Mục tiêu nghiên cứu nhằm xây dựng quy trình tạo dịch đồng thể enzym HMG-CoA reductase từ gan chuột nhắt để áp dụng trong sàng lọc thuốc ức chế HMG-CoA reductase in vitro. Mời các bạn cùng tham khảo.
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 MƠ PHỎNG MƠ HÌNH THỬ T[C ĐỘNG ỨC CHẾ HMG-CoA REDUCTASE TỪ NGUỒN ENZYM Ở GAN CHUỘT NHẮT Trương Đ nh Phước*, Trần Thị Thiên Thanh*, Huỳnh Ngọc Trinh*, Trần Mạnh Hùng* TĨM TẮT Mục tiêu: Xây dựng quy trình tạo dịch đồng thể enzym HMG-CoA reductase từ gan chuột nhắt để áp dụng sàng lọc thuốc ức chế HMG-CoA reductase in vitro Đối tượng v| phương ph{p nghiên cứu: Gan chuột nhắt chủng Swiss albino, 8-10 tuần tuổi, giống đực, chọn để tạo dịch đồng thể chứa HMG-CoA reductase Định lượng protein dịch đồng thể enzym phương ph{p pyrogallol-molybdat X{c định hoạt tính HMG-CoA reductase dịch đồng thể enzym phương ph{p đo động học giảm độ hấp thu NADPH bước sóng 340 nm Kết quả: Đã xây dựng quy trình tạo dịch đồng thể enzym chứa HMG-CoA reductase từ gan chuột nhắt x{c định c{c điều kiện tối ưu phản ứng khảo sát tác dụng ức chế HMG- CoA reductase in vitro, gồm: nồng độ chất HMG- CoA ban đầu 60M, nồng độ co-factor NADPH 0,02 mM, dithiothreitol mM, nhiệt độ phản ứng 37oC, lượng protein enzym mg, pH 7,5 (đệm Tris- HCl) thời gian tiến hành phản ứng phút Atorvastatin cho hoạt tính ức chế HMG-CoA reductase thu từ gan chuột nhắt với IC50 ước lượng 14,89 ng/ml Từ khóa: HMG-CoA reductase, gan, chuột nhắt, dịch đồng thể ABSTRACT DEVELOPING A PROCEDURE TO DETERMINE INHIBITION OF HMG-CoA REDUCTASE FROM MOUSE LIVER ENZYMES Truong Dinh Phuoc, Tran Thi Thien Thanh, Huynh Ngoc Trinh, Tran Manh Hung * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement Vol 22 - No 1- 2018: 340 - 347 Aim of study: This study aimed to develop a procedure to evaluate the inhibitory effect of new drug candidates on HMG-CoA reductase from mouse liver Material and Method: Homogenate containing HMG-CoA reductase was prepared from 8-10 week old, male, Swiss albino mouse liver Protein concentration in homogenate was determined by pyrogallol-molybdate method HMG-CoA reductase activity in homogenate was assayed by kinetic method via measuring the reduction of absorption of NADPH at 340 nm Results: This study had succeeded in establishing a procedure to prepare homogenate containing HMG-CoA reductase from mouse live and determining optimal conditions for reaction to evaluate the inhibitory effect of testing substances on HMG-CoA reductase in vitro, including: HMG-CoA 60M, co-factor NADPH 0.02 mM, dithiothreitol mM, reaction temperature 37oC, protein enzyme mg, pH 7.5 (Tris-HCl buffer) and reaction time minutes Atorvastatin