Nghiên cứu tác động ức chế hmg coa reductase của chalcon và một số dẫn chất

.1 _ BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NGHIÊN CỨU TÁC ĐỘNG ỨC CHẾ HMG-COA REDUCTASE CỦA CHALCON VÀ MỘT SỐ DẪN CHẤT Cơ quan chủ trì nhiệm vụ (Khoa, Trung tâm, …): Khoa Dược Chủ trì nhiệm vụ: PGS.TS Trần Mạnh Hùng _ Đặt vấn đề .2 _ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ NGHIÊN CỨU TÁC ĐỘNG ỨC CHẾ HMG-COA REDUCTASE CỦA CHALCON VÀ MỘT SỐ DẪN CHẤT (Đã chỉnh sửa theo kết luận Hội đồng nghiệm thu ngày ) Cơ quan chủ quản Chủ trì nhiệm vụ (ký tên đóng dấu) (ký tên) PGS.TS Trần Mạnh Hùng Cơ quan chủ trì nhiệm vụ (ký tên đóng dấu) _ Đặt vấn đề .3 _ ĐẶT VẤN ĐỀ Rối loạn lipid máu yếu tố khởi đầu cho trình hình thành phát triển xơ vữa động mạch bệnh động mạch vành Khi có gia tăng LDL-C, LDL có hội vào lớp nội mạch thành mạch, LDL bị oxy hóa bị tế bào bạch cầu đơn nhân thực bào để tạo tế bào bọt, khởi đầu cho hình thành mảng xơ vữa thành động mạch [9] Tăng LDL-C xác định yếu tố nguy bệnh mạch vành Mặc dù có tiến chẩn đốn điều trị, bệnh nguyên nhân gây tử vong hàng đầu nước phát triển (khoảng 36% ca tử vong năm 2004 Hoa Kỳ) Các thử nghiệm lâm sàng quy mô lớn cho thấy ức chế HMG-CoA reductase (HMGR) làm giảm LDL-C, giảm 29% nguy đột quỵ 22% tỷ lệ tử vong chung Nhóm statin nhóm ức chế HMGR hiệu [9] Flavonoid nhóm hợp chất lớn thường gặp thực vật với 4000 chất xác định cấu trúc Nhiều nghiên cứu tác dụng nhóm flavonoid chứng minh hoạt tính kháng khuẩn, kháng virus, kháng viêm, kháng ung thư, tác dụng chống oxy hóa giảm nguy tim mạch…Chalcon flavonoid phân bố rộng rãi thực vật chứng minh có nhiều hoạt tính sinh học như: chống oxy hóa, kháng viêm, kháng khuẩn… Mục tiêu nghiên cứu sâu vào đích tác động ức chế HMG-CoA reductase dẫn xuất chalcon điều trị bệnh rối loạn lipid máu nhằm mở liệu pháp bên cạnh statin sau [4]: - Sử dụng mô hình docking enzym HMG – CoA reductase để đánh giá giải thích mơ hình in vitro - Đánh giá hoạt tính ức chế enzym HMG – CoA reductasein vitro dẫn chất chalcon tổng hợp - Đánh giá hoạt tính ức chế enzym HMG – CoA reductase in vivo dẫn chất chalcon có IC50 thấp thử nghiệm in vitro _ Đặt vấn đề .4 _ CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 RỐI LOẠN LIPID MÁU 1.1.1 Quá trình tổng hợp cholesterol thể Sinh tổng hợp cholesterol đường sinh hóa nghiên cứu nhiều Cholesterol đóng vai trị thiết yếu tổng hợp acid mật nhiều chức quan trọng khác Lượng cholesterol tăng mức nguy nhiều bệnh lý nghiêm trọng chí dẫn đến tử vong, đặc biệt xơ vữa động mạch, dẫn đến nhồi máu tim hay đột quỵ [17] Cholesterol tổng hợp từ đơn vị acetyl-CoA qua phản ứng kết hợp