Pemphigus là nhóm bệnh da bọng nước tự miễn mắc phải, đặc trưng bằng sự xuất hiện bọng nước ở trên da và niêm mạc, gây nên bởi hiện tượng ly gai. Desmoglein 1 và 3 là hai kháng nguyên chính trong cơ chế bệnh sinh của bệnh. Bài viết này nhằm xác định giá trị của hai kháng thể trong chẩn đoán, phân thể, theo dõi và tiên lượng bệnh Pemphigus.
NGHIÊN CỨU KHOA HỌC GIÁ TRỊ KHÁNG THỂ DESMOGLEIN VÀ TRONG CHẨN ĐOÁN, THEO DÕI, TIÊN LƯỢNG BỆNH PEMPHIGUS Trần Thị Vân Anh*, Phạm Đăng Khoa* TÓM TẮT Đặt vấn đề: Pemphigus nhóm bệnh da bọng nước tự miễn mắc phải, đặc trưng xuất bọng nước da niêm mạc, gây nên tượng ly gai Desmoglein hai kháng nguyên chế bệnh sinh bệnh Nghiên cứu nhằm xác định giá trị hai kháng thể chẩn đoán, phân thể, theo dõi tiên lượng bệnh Pemphigus Đối tượng phương pháp nghiên cứu: Bốn mươi bệnh nhân Pemphigus điều trị nội trú bệnh viện Da liễu Trung ương, chẩn đốn xác định kết mơ bệnh học miễn dịch huỳnh quang trực tiếp, lấy mẫu huyết làm xét nghiệm ELISA trước sau điều trị tháng Kết quả: Tỷ lệ dương tính Dsg nhóm Pemphigus da mỡ 100%, nhóm Pemphigus thơng thường 83,3% Tỷ lệ dương tính với Dsg3 nhóm Pemphigus thơng thường 80,6% Ở nhóm Pemphigus da mỡ có Dsg1 dương tính Ở nhóm Pemphigus thơng thường có tổn thương niêm mạc có Dsg dương tính, tổn thương da niêm mạc Dsg dương tính Tỷ lệ dương tính Dsg tăng theo mức độ tổn thương da, Dsg tăng theo mức độ tổn thương niêm mạc với p < 0,05 Kết luận: Kỹ thuật ELISA phát kháng thể Desmoglein bệnh Pemphigus có giá trị cao chẩn đoán, phân thể theo dõi bệnh Pemphigus Từ khóa: Pemphigus, Desmoglein 1, Desmoglein 3, ELISA I ĐẶT VẤN ĐỀ Pemphigus bệnh da bọng nước tự miễn mắc phải, đặc trưng xuất bọng nước có chế bệnh sinh tương đối phức tạp, liên quan đến nhiều yếu tố có nhiều nghiên cứu kháng thể chế bệnh sinh da niêm mạc, gây nên tượng ly bệnh kháng thể kháng lại phân tử Desmoglien gai (Acantholysis) [1], [2], [3], [4], [5] Bệnh tương 1, Desmoglein (Dsg 3) kháng nguyên đối gặp, phân bố khắp nơi giới, có bệnh Pemphigus thể thông thường khác rõ rệt tỷ lệ mắc tùy theo vùng, Desmoglein (Dsg 1) kháng ngun thể nhóm Pemphigus [3], [1], [6] Bệnh Pemphigus vảy (P.Foliaceus) Kỹ thuật ELISA (enzyme-linked Bệnh viện Da liễu Trung ương Phản biện khoa học: PGS.TS Đặng Văn Em * immunosorbent assay) định lượng kỹ thuật xác định nồng độ tự kháng thể kháng Desmoglein Số 18 (Tháng 01/2015) DA LIỄU HỌC 41 NGHIÊN CỨU KHOA HỌC huyết bệnh nhân Pemphigus nhằm chẩn đoán sớm phân thể, theo dõi điều trị tiên lượng bệnh Trên giới có nhiều nghiên cứu cho thấy kỹ thuật có độ nhạy độ đặc hiệu cao mối liên quan nồng độ kháng thể mức độ hoạt động bệnh xác định [7], [8], [9], [10], [11], [12],[13] II ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Các bệnh nhân chẩn đoán Pemphigus dựa vào biểu lâm sàng điển hình, dấu hiệu Nikolsky dương tính, xét nghiệm tế bào Tzanck có tế bào gai lệch hình, hình ảnh mơ bệnh học có bọng nước thượng bì kèm theo tượng ly gai MDHQTT thấy lắng đọng