showed IC50 of 14.89 ng/ml on HMG-CoA reductase from mouse liver Key words: HMG-CoA reductase, liver, mouse, homogenate vữa động mạch, nhồi m{u tim, tai biến mạch ĐẶT VẤN ĐỀ máu não Nhiều nghiên cứu mối quan hệ Rối loạn lipid huyết trực tiếp nồng độ cholesterol huyết với nguyên nhân gây biến chứng nhƣ xơ * Khoa Dƣợc, Đại học Y Dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: PGS TS Trần Mạnh Hùng ĐT: 0937746596 340 Email: manhhung1969@yahoo.com Chuyên Đề Dƣợc Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 nguy mắc bệnh tim mạch(11) Hiện việc điều trị rối loạn lipid huyết bao gồm điều trị không sử dụng thuốc v| điều trị sử dụng thuốc Điều trị không dùng thuốc chủ yếu điều chỉnh lối sống ngƣời bệnh Có nhiều nhóm thuốc đƣợc sử dụng để điều trị bệnh, phổ biến thuốc ức chế -hydroxyl-methylglutaryl Coenzym A (HMG - CoA reductase) (nhóm statin), niacin, ezetimid, nhựa gắn acid mật, nhóm fibrat(6) Enzym HMG - CoA reductase (một enzym gắn kết màng lƣới nội chất trơn) có khả xúc tác phản ứng khử HMG - CoA thành acid mevalonic, đóng vai trò then chốt chu trình tổng hợp cholesterol, l| đối tƣợng nghiên cứu chủ yếu lĩnh vực điều trị rối loạn lipid huyết(2) Do ức chế HMG - CoA reductase chế quan trọng việc nghiên cứu tìm thuốc có t{c động ngăn tiến triển bệnh nhƣ cải thiện triệu chứng lâm sàng ngƣời bệnh Xuất phát từ quan điểm trên, đề tài “Mô mô hình thử t{c động ức chế HMG CoA reductase từ nguồn enzyme gan chuột nhắt” đƣợc thực với mục tiêu sau: - Xây dựng quy trình chiết tách HMG - CoA reductase từ gan chuột nhắt - Khảo s{t c{c điều kiện tối ƣu phản ứng enzym để áp dụng việc thử nghiệm hoạt tính ức chế HMG - CoA reductase in vitro thuốc ĐỐI TƢỢNG-PHƢƠNGPH[P NGHIÊNCỨU Động vật thử nghiệm Chuột nhắt trắng, chủng Swiss albino, 8-10 tuần tuổi, nặng khoảng 30-35 gam, giống đực, khỏe mạnh, khơng có biểu bất thƣờng Viện Kiểm nghiệm thuốc Tp Hồ Chí Minh cung cấp Chuột đƣợc nuôi khoảng tuần để ổn định trƣớc thí nghiệm Hóa chất - D,L- Dithiothreitol, độ tinh khiết ≥ 98% (TLC), Sigma Aldrich, số lô SLBK4951V Chuyên Đề Dƣợc Nghiên cứu Y học - HMG-CoA, độ tinh khiết ≥ 95%, Santa Cruz Biotechnology, số lô 103476-21-7 - NADPH, độ tinh khiết ≥ 95%, Santa Cruz, số lô C0315 - Tris base, độ tinh khiết ≥ 99%, Merck, số lô TD600719-519 - Ethylendinitrilo tetraacetic acid, độ tinh khiết ≥ 99%, Merck, số lơ 205-358-3 Qui trình thu dịch đồng thể enzym từ gan chuột nhắt Qui trình đƣợc mơ dựa mơ tả Hirangi cộng (2011)(3): Chuẩn bị dung dịch bảo quản gồm đệm TRIS HCl 0,1 M pH 7,4, dung dịch sucrose 0,25 M lạnh (0-4oC), dithiothreitol 1mM; dung dịch rửa gan NaCl 0,9% Chuột đƣợc nuôi ổn định cho nhịn đói giờ, sau g}y mê đ{ CO2, cố định bàn