hóa vịng Q trình tổng hợp cholesterol gồm giai đoạn: - Tổng hợp acid mevalonic từ acetyl CoA - Tạo squalen - Biến đổi squalen thành cholesterol [20] 1.1.2 Nguyên nhân gây rối loạn lipid huyết – Tăng lipid huyết nguyên phát: thường đột biến gen mã hóa apolipoprotein hay LDL receptor Biểu đột biến LDL-C huyết tăng cao kèm theo biểu viêm u vàng, xơ vữa động mạch [1] – Tăng lipid huyết thứ phát: loại tăng lipid huyết hậu số bệnh đái tháo đường, bệnh gan, suy thận mạn, nhược giáp sử dụng lâu dài số thuốc ảnh hưởng đến chuyển hóa lipid thuốc lợi tiểu, βblocker, thuốc tránh thai,…[1] _ Tổng quan tài liệu .5 _ Sơ đồ 1.1 Sơ đồ tổng hợp cholesterol thể 1.1.3 Các biến chứng rối loạn lipid máu Sự gia tăng nồng độ cholesterol triglycerid máu, gia tăng LDL-C yếu tố nguy gây nên bệnh tim mạch Một biến chứng nguy hiểm bệnh tim mạch bệnh thiếu máu tim cục bộ, cung cấp máu cho tim giảm động mạch vành bị xơ vữa làm tắc nghẽn dần mạch máu, gây tổn thương thành mạch dẫn đến tượng huyết khối-tắc mạch [16] _ Tổng quan tài liệu .6 _ Các nghiên cứu cho thấy LDL-C yếu tố gây nên xơ vữa động mạch LDL-C chứa nhiều cholesterol kích thước LDL-C đủ nhỏ để thấm qua lớp tế bào nội mơ, gây tích tụ lipid thành mạch Trong VLDL-C chylomicron có kích thước q lớn nên khó vượt qua lớp tế bào nội mô động mạch [1] Xơ vữa động mạch gây biến chứng nhồi máu tim, đột quỵ bệnh mạch máu ngoại biên, nguyên nhân gây tử vong cao cho bệnh nhân tim mạch 1.2 HMG-COA REDUCTASE 1.2.1 Giới thiệu enzym HMG-CoA reductase (3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA reductase HMGR) (EC 1.1.1.34) enzym tham gia vào trình tổng hợp cholesterol thể, kiểm soát đường trao đổi chất tạo cholesterol từ acetyl-CoA HMG-CoA reductase phân hủy HMG-CoA để tạo mevalonat CoA phản ứng phụ thuộc NADPH Enzym đích tác động nhóm statin Sự ức chế HMG-CoA reductase làm tăng biểu LDL receptor gan, làm giảm nồng độ cholesterol máu [21] 1.2.2 Cấu trúc HMG-CoA reductase Dựa liên kết chuỗi, HMGR phân loại thành hai loại: enzym loại I giống với HMGR người sử dụng NADPH để cung cấp điện tử, enzym loại II tìm thấy chủ yếu Eubacteria sử dụng NADH Yếu tố phân biệt hai loại HMGR “cis-loop”, tính bảo tồn nghiêm ngặt HMGR loại I tương ứng với axit amin 682-694 HMGR người [10] HMGR người có vùng chính: xúc tác, liên kết vùng neo [21] HMG-CoA reductase glycoprotein đặc biệt có cấu trúc bậc 2, diện màng lưới nội chất tế bào, gồm phần: đầu -NH2 kị nước bề mặt _ Tổng quan tài liệu .7 _ màng, phần xuyên màng phần đầu -COOH thân nước nằm bào tương Phần protein bề mặt xuyên màng cần cho nhận diện gắn với cấu trúc sterol, trung tâm hoạt động HMG-CoA