạt hiệu suất tốt phƣơng pháp kết tinh phân đoạn Đã chuyển hóa Zerumbon thành dẫn xuất 3-aminozerrumbone, 10aminozerumbone 3-isopropylamino zerumbone dẫn xuất 10aminozerumbone 3-isopropylamino zerumbone dẫn xuất Đã khảo sát hoạt tính chống ung thƣ dòng tế bào ung HepG2, Lu RD 3-isopropylaminozerrumbone tổng hợp đƣợc 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Báo cáo tổng kết đề tài QGTD0309-2006 tháng 2 Báo cáo kỉ niệm 45 năm thành lập Viện Dược liệu TW 9-5-200 Lê Trần Đức (1997), Cây thuốc việt nam Trồng hái chế biến trị bệnh ban đầu, tr 291-292, NXB nông nghiệp, Hà nội Võ văn Chi (1997), Từ điển thuốc Việt nam, tr 536, NXB Y học Võ Văn Chi, Dƣơng Đức Tiến (1987), Phân loại thực vật Thực vật bậc cao, tr 461-464, NXB Đại học Trung học chuyên nghiệp, Hà nội Trịnh Đình Chính (1995), Nghiên cứu thành phần hóa học tinh dầu số thuộc họ Gừng (Zingiberaceae) Việt nam, Luận án PTS Khoa học Hóa học, Trƣờng ĐH Sƣ phạm Hà nội I Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt nam, 3, tr 553, NXB Trẻ Hà Nội Đỗ Tất Lợi (2005), Những thuốc vị thuốc Việt nam, in lần thứ mƣời ba, tr 368- 369, NXB Y học Hà Nội Lã Đình Mỡi, Lƣu Đàm Củ, Trần Minh Hợi, Trần Huy Thái, Ninh Khắc Bản (2002), Tài nguyên thực vật có tinh dầu Việt nam, tập 2, tr 94-119, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội 10 Nguyễn Quang Thạch (2009), Cơ sở công nghệ sinh học tập 3, Công nghệ sinh học tế bào, trang 343-344, Nhà xuất giáo dục Việt Nam 11 Văn Ngọc Hƣớng, Đỗ Thị Thanh Thúy (2006), Gừng gió (Zingiber zerumbet Sm) vùng Tam Đảo, nguyên liệu quý cho điều chế Zerumbone, Tạp chí Khoa học cơng nghệ, tập 44, số 3, trang 65-69 TIẾNG ANH 12 A Hoffman, L M Spetner and M Burke (2002), “Redox-regulated mechanism may account for zerumbone’s ability to suppress cancer-cell proliferation”, Carcinogenesis 23 (11): 1961-1962 56 13 Abdul, A.B.H., A.S Al-Zubairi, N.D Tailan, S.I.A Wahab, Z.N.M Zain, S Ruslay and M.M Syam (2008), “Anticancer activity of natural compound (zerumbone) extracted from Zingiber zerumbet in human HeLa cervical cancer cells”, International Journal of Pharmacology 4, (3), 160 168 14 Ahmad Bustanmam Abdul (2009), US2009/0239953 15 Bokyung Sung, Sonia Jhurani, Kwang Seok Ahn, Yoichi Mastuo, Tingfang Yi, Sushovan Guha, Mingyao Liu, and Bharat B Aggarwal (2008), “Zerumbone Down-regulates Chemokine Receptor CXCR4 Expression Leading to Inhibition of CXCL12-Induced Invasion of Breast and Pancreatic Tumor Cells”, Cancer Res, 8938-8944 16 Buckingham J (1982), “Dictionary of Organic compounds”, New YorkLondon-Toronto, Chapman and Hall, 5, 5763 17 Dai.J.R., Cadellina II.J.H., Mc Mahon.J.B., and Boyd.M.R (1997), “Zerumbone, an HIV-inhibitory and cytotoxic sesquiterpene of Zingiber aromaticum and Z zerumbet”, Natl Prod Lett, 10, 115-118 18 Dae Sik Jang, Ah-Reum Han, Gowooni Park, Gil-Ja Jhon, Eun-Kyoung Seo (2004), “Flavonoids and aromatic compounds from the Rhizomes of Zingiber zerumbet”, Arch Pharm Res 27, (4), 386-389 19 Dai J.R et al (1997), Nat Prod Lett 10, 115-118 20 Dev S (1960), Tetrahedron 8, 171-180 21 Dung.N.X., chinh.T.D., Piet A.Leclereq (1995), “Chemical investigation of the acrial part of Zingiber zerumbet (L.) Sm from Vietnam”, Jour Essent Oil Res.