mổ, bơm rửa làm máu dịch gan dung dịch NaCl 0,9% khoảng phút Gan đƣợc tách nhanh, cho vào dung dịch sucrose 0,25 M đƣợc làm lạnh nƣớc đ{, rửa Làm nhuyễn sơ mô gan kéo, cho mô gan vào ống falcon 15 ml, bổ sung dung dịch sucrose 0,25 M lạnh tƣơng ứng ml dung dịch/1 g mô Tiến h|nh đồng thể hóa mẫu mơ máy nghiền đồng thể tế b|o học nhiệt độ 0-4oC Tiến h|nh đồng thể tế bào khoảng 20 giây, sau ngƣng 10 gi}y để tránh enzym bị hoạt tính nhiệt Tiếp tục nhƣ lần (tổng thời gian đồng thể mô khoảng phút) thu đƣợc dịch mơ đồng (tạo thành dung dịch có cảm quan sánh, màu trắng đục) Ly tâm lần 0oC 15 phút với tốc độ 5000 x g Loại bỏ mỡ bề mặt dịch thành falcon Bỏ cắn, thu dịch Bổ sung 0,1 ml dung dịch CaCl2 88 mM ml dịch nổi, lắc đều, để ổn định phút đ{ b|o Ly t}m lần 0oC 35 phút với tốc độ 13500 x g, bỏ dịch thu cắn Sau loại bỏ vết mỡ cắn, rửa cắn thu đƣợc 341 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 cách hòa tan cắn dung dịch bảo quản enzym nhiệt độ 0- 4oC, vortex nhẹ tính, tiến hành pha lỗng mẫu enzym đến OD nằm khoảng tuyến tính Cắn đƣợc đồng thể hoá trở lại máy nghiền đồng thể tế b|o học, tiến hành 20 gi}y, thu đƣợc dịch mơ đồng nhất, trì nhiệt độ bảo quản 0- 4oC Chia mẫu enzym thu đƣợc thành nhiều phần nhỏ, phần gồm khoảng ml bảo quản -70oC Trƣớc sử dụng enzym, tiến h|nh rã đơng chậm đ{ bào Trong q trình sử dụng, dịch đồng thể enzym giữ lạnh đ{ b|o, khơng thực qu{ trình đơng – rã đơng nhiều lần, tránh hƣ hỏng enzym Các thí nghiệm x{c định hoạt tính enzym Định lƣợng protein dịch đồng thể enzym phƣơng ph{p pyrogallol-molybdat Xây dựng đƣờng tuyến tính thể phụ thuộc mật độ quang vào nồng độ protein: pha giai mẫu từ dung dịch mẹ protein chuẩn nồng độ 10 mg/ml (Bovine serum albmin – BSA) dung dịch bảo quản enzym (sucrose nồng độ 0,25 M, đệm TRIS HCl 0,1 M pH 7,4) nhƣ sau: Nồng độ BSA (mg/ml) Dung dịch mẹ BSA 10 10 20 30 40 50 60 mg/ml (µl) Dung dịch bảo quản 100 900 800 700 600 500 400 enzym (µl) Hút xác µl giai mẫu vào ống nghiệm, thêm ml thuốc thử đỏ pyrogallol, ủ hỗn hợp phản ứng nhiệt độ phòng 10 phút, hút 300 µl hỗn hợp phản ứng vào giếng đo quang, v| đo độ hấp thu (OD) bƣớc sóng 595 nm Dựa v|o đƣờng tuyến tính, tính toán hàm lƣợng protein mẫu enzym dựa vào kết OD thu đƣợc Nếu OD nằm khoảng tuyến Tiến hành phản ứng khử HMG-CoA thành acid mevalonic nhờ hoạt tính xúc tác HMGCoA reductase Hoạt tính đƣợc đ{nh giá giảm lƣợng co-factor NADPH trình xảy phản ứng Lƣợng co-factor NADPH đƣợc x{c định dựa v|o phƣơng ph{p định lƣợng UV-Vis (đo động học) bƣớc sóng 340 nm Phản ứng đƣợc thục ống nghiệm với tổng thể tích 1ml bao gồm tác nhân: Cơ chất HMG- CoA: khảo sát nồng độ tối ƣu (30 M, 60 M, 120 M) cho phản ứng Co-factor NADPH: khảo s{t lƣợng NAPDH tối ƣu (0,01µmol; 0,02µmol; 0,05µmol; 0,1µmol) cho phản ứng Dịch đồng thể enzym: khảo s{t lƣợng protein-enzym tƣơng ứng 0,2 mg-0,5mg-1mg-2 mg Dung dịch đệm: sử dụng dung dịch đệm Tris- HCl 0,1 M để khảo sát pH tối ƣu cho phản ứng (pH 6; pH 7,5; pH 9) Dithiothreitol: chất chống oxi hóa, đƣợc sử dụng với nồng độ mM phản ứng Nhiệt độ phản ứng: 37oC Tiến h|nh đo UV- Vis (phƣơng ph{p động học) để x{c định mật độ quang lại NADPH 30 giây, phút Thực song song mẫu trắng khơng có chất HMG- CoA, thành phần kh{c tƣơng tự nhƣ ống nghiệm phản ứng Công thức đ{nh gi{ hoạt tính enzym (Sigma Aldrich): Đơn vị hoạt tính/mgP = Trong đó: 12,44 = εmM - hệ số hấp thu phân tử NADPH 340nm 6.22 mM–1cm–1 12,44 thể có NADPH tham gia phản ứng V = thể tích dịch đồng thể enzym (ml) C = Nồng độ protein enzym mg/ml LP = Bề dày cốc đo (1cm) TV = tổng thể tích phản ứng (1 ml) 342 Chuyên Đề Dƣợc Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 ĐVHT enzym chuyển µmol NADPH thành NADP+ phút 37 °C ĐV: µmol/phút/mgP Khảo sát hoạt tính ức chế enzym HMG CoA reductase atorvastatin Phản ứng đ{nh gi{ t{c động ức chế HMGCoA reductase atorvastatin đƣợc thực c{c điều kiện sau: nồng độ chất HMG CoA ban đầu: 60M, nồng độ đồng yếu tố NADPH: 0,02 mM, dithiothreitol mM, nhiệt độ phản ứng 370C, lƣợng protein enzym: mg pH 7,5 Atorvastatin đƣợc thử nghiệm với Nghiên cứu Y học nồng độ: 0; 0,1; 1; 5; 10; 15; 20; 30; 50; 100; 1000 ng/ml, để x{c định IC50 KẾT QUẢ X{c định h|m lƣợng protein mẫu dịch đồng thể enzym thu đƣợc Thực quy trình tạo dịch đồng thể enzym lô chuột (6 chuột/lô), kết thu đƣợc 12 ml dịch đồng thể enzym/lô Tiến hành x{c định h|m lƣợng protein mẫu dịch đồng thể enzym (thực lần) Kết trình bày Biểu đồ Biểu đồ 1: Đường tuyến tính kết định lượng protein lơ thí nghiệm 37oC Lƣợng protein enzym đƣợc khảo sát Khoảng tuyến tính phƣơng ph{p ƣớc mức 0,2 mg-0,5 mg-1 mg v| mg để tìm lƣợng khoảng nồng độ BSA từ 1-6 mg/ml lƣợng protein enzym cho hoạt tính cao Kết Phƣơng trình hồi quy là: y = 0,0676x + 0,0149, hệ thí nghiệm đƣợc trình bày bảng số tƣơng quan R = 0,9935 Nồng độ protein (Cprotein) = 2,43 mg/ml – 3,86 mg/ml Thí nghiệm thăm dò hoạt tính HMG-CoA reductase mẫu protein thu đƣợc Bảng 1: Kết thí nghiệm thăm dò sơ hoạt tính HMG-CoA từ dịch đồng thể enzym Lượng protein enzym (mg) 0,2 0,5 OD0-300 giây 0,312 0,313 0,335 0,237 Hoạt t nh enzym (đơn vị/ mgP) 50,22 50,35 53,89 38,13 Hoạt tính HMG-CoA reductase đƣợc thăm dò qua phản ứng c{c điều kiện sau: nồng độ chất HMG-CoA ban đầu 60 M, nồng độ cofactor NADPH 0,02 mM, pH 7,4 (đệm TRISHCl), dithiothreitol mM nhiệt độ phản ứng Chuyên Đề Dƣợc Kết cho thấy mật độ quang giảm trình xảy phản ứng, chứng