reductase nhóm carboxyl vị trí tận vùng thân nước [19] Hình 1.1 Cấu trúc HMG-CoA reductase 1.2.3 Tác động xúc tác HMG-CoA reductase Tác động xúc tác HMGR thể việc xúc tác phản ứng chuyển HMGCoA thành mevalonat đồng thời sử dụng phân tử NADPH Thông thường tế bào động vật có vú HMGR bị ức chế cholesterol có nguồn gốc ngoại sinh sản phẩm thối hóa lipoprotein tỉ trọng thấp (LDL) thông qua LDL receptor Các chất ức chế cạnh tranh enzym làm giảm biểu LDL receptor gan, làm tăng thối biến LDL-C huyết _ Tổng quan tài liệu .8 _ tương làm giảm nồng độ cholesterol huyết tương, yếu tố quan trọng xơ vữa động mạch [21] 1.3 CHALCON 1.3.1 Giới thiệu chalcon Chalcon ceton thơm với công thức phân tử C15H12O Các chất tinh khiết có dạng tinh thể màu vàng nhạt, tan nước Chalcon sản phẩm tự nhiên thuộc nhóm flavonoid, chất trung gian qua trình tổng hợp flavonoid Chalcon phổ biến thực vật có nhiều hoạt tính sinh học Dẫn xuất chalcon từ thiên nhiên có nhiều tác dụng dược lý kháng khuẩn, kháng khối u, chống ung thư ức chế topoisomerase I Tuy nhiên, việc chiết xuất chalcon từ thiên nhiên cần quy trình dài phức tạp với hiệu suất thấp, thường tổng hợp hay bán tổng hợp [22] Chalcon (hình 1.2) hay 1,3-diaryl-2-propen-1-on có vịng A B nối với mạch hở cacbon Hầu hết chalcon tìm thấy tự nhiên có vịng A B nhân benzen Trong thập kỉ gần nhiều tác giả tổng hợp chalcon với vòng A và/hoặc B nhân thơm dị vòng cạnh, hợp chất gọi heterocyclic chalcon (chalcon dị vịng) [15] Hình 1.2 Cấu trúc chalcon thơng thường số chalcon dị vịng _ Tổng quan tài liệu .9 _ 1.3.2 Tác dụng dược lý Tác động kháng viêm: chế kháng viêm flavon dẫn chất flavon (chalcon) ức chế tự sản xuất PD xúc tác COX-2 làm giảm tiền chất gây viêm – cytokin [23] Tác động giảm đau: số chalcon chiết tách từ Myracrodruon unrundeuva allemao cho thấy tác dụng giảm đau ngoại biên, ức chế đau bụng co thắt thực nghiệm gây acid acetic chuột [24] Tác động kháng ung thư: chalcon có tác động độc với tế bào, kháng phân bào có lực với tế bào ung thư nên nhóm pyrrolobenzodiazepin-chalcon sử dụng điều trị ung thư [5], [7] Tác dụng kháng nấm, kí sinh trùng, vi khuẩn: chalcon cho thấy tác dụng kháng P falciparum in vitro Các dẫn xuất clo-2,4,6-triazolchalcon cho thấy hiệu cao ức chế phát triển P falciparum Trong điều trị bệnh sốt rét P falciparum, liệu pháp kết hợp sử dụng dẫn chất azol chalcon tổng hợp với artemisinin cho thấy tác dụng hợp lực in vitro, đồng thời làm giảm hình thành thể hemozoin tế bào bị kí sinh [15] Tác dụng hạ glucose huyết: dẫn xuất sulfamid chalcon hợp chất nonsaccarid có tác dụng ức chế alpha-glucosidase, đích tác động điều trị đái tháo đường