(USA), (2), 153-157 22 Huang.G.C., Chien.T.Y., Chen.L.G., Wang.C.C (2005), “Antitumor effects of zerumbone from gingiber zerumbet in P-388D1 cells in vitro and in vivo”, Planta Med, 71 (3), 219-224 23 Kirana C, McIntosh GH, Record IR, Jones GP (2003), “Antitumor activity of extract of Zingiber aromaticum and its bioactive sesquiterpenoid zerumbone”, Nutr Cancer.45(2):218-25 57 24 Matthes.H.W.D., Luu.B., Ourisson.G (1980), “Cytotoxic components of Zingiber zerumbet, curcuma zedoaria and C domestica”, Phytochemistry, 19, 2643-2650 25 Masuda.T., Jitoe.A., Kato.S., Nakatani.N (1991), “Acetylated flavonol glycosides from Zingiber zerumbet”, Phytochemistry, 30, 2391-1392 26 M Golam KADER, M Rowshanul HABIB, Farjana NIKKON, Tanzima YEASMIN, Mohammad A RASHID, M Mukhlesur RAHMAN, Simon GIBBONS (2010), “Zederone from rhizomes of Zingiber zerumbet and staphylococus activity”, Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas, (1), 63 – 68 27 Mohamed Yousif Ibrahim , Ahmad Bustamam Hj Abdul, Tengku Azmi Tengku Ibrahim, Siddig Ibrahim AbdelWahab, Manal Mohamed Elhassan and Syam Mohan (2010), “Attenuation of cis platin- induced nephrotoxity in rats using Zerumbone”, African Journal of biotechnology Vol 9, 44344444 28 Murakami.A, Takahashi.M., Jiwajinda.S., Koshimizu.K., Ohigashi (1999), “Identification of zerumbon in Zingiber zerumbet Smith as Potent inhibitor of 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate induced Epstein-Barr virus activation”, Biosci Biotechnol Biochem, 63 (10), 1811-2 29 Murakami.A., Takahashi.D., Kinoshita.T., Koshimizu.K., Kim H.W., Yoshihiro.A., Kakamura.Y., Jiwajindo.S., Terao.J., Ohigashi.H (2002), “Zerumbone, a southeast Asian ginger sesquiterpene, markedly suppresses free radical generation, proinflammatory protein production, and cancer cell proliferation accompanied by apoptosis the alpha, beta-unsatureted carbonyl group is a prerequisite”, Carcinogenesis, 35 (5), 795-802 30 Nakamura.Y., Yoshida.C., Murakami.A., Ohigashi.H., Osawa.T., Uchida.K (2004), “Zerumbone, a tropical ginger sesquiterpene, activates phase II drug metabolizing enzymes”, FEBS Letters, 13, 572 (1-3), 245-250 58 31 N.P Damodaram and Sukh Dew (1965), “Stereochemistry of Zerumbone”, Tetrahedron Letters, 24, 1977-1981 32 Ozaki.Y., Kawahara.N., and Harada.M (1991), “Anti-inflammatory effect of Zingiber cassumunar.Roxb and its active principles”, Chem.Pharm Bull, 39, 2353-2356 33 Samir Kumar Sadhu, Amina Khatun, Takashi Ohtsuki, Masami Ishibashi (2007), “First isolation of sesquiterpenes and flavonoids from Zingiber spectabile and identification of Zerumbone as the major cell groth inhibitory component”, Natural product research, 21, (14), 1242-1247 34 Sal S.R et al (1981), Aust J Chem 34, 243-247 35 SA Sharifah Sakinah, S Tri Handayani and LP Azimahtol Hawariah (2007), “Zerumbone induced apoptosis in liver cancer cells via modulation of Bax/Bcl-2 ratio”, Cancer Cell