IgG C3 khoảng gian bào Bệnh nhân điều trị nội trú bệnh viện Da liễu Trung ương từ tháng 3/2013 đến tháng 6/2014, có thời gian nằm viện từ tháng trở nên chưa điều trị thuốc ức chế miễn dịch trước Nghiên cứu thơng qua hội đồng đạo đức Bệnh viện Da liễu Trung ương đồng ý bệnh nhân Mẫu huyết lấy bệnh viện bảo quản tủ âm sâu (-700 C), kỹ thuật ELISA thực môn miễn dịch sinh lý bệnh trường Đại Học Y Hà Nội - Bước 4: Rửa dung dịch rửa lần - Bước 5: Thêm 100 µl dung dịch chất màu (substrate) vào giếng, ủ nhiệt độ phòng 30 phút - Bước 6: Thêm 100 µl dung dịch để dừng phản ứng - Bước 7: đọc kết vòng 20 phút độ hấp phụ 450nm Kết xác định dương tính Dsg ≥20, Dsg 1≥ 20, nghi ngờ Dsg = -20, Dsg = 14-20, âm tính Dsg ≤ 7, Dsg ≤ 14 Phân tích số liệu: Số liệu phân tích phần mềm SPSS 16.0, tỷ lệ so sánh T- test III KẾT QUẢ Đặc điểm đối tượng nghiên cứu Bảng Một số đặc điểm nhóm bệnh nhân làm xét nghiệm ELISA Thể bệnh n % Tuổi TB P thông thường 36 90 49,6 ± 12,7 P da mỡ 10 33,5 ± 14,8 Nam 12 30 40,1 ± 9,0 Nữ 28 70 51,3 ± 14,0 Tổng 40 100 48,0 ± 13,6 Phương pháp nghiên cứu: Mô tả cắt ngang, tiến cứu Các bước tiến hành kỹ thuật ELISA: - Bước 1: Hút 100 µl dung dịch chuẩn 1, dung dịch chuẩn 100 µl mẫu huyết pha loãng vào giếng tương ứng Đậy phiến kính ủ nhiệt độ phịng 60 phút - Bước 2: rửa dung dịch rửa lần - Bước 3: Cho 100 µl dung dịch Conjugate vào giếng, đậy phiến kính ủ nhiệt độ phòng 60 phút 42 DA LIỄU HỌC Số 18 (Tháng 01/2015) Bảng Phân bố kiểu hình tổn thương Kiểu hình n % Da đơn 14 35 Niêm mạc đơn 2,5 Cả da niêm mạc 25 62,5 Tổng 40 100 NGHIÊN CỨU KHOA HỌC Bảng Phân bố mức độ nặng tổn thương Mức độ TT Da (%) Niêm mạc (%) Khơng có 2,5 35 Nhẹ 12,5 32,5 Trung bình 57,5 32,5 Nặng 27,5 Tổng 100 100 Kỹ thuật ELISA xác định Dsg1, Dsg có giá trị cao chẩn đốn bệnh Pemphigus Bảng Tỷ lệ dương tính kháng thể thể bệnh P thông thường Thể bệnh Dsg Dsg P da mỡ Tỷ lệ chung n % n % n % Dương tính 30 83,3 100 34 85 Âm tính 16.7 0 15 Dương tính 29 80,6 50 31 77.5 Âm tính 19,4 50 22,5 36 100 100 40 100 Tổng Bảng Tỷ lệ phát kháng thể theo kiểu hình Dsg1 Dương tính Kiểu hình Dsg3 Dương tính Tổng n % n % Da đơn 13 92,1 50 14 Niêm mạc đơn 0 100 Da niêm mạc 21 84 23 92 25 Giá trị Dsg theo dõi bệnh Pemphigus Bảng Tỷ lệ phát kháng thể theo mức độ tổn thương da Mức độ tổn thương da Dsg1 Dương tính Dsg3 Dương tính Tổng n % n % n % Khơng có 0 100 100 Nhẹ 60 80 100 Trung Bình 20 87 16 69,6 23 100 Nặng 11 100 10 90,9 11 100 Số 18 (Tháng 01/2015) DA LIỄU HỌC 43 NGHIÊN CỨU KHOA HỌC Bảng Tỷ lệ Dsg theo mức độ tổn thương niêm mạc Mức độ tổn thương niêm mạc Khơng có Nhẹ Trung Bình p Dsg1 Dương tính n % 13 92.9 11 84,6 10 76,9 p > 0,05 IV BÀN LUẬN Đặc điểm đối tượng nghiên cứu Theo bảng 1, 3, thời gian nghiên cứu có tất 40 bệnh nhân đủ tiêu chuẩn làm xét nghiệm ELISA, số bệnh nhân Pemphigus thơng thường chiếm tỷ lệ cao 90% có bệnh nhân Pemphigus da mỡ chiếm 10% Có 12 bệnh nhân nam chiếm tỷ lệ 30% 28 bệnh nhân nữ chiếm tỷ lệ 70% Tuổi trung bình nhóm