type II Hai dẫn xuất 4-hydroxyderricin xanthoangelol chiết xuất từ Angelica keiskei cho thấy hoạt tính giống insulin, kích hoạt PPARα [14] Tác dụng chống oxy hóa chống kết tập tiểu cầu: chalcon cho thấy tác động ổn định thành mạch, giãn mạch, chống oxy hóa chống kết tập tiểu cầu bệnh hệ tim mạch [18] _ Tổng quan tài liệu 10 _ 1.4 MƠ HÌNH DOCKING 1.4.1 Tổng quan sàng lọc ảo thiết kế thuốc Nghiên cứu gắn kết phân tử nhỏ với đích tác động tiến hành phương pháp in silico hay phương pháp sàng lọc ảo số lượng lớn hợp chất để chọn nhóm chất có khả gắn kết tốt với đích tác động Các hợp chất sàng lọc hợp chất nghiên cứu, chất thương mại hóa hay từ thư viện cơng thức tự xây dựng Nếu có cấu trúc ba chiều (3D) hay mơ hình đích kỹ thuật hay dùng sàng lọc ảo dựa vào cấu trúc Kỹ thuật gọi “docking”, sử dụng mơ hình máy tính để gắn kết phân tử nhỏ lên đích tác động (hay vào phần cấu trúc chọn, ví dụ vùng hoạt động enzym) theo nhiều vị trí, cấu dạng phương hướng khác Mỗi mơ hình docking gọi “pose” Nhằm xác định lượng thuận lợi nhất, pose chấm điểm dựa vào tương tác với mục tiêu hình dạng, tính tĩnh điện Một phân tử có điểm số docking tốt tạo gắn kết hiệu với đích tác động Quá trình áp dụng cho tất hợp chất sở liệu xếp hạng dựa vào điểm số Sau đó, danh sách đánh giá để lựa chọn công thức tổng hợp thử hoạt tính mơ hình in vitro Đánh giá pose điểm số gắn kết xác việc lựa chọn phân tử có hoạt tính đạt xác suất cao so với chọn lựa ngẫu nhiên [12], [13] 1.4.2 Docking 1.4.2.1 Yêu cầu thực docking Để thực sàng lọc dựa vào cấu trúc mục tiêu, cần thiết phải có cấu trúc receptor quan tâm Hầu hết cấu trúc phổ biến receptor xác định kỹ thuật thực nghiệm nhiễu xạ tinh thể tia X hay phổ cộng hưởng từ hạt nhân Đối với protein, sử dụng cấu trúc sẵn có _ Tổng quan tài liệu 27 _ định hướng cấu trúc có nhiều nhóm thân nước tạo nhiều liên kết hydro dự đoán có hoạt tính cao enzym 2D 3D Hình 3.3 Tương tác Ce với acid amin HMGR 1HWK 3.4 TÁC ĐỘNG ỨC CHẾ HMGR IN VITRO CỦA CÁC CHALCON 3.4.1 Thử tác động ức chế HMGR pravastatin chalcon Pravastatin mẫu chứng dương cung cấp với kit Ở nồng độ sử dụng theo hướng dẫn kit, pravastatin ức chế > 95% hoạt tính HMGR Trong thí nghiệm này, sử dụng mẫu pravastatin: mẫu pha theo nồng độ hướng dẫn (5 g/ml) mẫu pha loãng lần (1 g/ml) Do khối lượng mẫu chalcon thu từ tổng hợp hóa học nên chúng tơi phải dựa giá trị IC50 tham khảo pravastatin sàng lọc chất thử nồng độ khác (gấp 100-1000 lần IC50 pravastatin) Nếu kết thử nghiệm cho thấy chất thử có tiềm tiến hành xác định IC50 Tiến hành thử tác động ức chế enzym pravastatin dẫn chất chalcon, kết tác động ức chế HMGR trình bày