International 7, 1186 36 Takahashi.S et al (2002), Japanese Journal of cancer and chemotherapy, 27, 70 37 Takashi Kitayama et al (2001), “ Chemistry of Zerumbone, part Regulation of Ring bond Cleavage and unique antibacterial activities of Zerumbone derivatives”, Biosci, Biotechnol Biochem 65, 2193-2199 38 Takashi Kitayama et al (2003), “ The chemistry of Zerumbone part Structural transformation of the dimethylamine derivatives”, Tetrahedron 59, 4857-4866 39 Takashi Kitayama et al (2002), “ The chemistry of Zerumbone IV Asymetric Synthesis of Zerumbol”, Journal of Molecular Catalysis 17, 75-79 40 Takashi Kitayama et al (2007), “ Synthesis of a novel inhibitor against MRSA and VRE: preparation from Zerumbone ring opening material showing histidine-kinase inhibition”, Bioorganic and Medicinal chemistry Letter 17, 1098-1101 41 Takada Y, Murakami A, Aggarwal BB (2005), “ Zerumbone abolishes NFkappaB and IkappaBalpha kinase activation leading to suppression of 59 antiapoptotic and metastatic gene expression, upregulation of apoptosis, and downregulation of invasion” 42 Uraiwan Songsiang et al (2010), “ Cytotoxicities against cholagiocarcinoma cell lines of Zerumbone derivatives”, European Journal of Medicinal Chemistry 45, 3794-3802 43 Vimala.S., Norhanom.A.W., Yada.M (1999), “ Anti-tumour promoter activity in Malaysian ginger rhizobia used in traditional medicine”, British Journal of cancer, 80, 110-116 60 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Phổ UPLC- MS zerumbone Phụ lục 2: Phổ khối lƣợng- MS Zerumbone Phụ lục 3: Phổ IR Zerumbone Phụ lục 4: Phổ 1H- NMR zerumbon Phụ lục 5: Phổ 13C-NMR zerumbon Phụ lục 6: Phổ 2D NMR DEPT zerumbone Phụ lục 7: Phổ 2D NMR COSY zerumbone Phụ lục 8: Phổ 2D NMR_HSQC zerumbone Phụ lục 9: Phổ 2D NMR_HMBC zerumbone Phụ lục 10: Phổ IR ZerNH2 Phụ lục 11: Phổ MS ZerNH2 Phụ lục 12: Phổ 1H-NMR ZerNH2 Phụ lục 13: Phổ 13C NMR ZerNH2(A+B) Phụ lục 14: Phổ 2D NMR_DEPT ZerNH2 (A+B) Phụ lục 15: Phổ 2D NMR_ COSY ZerNH2 (A+B) Phụ lục 16: Phổ 2D NMR_HMBC ZerNH2 (A+B) Phụ lục 17: Phổ 2D NMR_HSQC ZerNH2 (A+B) Phụ lục 18: Phổ 2D NMR_ NOESY ZerNH2 (A+B) Phụ lục 19: Phổ IR chất Amino-Zer Phụ lục 20: Phổ MS1 chất Amino-Zer Phụ lục 21: Phổ MS2 chất Amino-Zer Phụ lục 22: Phổ 1H-NMR chất Amino-Zer Phụ lục 23: Phổ 13C- NMR chất Amino-Zer Phụ lục 24: Phổ 2D NMR_DEPT chất Amino-Zer Phụ lục 25: Phổ 2D NMR_COSY chất Amino-Zer Phụ lục 26: Phổ 2D NMR_HMBC chất Amino-Zer Phụ lục 27: Phổ 2D NMR_HSQC chất Amino-Zer 61 62 ... lƣợng Zerumbone củ Gừng gió (Zingiber zerumbet Sm) cao nhất[5] Vì vậy, ngƣời ta nghiên cứu phân lập Zerumbone chủ yếu từ củ Gừng gió Cho đến nay, có phƣơng pháp phân lập Zerumbone từ củ Gừng gió. .. zerumbone thành chất khác nhằm tạo đƣợc hợp chất có hoạt tính sinh học phục vụ cho ngành y dƣợc Đấy lí mà chúng tơi chọn đề tài:“ Nghiên cứu phương pháp phân lập zerumbone có chất lượng cao từ. .. bột có cỡ hạt 2mm bảo quản nơi khô Theo cách từ 7kg thân rễ gừng gió tƣơi thu đƣợc 1kg bột thân rễ gừng gió hiệu suất 14,28% 2.3.1.2 Điều chế cặn chiết không phân cực 1kg bột thân rễ gừng gió