nghiên cứu 48,0 ± 13,6 tuổi; tuổi thấp 15 tuổi, cao 80 tuổi Tuổi trung bình nam nữ khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê Mức độ tổn thương phân bố khác da niêm mạc, tổn thương da mức độ nhẹ 12,5%; mức độ trung bình 57,5%; mức độ nặng 27,5% 2,5% bệnh nhân khơng có TT da Số BN khơng có tổn thương niêm mạc 35%; tổn thương mức độ nhẹ trung bình 32,5% tương ứng Về kiểu hình tổn thương số 40 bệnh nhân, có 14 bệnh nhân có tổn thương da chiếm 35%; bệnh nhân có tổn thương niêm mạc đơn chiếm 2,5% 62,5% bệnh nhân có biểu da niêm mạc Giá trị Dsg chẩn đoán, phân thể bệnh Pemphigus Theo kết từ bảng bảng cho thấy tỷ lệ phát thấy kháng thể Desmoglein huyết BN Pemphigus cao Tỷ lệ phát thấy kháng thể Dsg1 85% tỷ lệ phát thấy Dsg 77,5% Tỷ lệ dương tính với Dsg nhóm bệnh nhân Pemphigus da mỡ 100%, nhóm Pemphigus thơng thường 83,3%; tỷ lệ dương tính với Dsg nhóm bệnh nhân Pemphigus 44 DA LIỄU HỌC Số 18 (Tháng 01/2015) Dsg3 Dương tính n % 50 11 84,6 13 100 p < 0,05 Tổng n 14 13 13 % 100 100 100 thông thường 80,6%, nhóm Pemphigus da mỡ 50% Hiện Việt Nam chưa có nghiên cứu dùng kỹ thuật ELISA để xác định nồng độ Dsg máu bệnh nhân Pemphigus chúng tơi chưa thể so sánh Nhưng kết tương tự kết nghiên cứu tác giả giới Trong nghiên cứu Amagai cộng (1999) sử dụng kỹ thuật ELISA cho kết 97,9% huyết bệnh nhân Pemphigus da mỡ dương tính với Dsg 97,5% huyết bệnh nhân Pemphigus thơng thường dương tính với Dsg [14] Nghiên cứu Harman cộng (2000) cho thấy độ nhạy kỹ thuật ELISA chẩn đoán Pemphigus 98% bệnh nhân chưa điều trị độ nhạy 100%; nghiên cứu Daneshpazhooh cộng (2007) thấy tỷ lệ dương tính với Dsg1 76,1%; với Dsg 94,5%; nghiên cứu Kumar (2006) thấy dương tính với Dsg Pemphigus da mỡ 83,3%; Pemphigus thông thường 60,52%, Dsg3 Pemphigus thông thường 81,57%; Pemphigus da mỡ 16,6% [9], [10, 12] Trong nhiều nghiên cứu khác cho thấy tỷ lệ dương tính với Dsg thường cao hơn, từ 80 đến 100% tùy tác giả Từ điều thấy kỹ thuật ELISA phát Dsg kỹ thuật xét nghiệm đơn giản có giá trị cao chẩn đốn bệnh, đồng thời rút ngắn thời gian chẩn đoán thực lúc với số lượng mẫu lớn Ngoài kết cho thấy với bệnh nhân có tổn thương niêm mạc có Dsg dương tính, Dsg âm tính, cịn bệnh nhân có tổn thương da đơn có Dsg dương tính.Vì có giá trị chẩn đốn phân thể bệnh Pemphigus Pemphigus NGHIÊN CỨU KHOA HỌC da mỡ thường có tổn thương da nên có Dsg dương tính, Dsg âm tính; cịn Pemphigus thơng thường dương tính với Dsg3 tổn thương ưu niêm mạc, trường hợp nặng có tổn thương da niêm mạc dương tính với hai loại kháng thể Giá trị Dsg theo dõi bệnh Pemphigus Theo bảng 3.6 cho thấy tỷ lệ dương tính với Dsg tăng dần theo mức độ tổn thương da nhóm khơng có tổn thương da 0% tăng lên 60% nhóm TT mức độ nhẹ, nhóm TT mức độ trung bình 87% mức độ nặng 100%, khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 Cịn tỷ lệ dương tính Dsg thay đổi theo mức độ tổn thương da khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê với p > 0,05 Ở bảng cho kết tỷ lệ dương tính Dsg tăng dần theo mức độ tổn thương niêm mạc từ 50% nhóm khơng có tổn thương tới 84,6% nhóm tổn thương mức độ nhẹ 100% nhóm tổn thương nặng Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 Tỷ lệ Dsg thay đổi theo mức độ tổn thương niêm mạc khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê với p > 0,05 Kết tương tự nghiên cứu giới tức tỷ lệ dương tính Dsg liên quan tới mức độ tổn thương da tỷ lệ dương tính Dsg liên quan tới mức độ tổn thương niêm mạc Trong nghiên cứu Mortazavi cộng (2009) cho thấy nhóm khơng có tổn thương da tỷ lệ dương tính với Dsg 0% ơng đưa kết luận là: mức độ tổn thương da tăng cách có ý nghĩa với nồng độ Dsg 1, không thấy mối liên quan nồng độ Dsg với tổn thương da; có mối liên quan mức độ tổn thương niêm mạc với nồng độ Dsg không liên quan với nồng độ Dsg [15] Nghiên cứu Harman (2001), Kumar (2006), Bracke (2013) cho kết luận có mối liên quan Dsg với mức độ tổn thương da Dsg với mức độ tổn thương niêm mạc [10], [13], [16] Điều thể rõ nội dung thuyết bù trừ phân bố Dsg bệnh Pemphigus Vì Dsg phân bố chủ yếu da nên có tổn thương da nặng nồng độ Dsg cao tỷ lệ phát cao hơn, Dsg phân bố chủ yếu niêm mạc nên có tổn thương niêm mạc nồng độ Dsg cao Bệnh nhân Pemphigus thơng thường có tổn thương da niêm mạc nên tỷ lệ phát thấy hai kháng thể 65% tổn thương lâm sàng thường nặng KẾT LUẬN Qua nghiên cứu 40 bệnh nhân Pemphigus làm xét nghiệm ELISA thu kết sau: - Về chẩn đoán: Tỷ lệ dương tính Dsg bệnh nhân Pemphigus cao Tỷ lệ dương tính với Dsg nhóm Pemphigus da mỡ 100%, Tỷ lệ dương tính với Dsg3 nhóm Pemphigus thơng thường 80,6% - Phân thể: Ở thể Pemphigus da mỡ có Dsg1 dương tính Ở Pemphigusthơng thường, có TT niêm mạc có Dsg dương tính, tổn thương da niêm mạc Dsg dương tính - Theo dõi tiên lượng: Tỷ lệ dương tính Dsg tăng theo mức độ tổn thương da, Dsg tăng theo mức độ tổn thương niêm mạc với p < 0,05 TÀI LIỆU THAM KHẢO Kanwar, A.J and D De, Pemphigus in India India Journal of Dermatology, Venereology and Leprology, 2011 77(4): p 439-449 Schmidt, Brocker, and Zillikens, Pemphigus Loss of desmosomal cell–cell contact Zeitschrift Dermatol Venerologie verwandte Gebiete 2000 59: p 309-318 Stanley, J.R., Pemphigus Fitzpatrick’s Dermatology in General Medicine, 7th Edition., 2008(52): p 459-468 Lanza, A., et al., How does acantholysis occur in pemphigus vulgaris: a critical review J Cutan Pathol, 2006 33(6): p 401-12 S.C.Huilgol and M.M.Black, Management Số 18 (Tháng 01/2015) DA LIỄU HỌC 45 NGHIÊN CỨU KHOA HỌC of the immunobullous disorder, part II Pemphigus Clinical and Experimental Dermatology 1995 20: p 283-293 Schmidt, E and D Zillikens, The diagnosis and treatment of autoimmune blisting skin disease Deutches Arzteblatt International, 2011 108(23): p 399- 405 Zone, J.J., The value of desmoglein and antibody ELISA testing in patients with pemphigus Arch Dermatol, 2009 145(5): p 585-7 Abasq, C., et al., ELISA testing of antidesmoglein and antibodies in the