bảng 3.3 _ Kết bàn luận 28 _ Bảng 3.3 Kết sàng lọc tác động ức chế HMGR in vitro 10 chalcon Hợp chất Nồng độ (g/ml) 15 30 60 15 30 75 7,5 15 30 15 30 60 15 30 Ca Cb Cc Cd Ce Pravastatin % Ức chế HMGR 52,1 69,9 90,4 15,7 21,5 24,9 9,5 51,3 17,9 19,7 43,1 77,5 85,4 88,7 99,3 Hợp chất Cf Cg Ch Ck Cm Nồng độ (g/ml) 15 30 60 15 30 45 15 30 60 30 45 60 15 30 60 % Ức chế HMGR 4,8 20,1 9,0 13,9 2,7 10,8 35,6 48,1 62,3 30,7 52,6 73,5 Pravastatin pha theo hướng dẫn có tác động ức chế gần hoàn toàn HMGR từ giai đoạn đầu phản ứng Kết tính tốn cho thấy % ức chế enzym mẫu pravastatin 99,30% Mẫu pravastatin pha loãng lần ức chế HMGR từ đầu với mức độ ức chế 88,75% Hợp chất Ca: so sánh khả ức chế enzym nồng độ khác nhau, hợp chất Ca có khả ức chế enzym tốt khả ức chế tăng tỷ lệ thuận theo nồng độ Với kết này, hợp chất Ca xem chất có tiềm ức chế HMGR tiếp tục xác định IC50 hợp chất Hợp chất Ce: tương tự Ca, Ce có khả ức chế enzym tốt khả ức chế tăng tỷ lệ thuận theo nồng độ hợp chất chất có tiềm ức chế HMGR tiếp tục xác định IC50 Hợp chất Cb: Cb có khả ức chế enzym tác động thể Ở nồng độ 30 g/ml khả ức chế HMGR đạt khoảng 15%, nồng độ tăng gấp 2,5 lần khả ức chế HMGR không thay đổi _ Kết bàn luận 29 _ Hợp chất Cc: nồng độ 15 g/ml khả ức chế HMGR đạt khoảng 8%, nồng độ tăng gấp đôi khả ức chế HMGR đạt khoảng 50% Tuy nhiên, khả ức chế HMGR Cc lại không tăng tỷ lệ thuận theo nồng độ Hợp chất Cd: khả ức chế HMGR Cd không cao Ở nồng độ 60 g/ml (gấp 1000 lần IC50 pravastatin), Cd ức chế 20% hoạt tính enzym Hợp chất Cf: khả ức chế Cf hoạt tính HMGR khơng đáng kể Hợp chất Cg : tương tự, Cg ức chế HMGR yếu nồng độ cao khảo sát (gấp > 1000 lần IC50 pravastatin) Hợp chất Ch: nồng độ gấp 1000 lần IC50 pravastatin khả ức chế HMGR Ch đạt khoảng 3% nồng độ tăng gấp lần khả ức chế HMGR đạt khoảng 10% Hợp chất Ck: Ck có khả ức chế enzym tốt Ở nồng độ 30 g/ml khả ức chế HMGR đạt khoảng 35% Khả ức chế HMGR tăng tăng nồng độ thử nghiệm Có thể thấy chất Ck có tiềm ức chế HMGR, nhiên khối lượng hạn chế nên chưa thể xác định IC50 hợp chất Hợp chất Cm: tương tự, khả ức chế HMGR Cm đáp ứng tốt theo nồng độ thử nghiệm, nhiên chưa đủ điều kiện để xác định IC50 hợp chất 3.4.2 Xác định IC50 Ca Ce HMGR Xác định IC50 hợp chất Ca Với dãy gồm nồng độ hợp chất Ca từ 35-120 µM khả ức chế HMG – CoA reductase tăng tương ứng: 22,97% nồng độ 35 µM 84,84% nồng độ 120 µM Kết đánh giá tác động ức chế HMGR Ca trình bày bảng 3.4 _ Kết bàn luận 30 _ Bảng 3.4 Kết thử tác động ức chế HMG-CoA reductase Ca Nồng độ (µM) ΔA340 (trắng) ΔA340 (chuẩn) 35 0,011 0,31 50 0,011 0,31 70 0,011 0,31 100 0,011 0,31 120 0,011 0,31 ΔA340 (thử) %ức chế 0,241 0,243 0,240 0,205 0,203 0,208 0,160 0,175 0,181 0,124 0,126 0,127 0,054 0,057 0,058 23,08% 22,41% 23,4% 35,12% 35,79% 34,11% 50,17% 45,15% 43,14% 62,21% 61,54% 61,20% 85,62% 84,62% 84,28% %ức chế TB Hoạt tính enzym TB (Đvị/mgP) 22,97% 6,17 35,01% 5,21 46,15% 4,31 61,65% 3,07 84,84% 1,21 Biểu đồ 3.1 Đường biểu diễn thay đổi hoạt độ enzym theo log nồng độ Ca Ca bắt đầu thể tác động ức chế enzym nồng độ 35 µM Khả ức chế enzym đạt tối đa nồng độ 120 µM Phương trình hồi quy tuyến tính sau: y = -8,5622x + 19,693; hệ số tương quan R2 = 0,93 IC50 ước lượng _ Kết bàn luận 31 _ 68,57 μM tương đương với 13,65 µg/ml Xác định IC50 chất Ce Kết thử tác động ức chế HMGR Ce trình bày bảng 3.5 Bảng 3.5 Kết thử tác động ức chế HMGR Ce Nồng độ (µg/ml) ΔA340 (trắng) ΔA340 (chuẩn) 20 0,011 0,354 24 0,011 0,354 26 0,011 0,354 30 0,011 0,354 35 0,011 0,354 ΔA340 (thử) %ức chế 0,249 0,250 0,248 0,193 0,194 0,193 0,175 0,177 0,178 0,050 0,048 0,050 0,007 0,007 0,005 27,41% 27,11% 27,70% 46,65% 46,65% 46,94% 52,19% 51,60% 51,31% 82,51% 82,80% 83,09% 97,96% 97,67% 98,25% %ức chế TB Hoạt tính enzym TB (Đvị/mgP) 27,26% 6,67 46,74% 4,89 51,70% 4,44 82,80% 1,58 97,96% 0,19 Biểu đồ 3.2 Đường biểu diễn thay đổi hoạt độ enzym theo log nồng độ Ce _ Kết bàn luận 32 _ Ce bắt đầu thể tác động ức chế enzym nồng độ 20 µM Khả ức chế enzym đạt tối đa nồng độ 35 µM Phương trình hồi quy tuyến tính sau: y = -27,916x + 43,293; hệ số tương quan R2 = 0,97; IC50 ước lượng 24,56 μM tương đương với 5,28 µg/ml 3.5 KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG LÀM GIẢM LIPID MÁU IN VIVO Trong 10 dẫn chất chalcon khảo sát, có hợp chất Ca Ce chất có tác dụng ức chế HMG-CoAreductase mạnh Để tiếp tục chứng minh tác động ức chế tổng hợp cholesterol in vivo chọn lựa hợp chất Ce với IC50 = 24,56µM để khảo sát tác động làm giảm lipid huyết mơ hình gây tăng lipid huyết cấp tyloxapol Theo Jieun Kwak cộng sự, liều thử nghiệm dẫn xuất chalcon nghiên cứu in vivo bệnh Alzheimer 50 mg/kg [19] Trong q trình dị liều in vivo, nhận thấy liều 125 mg/kg Ce bắt đầu có tác động làm giảm cholesterol, chúng tơi chọn Ce liều gấp 2, 3, lần liều 125 mg/kg để khảo sát tác động làm giảm lipid máu Biểu đồ 3.3 Tác động Ce lên hàm lượng cholesterol, triglycerid huyết chuột gây tăng lipid huyết cấp tyloxapol _ Kết bàn luận 33 _ Kết cho thấy, sau 24 giờ, lô gây bệnh tyloxapol có hàm lượng cholesterol 345,24 ± 13,69 mg/dL tăng lần so với lô chứng (107,41 ± 7,81 mg/dL) Ở lô điều trị atorvastatin, hàm lượng cholesterol (213,27 ± 26,94 mg/dL) giảm sau 24 giờ, khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô gây bệnh (p