tỏ quy trình tạo dịch đồng thể thu đƣợc enzym với co-factor NADPH có khả xúc t{c chuyển hóa HMG-CoA Khi sử dụng lƣợng protein enzym từ 0,2 mg-1 mg phản ứng xảy với hoạt tính enzym gần nhƣ nhau, lƣợng protein enzym mg có hoạt tính enzym cao Tuy nhiên, sử dụng lƣợng protein enzym mg hoạt tính enzym lại giảm xuống Vì thơng số protein enzym mg đƣợc chọn cho thí nghiệm Khảo sát thay đổi hoạt tính enzym theo khoảng thời gian thực phản ứng Thời gian thực phản ứng đƣợc khảo 343 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 sát thời điểm khác nhằm tìm thời điểm thể hoạt tính enzym cao Thí nghiệm đƣợc tiến hành lô dịch đồng thể (lô 1-3) với điều kiện phản ứng nhƣ sau: HMG-CoA 60 M, NADPH 0,02 mM, pH 7,4, dithiothreitol mM, protein enzym mg nhiệt độ phản ứng 37oC Kết thí nghiệm đƣợc trình bày biểu đồ Biểu đồ 2: Sự thay đổi hoạt tính xúc tác enzym theo khoảng thời gian phản ứng Kết cho thấy hoạt tính enzym cao phút phản ứng, sau hoạt tính enzym giảm dần Do đó, thí nghiệm đƣợc tiến h|nh đo mật độ quang phản ứng 30 giây phút đầu phản ứng Khảo sát thay đổi hoạt tính enzym HMGCoA reductase theo pH phản ứng Bảng 2: Sự thay đổi hoạt tính enzym HMG- CoA reductase theo pH phản ứng pH OD0-300 giây 6,0 (n = 3) 7,5 (n = 3) 9,0 (n = 3) 0,063 ± 0,016 0,337 ± 0,011 0,052 ± 0,023 Hoạt tính enzym (đơn vị/ mgP) 10,11 ± 2,54 54,14 ± 1,79 8,34 ± 3,73 HMG-CoA reductase gan chuột nhắt có hoạt tính cao thực phản ứng pH 7,5; hoạt tính enzym giảm nhanh pH = pH = Thí nghiệm đƣợc tiến hành môi trƣờng đệm Tris-HCl pH khác nhằm chọn pH thích hợp cho phản ứng Sử dụng dịch đồng thể enzym lô để tiến hành Kết thí nghiệm đƣợc trình bày bảng Khảo sát thay đổi hoạt tính HMG-CoA reductase theo nồng độ HMG-CoA Bảng 3: Sự thay đổi hoạt tính HMG-CoA reductase theo nồng độ chất HMG-CoA HMG-CoA (M) OD0-300 giây 30 (n = 3) 60 (n = 3) 120 (n = 3) 0,324 ± 0,020 0,350 ± 0,018 0,348 ± 0,019 Hoạt tính enzym (đơn vị/ mgP) 52,11 ± 3,20 56,23 ± 2,89 55,98 ± 3,11 Nồng độ chất HMG-CoA đƣợc khảo sát nồng độ 30-60 120 M Hoạt tính enzym HMG-CoA reductase hầu nhƣ không bị ảnh hƣởng nồng độ chất HMG- CoA điều kiện khảo sát (bảng 3) Tuy nhiên, dựa vào số nghiên cứu, sử dụng thông số nồng độ HMG-CoA 60 M Khảo sát thay đổi hoạt tính HMG-CoA reductase theo nồng độ NADPH Bảng 4: Sự thay đổi hoạt tính HMG-CoA reductase theo nồng độ co-factor NADPH Nồng độ co- factor NADPH (mM) 0,01 (n=3) 0,02 (n=3) 0,05 (n=3) 0,1 (n=3) OD0-300 giây 0,285±0,013 0,343±0,019 0,325±0,030 0,338±0,023 Hoạt tính enzym (đơn vị/ mgP) 45,87 ± 2.11 55,11 ± 3,09 52,23 ± 4,76 54,35 ± 3,76 Đồng yếu tố NADPH đƣợc khảo sát nồng độ 0,01-0,02-0,05 0,1 mM Hoạt tính 344 Chuyên Đề Dƣợc Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 enzym HMG-CoA reductase cao nồng độ NADPH 0,02 mM, hoạt tính giảm giảm nồng độ co-factor NADPH, hoạt tính enzym khơng thay đổi nhiều tăng nồng độ NADPH lên 0,05 mM 0,1 mM Khảo s{t độ ổn định enzym HMG-CoA reductase Nghiên cứu Y học sau tạo dịch đồng thể enzym, sau tuần, tuần, tuần, 12 tuần bảo quản -70oC Kết thí nghiệm (biểu đồ 3) cho thấy hoạt độ enzym HMG-CoA giảm bảo quản (ở -70oC) v| đến 12 tuần hầu nhƣ enzym khơng khả xúc tác Tiến hành phản ứng với mẫu enzym thu đƣợc khoảng thời gian sau: Biểu đồ 3: Sự thay đổi hoạt tính xúc tác enzym theo thời gian bảo quản Khảo s{t t{c động atorvastatin lên khả ức chế HMG-CoA reductase từ dịch đồng thể enzym Bảng 5: T{c động ức chế HMG-CoA reductase dịch đồng thể atorvastatin Nồng độ atorvastatin (ng/ml) (mẫu chứng) (n=3) 0,1 (n=3) (n=3) (n=3) 10 (n=3) 15 (n=3) 20 (n=3) 30 (n=3) 50 (n=3) 100 (n=3) 1000 (n=3) Chuyên Đề Dƣợc OD0-300 giây 0,330±0,015 0,320±0,019 0,300±0,09 0,281±0,035 0,205±0,013 0,120±0,006 0,066±0,020 0,029±0,011 0,003±0,019 -0,017±0,031 0,006±0,016 Hoạt tính enzym (đơn vị/ mgP) 53,11 ± 2,36 51,43 ± 3,12 48,23 ± 2,98 45,23 ± 5,63 32,89 ± 2,09 19,23 ±1,10 10,66 ± 3,21 4,65 ± 1,76 0,56 ± 3,03 -2,78 ± 5,04 0,98 ± 2,65 Để sử dụng dịch đồng thể enzym nhƣ công cụ sàng lọc khả ức chế HMGCoA reductase thuốc khảo sát, atorvastatin đƣợc sử dụng làm chất đối chứng dƣơng v| x{c định IC50 thuốc Atorvastatin bắt đầu ức chế HMG-CoA reductase nồng độ ng/ml, nồng độ ≥ 50 ng/ml atorvastatin có tác dụng ức chế enzym gần nhƣ ho|n to|n Khoảng tuyến tính ƣớc lƣợng đƣợc khoảng nồng độ 5-50 ng/ml, phƣơng trình hồi quy y = -49,98x + 77,66 với R2= 0,959 IC50 atorvastatin 14,89 ng/ml Kết khẳng định thêm, enzym thu đƣợc dịch đồng thể có khả xúc t{c chuyển hóa HMG-CoA 345 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Biểu đồ 4: Tác dụng ức chế enzym HMG-CoA reductase in vitro atorvastatin; (A): đường cong hoạt tính enzym-log nồng độ, (B): khoảng tuyến tính ức chế enzym BÀN LUẬN Kết thăm dò sơ hoạt tính enzym với kết t{c động ức chế HMG-CoA reductase in vitro atorvastatin cho thấy mẫu protein thu đƣợc có chứa enzym có khả xúc t{c chuyển hóa -hydroxyl-methylglutaryl Coenzym A (HMG- CoA) Ở tế bào gan chuột nhắt có hai loại enzym có khả n|y l| HMG-CoA lyase (chuyển HMGCoA thành acetoacetat acetyl-CoA) HMG-CoA reductase (chuyển HMG- CoA thành acid mevalonic)(3) Trong tế bào, HMGCoA lyase phân bố ty thể Theo quy trình tạo dịch đồng thể enzym, sau đồng mẫu mô, dịch đồng thể đƣợc ly tâm lần với tốc độ 5000 x g, thu dịch bỏ cắn Với tốc độ phần dịch khơng có ph}n đoạn nhân ty thể tỉ trọng lớn nên diện chủ yếu phần cắn Do nhận định dịch đồng thể thu đƣợc chứa HMG-CoA lyase