management of pemphigus Arch Dermatol, 2009 145(5): p 529-35 K.E.Harman and M.J Gratian, Diagnosis of pemphigus by ELISA: a critical evaluation of two ELISAs for the detection of antibodies to the major pemphigus antigen, desmoglein1 and Clinical and Experimental Dermatology, 2000 25: p 236-240 10 Kumar, B., S Arora, and M.s Kumaran, Study of desmoglein and antibody levels in relation to disease severity in Indian patients with pemphigus India Journal of Dermatology, Venereology and Leprology, 2006 72(3): p 203-206 11 Chan, W., The use of ELISA in pemphigus H.K Dermatol Venereol Bull, 2005 13 12 Daneshpazhooh, M., et al., Desmoglein and enzyme-linked immunosorbent assay in Iranian patients with pemphigus vulgaris: correlation with phenotype, severity, and disease activity Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology, 2007 21(10): p 1319-1324 13 K.E.Harman, P.T.Seed, and M.M.Black, The severity of cutaneous and oral pemphigus is related to desmoglein ang antibody levels British Association of Dermatologist, 2001 144: p 775-780 14 Amagai.M, Ishii.K, and Characterization of autoantibodies in pemphigus using antigen specipic enzym linked immunosorbent assays with baculovirus expressed recominant desmoglein J Immunol, 1997 159: p 2010-2017 15 Mortazavi, H., et al., Desmoglein ELISA in the diagnosis of pemphigus and its correlation with the severity of pemphigus vulgaris Iran J Allergy Asthma Immunol, 2009 8(1): p 53-6 16 Bracke, S., et al., Evaluation of commercially available ELISA assays as a tool for monitoring and managing pemphigus patients: a prospective study Eur J Dermatol, 2013 23(1): p 33-9 SUMMARY Background: Pemphigus is a group of acquired autoimmune bullous skin diseases, characterized by the appearance of flaccid blisters on the skin and mucous membranes, caused by acantholysis phenomenom Desmoglein 1(DSG1) and Desmoglein 3( DSG3) are two major antigens in the pathogenesis of the disease This study aimed to assess the value of the two antibodies (DSG1and DSG3) in the diagnosis, classification, monitoring and prognosis of the disease Subjects and Methods: Forty pemphigus patients at the National Hospital of Dermatology and Venereology were diagnosed by cliniclal features, Tzanck smear, histopathology and direct immunofluorescence Their serum samples were taken before and month after the treatment, enzymelinked immunosorbent assays (ELISA test) were used to detect IgG autoantibodies reactive with the ectodomain of DSG1 and Dsg3 Results: Anti-DSG1 and anti-DSG3 were detected in 85% and 77.5% patients, respectively 100% of anti-DSG1 in pemphigus folliaceus was possitive This number in pemphigus vulgaris was 83.3% AntiDSG positive in pemphigus vulgaris was 80.6% and no folliaceus pemphigus patients positive with DSG3 The ratio of positive anti-DSG1 increases with the severity of the skin lesions, the ratio of positive anti-DSG3 increases with the level of mucosal lesions with p