không đ{ng kể, chuyển hóa HMG-CoA HMG-CoA reductase (enzym nằm microsom tế bào gan chuột nhắt) xúc tác Tốc độ phản ứng xúc tác HMG-CoA reductase dịch đồng thể xảy nhanh phút đầu tiên, tốc độ giảm từ sau phút thứ phút đến 30 phút Phản ứng chậm lại từ sau 30 phút Kết n|y tƣơng tự với kết nghiên cứu Hulcher cộng khảo sát hoạt tính HMG-CoA reductase in vitro thu từ gan chuột cống: thời 346 gian đo mật độ quang 15-30 giây phút phản ứng(4) HMG-CoA reductase gan chuột nhắt cho hoạt tính xúc tác tối ƣu mơi trƣờng trung tính (pH 7,5), hoạt tính giảm nhanh mơi trƣờng acid (pH 6) kiềm (pH 9) Một số nghiên cứu HMG-CoA reductase phân lớp (phân bố chủ yếu động vật có vú) hoạt động tối ƣu pH trung tính(5) Tuy nhiên Pseudomonas, HMG-CoA reductase lại hoạt động tối ƣu pH 9, xúc tác phản ứng theo chiều ngƣợc lại: từ acid mevalonic chuyển thành HMG-CoA(8) Nồng độ chất HMG-CoA không ảnh hƣởng đ{ng kể đến hoạt tính enzym Ở thí nghiệm sử dụng HMG-CoA với nồng độ 60 µM vƣợt giá trị Km phản ứng (khoảng 4,2 µM chuột nhắt)(9) Vì gấp đơi (120 µM) hay giảm nửa (30 µM) nồng độ chất HMG-CoA khơng ảnh hƣởng đến hoạt tính HMG-CoA reductase Tuy nhiên việc x{c định giá trị Km phản ứng thƣờng khó khăn, đặc biệt với mẫu protein thơ(8) Do đó, chúng tơi sử dụng nồng độ HMG-CoA 60 µM cho thí nghiệm, để đảm bảo phù hợp điều kiện phản ứng Nồng độ đồng yếu tố NADPH từ 0,02 mM trở lên gây ảnh hƣởng đến hoạt tính enzym Các nghiên cứu rằng, Km NADPH vào khoảng 26 µM (gan chuột)(8,10) Mặt khác NADPH đồng xúc tác cho phản ứng khác mơ gan thu đƣợc Vì để hạn chế sai Chuyên Đề Dƣợc Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học số sử dụng thông số nồng độ cofactor NADPH 0,02 mM đề tài (theo hợp đồng nghiên cứu số: 69/2017/HĐSKHCN ngày 19/5/2017) Atorvastatin chất ức chế HMG-CoA reductase với Ki thấp (cỡ v|i nM) Điều phù hợp với kết với IC50 ƣớc lƣợng khoảng 14,89 ng/ml Kết n|y cao so với t{c động ức chế HMG-CoA reductase tinh khiết từ ngƣời atorvastatin 4,58 ng/ml(7) Tuy vậy, kết lần xác nhận mẫu enzym thu đƣợc chứa HMG-CoA reductase có khả xúc t{c phản ứng HMG-CoA thành acid mevalonic TÀI LIỆU THAM KHẢO KẾT LUẬN Sau thời gian thực đề t|i “Mô quy trình x{c định hoạt tính enzym HMGCoA reductase”, thu đƣợc kết sau: - Xây dựng đƣợc quy trình tạo dịch đồng thể chứa HMG-CoA reductase từ gan chuột nhắt, dùng để sàng lọc thuốc có t{c động ức chế enzym này, với thuốc đối chứng atorvastatin có IC50 ƣớc lƣợng 14,898 ng/ml X{c định đƣợc c{c điều kiện tối ƣu phản ứng sử dụng thí nghiệm khảo sát tác dụng ức chế HMG-CoA reductase từ dịch đồng thể, bao gồm: nồng độ chất HMGCoA ban đầu 60M, nồng độ co-factor NADPH 0,02 mM, dithiothreitol mM, nhiệt độ phản ứng 37oC, lƣợng protein enzym mg, pH 7,5 (đệm Tris- HCl) thời gian tiến hành phản ứng phút Lời cám ơn: Chúng chân thành cảm ơn Sở Khoa học Công nghệ Tp HCM cấp kinh phí nghiên cứu để thực Chuyên Đề Dƣợc 10 11 Ashmarina LI cộng (1999), "3-Hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A lyase: targeting and processing in peroxisomes and mitochondria", J Lipid Res 40 (1): 70-75 Brown DS, Dietschy JM, Siperstein MD (1973), "3-Hydroxy-3methylglutaryl coenzyme A reductase Solubilization and purification of a cold-sensitive microsomal enzyme.", J Biol Chem 248: 4731-4738 Hirangi D Patel GBS, Vandit T (2011), "Investigation of HMGCoA Reductase inhibitory Activity of Antihyperlipidemic Herbal Drugs Study", Asian J Exp Biol Sci (1): 63-68 Hulcher FH et al (1973), "Simplified spectrophotometric assay for microsomal 3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA reductase by measurement of coenzyme A", J Lipid Res 14 (6): 625-631 Kleinsek DA, Ranganathan S and Porter J W (1977) "Purification of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase from rat liver”, Proc Natl Acad Sci USA; 74(4): 1431– 1435 Mai Phƣơng Mai, Trần Mạnh Hùng (2014), Dược lý học tập 2, NXB Y Học, Bộ Y tế, tr 289-297 McTaggart F, Buckett L, Davidson R, Holdgate G, McCormick A, Schneck D, Smith G, Warwick M (2001) Preclinical and clinical pharmacology of rosuvastatin, a new 3-hydroxy-3methylglutaryl coenzyme A reductase inhibitor Am J Cardiol 2001;87(suppl):28B–32B Rodwell VW and Brown WE (1980), "HydroxymethylglutarylCoA reductase" Experientia Suppl 36: 232-272 Shapiro DJ et al (1974), "Micro assay for 3-hydroxy-3methylglutaryl-CoA reductase in rat liver and in L-cell fibroblasts", Biochim Biophys Acta 370 (2): 369-377 Shechter JR (1983), "Regulation of Rat Liver 3-Hydroxy-3methylglutarylC oenzyme A Reductase", J Biol Chem 259 (2): 870-877 Wong ND (2014), "Epidemiological studies of CHD and the evolution of preventive cardiology", Nat Rev Cardiol 11 (5): 276-289 Ngày nhận báo: 18/10/2017 Ngày phản biện nhận xét báo: 01/11/2017 Ng|y b|i b{o đăng: 15/03/2018 347 ... mơ hình thử t{c động ức chế HMG CoA reductase từ nguồn enzyme gan chuột nhắt đƣợc thực với mục tiêu sau: - Xây dựng quy trình chiết tách HMG - CoA reductase từ gan chuột nhắt - Khảo s{t c{c điều... đồng thể thu đƣợc chứa HMG-CoA lyase khơng đ{ng kể, chuyển hóa HMG-CoA HMG-CoA reductase (enzym nằm microsom tế bào gan chuột nhắt) xúc tác Tốc độ phản ứng xúc tác HMG-CoA reductase dịch đồng thể... thời gian bảo quản Khảo s{t t{c động atorvastatin lên khả ức chế HMG-CoA reductase từ dịch đồng thể enzym Bảng 5: T{c động ức chế HMG-CoA reductase dịch đồng thể atorvastatin Nồng độ atorvastatin