HMG-CoA reductase (HMGR) là enzym chính trong chu trình tổng hợp cholesterol, là đối tượng nghiên cứu các thuốc điều trị rối loạn lipid huyết. Khảo sát tác động ức chế HMGR in silico, in vitro và in vivo của quercetin (Q), chalcon và dẫn chất.
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG ỨC CHẾ HMG-CoA REDUCTASE CỦA QUERCETIN, CHALCON VÀ DẪN CHẤT IN SILICO, IN VITRO VÀ IN VIVO Nguyễn Thị Thanh Huyền, Nguyễn Thị Anh Thư, Phạm Nhị Hà Linh, Trần Thành Đạo, Trần Mạnh Hùng* TÓMTẮT Mở đầu: HMG-CoA reductase (HMGR) enzym chu trình tổng hợp cholesterol, đối tượng nghiên cứu thuốc điều trị rối loạn lipid huyết Mục tiêu: Khảo sát tác động ức chế HMGR in silico, in vitro in vivo quercetin (Q), chalcon dẫn chất Đối tượng phương pháp nghiên cứu: Chuột nhắt chủng Swiss albino, đực, trọng lượng 25 ± 2g sử dụng Hai mươi hợp chất gồm Q, chalcon dẫn chất cung cấp Viện Cơng Nghệ Hóa Học Bộ mơn Hóa Dược, ĐH Y Dược TP Hồ Chí Minh Docking thực phần mềm LeadIT, cấu trúc 3D vẽ phần mềm Sybyl-X1.1 phân tích kết docking phần mềm FlexX Tác động ức chế HMGR in vitro in vivo tiến hành theo KIT Sigma Aldrich đánh giá mơ hình gây tăng lipid huyết tyloxapol Kết quả: Có 17 chất docking thành cơng vào vùng hoạt động HMGR Các chất có liên kết với Arg B590 vùng hoạt động có tác động ức chế HMGR in vitro Chín chất có khả ức chế HMGR gồm Q, Q1, Q3, Q4, Q5; Ca, Ce, Ck, Cm; chất ức chế HMGR với IC50 tương ứng 11,2 g/ml (Q3), 3,94 g/ml (Q5), 13,65 g/ml (Ca) 5,28 g/ml (Ce) Q3 liều 50 mg/kg 100 mg/kg, Ce liều 125 mg/kg 200 mg/kg có tác động hạ cholesterol huyết khơng có tác động hạ triglycerid huyết Kết luận: Quercetin, chalcon số dẫn chất có khả tương tác với HMGR in silico, thể tác động ức chế HMGR in vitro in vivo Từ khóa: Quercetin, HMG-CoA reductase, docking, tyloxapol, chuột nhắt ABSTRACT STUDY ON INHIBITORY EFFECTS OF QUERCETIN, CHALCONE AND THEIR DERIVATIVES ON HMG-CoA REDUCTASE IN SILICO, IN VITRO AND IN VIVO Nguyen Thi Thanh Huyen, Nguyen Thi Anh Thu, Pham Nhi Ha Linh, Tran Thanh Dao, Tran Manh Hung * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol 23 - No 2- 2019: 574 – 581 Background: HMG-CoA reductase (HMGR) is a key enzyme in biosynthesis of cholesterol and a studying object for develope of anti-dyslipidemia drugs Aim of the study: To investigate binding capacity of quercetin (Q), chalcone and its derivatives on HMGR in a docking model * Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: PGS.TS Trần Mạnh Hùng ĐT: 0937746596 574 Email: manhhung@ump.edu.vn Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học Methods: Male Swiss albino mice weighting 25 g were used Twenty substances including Q, chalcone and 18 derivatives were provided by Institute of Chemical Technology and department of Pharmaceutical Chemistry, HCM University of Medicine and Pharmacy Docking was performed on LeadIT software, 3D structure was illustrated by Sybyl-X1.1 software and analyzed by Conj Grad method and FlexX software Inhibitory effects of Q, chalcone and its derivatives on HMGR in vitro was evaluated by Sigma Aldrich KIT Inhibition of HMGR in vivo was determined via serum cholesterol in tyloxapolinduced hypercholesteremia mice Results: Seventeen substances were successfully docked into the active site of HMGR Substances showing interaction with Arg B590 in the active site, exerted HMGR inhibitory effect in vitro Nine substances, namely Q, Q1, Q3, Q4, Q5, Ca, Ce, Ck and Cm inhibited HMGR in vitro, of those Q3, Q5, Ca and Ce showed significantly inhibitory effects with IC50 of 11.2 g/ml (Q3), 3.94 g/ml (Q5), 13.65 g/ml (Ca) and 5.28 g/ml (Ce) Q3 at doses of 50 mg/kg and 100 mg/kg and Ce at doses of 125 mg/kg and 200 mg/kg exerted cholesterol-lowering action in tyloxapol-induced hyperlipidemia but not for triglyceride Conclusion: Quercetin, chalcone and its derivatives were able to interact with HMGR in silico and showed inhibitory effects on HMGR in vitro and in vivo Key words: Quercetin, HMG-CoA reductase, docking, tyloxapol, mouse ĐẶTVẤNĐỀ Rối loạn lipid huyết nguyên nhân gây xơ vữa động mạch HMG-CoA reductase (HMGR) enzym xúc tác đóng vai trò then chốt chu trình tổng hợp cholesterol, đối tượng nghiên cứu chủ yếu điều trị rối loạn lipid huyết Dự phòng điều trị rối loạn lipid huyết thuốc có nguồn gốc dược liệu ngày quan tâm Gần đây, số nghiên cứu quercetin chứng minh quercetin có tác động làm giảm tích tụ lipid gan chuột thực nghiệm(4); làm giảm peroxyd hóa lipid nồng độ lipid huyết chuột(1); cải thiện chuyển hóa glucose lipid mơ hình chuột bị rối loạn chuyển hóa(6) Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu cơng bố tác động ức chế HMGR quercetin, chalcon dẫn chất Đề tài định hướng nghiên cứu tác động ức chế HMGR quercetin, chalcon số dẫn chất với mục tiêu sau “Khảo sát khả gắn kết với HMGR tác động ức chế HMGR quercetin, chalcon dẫn chất mơ hình docking in silico, in vitro in vivo Chuyên Đề Dược ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU Động vật thử nghiệm Chuột nhắt chủng Swiss albino tuần tuổi, giống đực, thể trọng 25 ± 2g, khỏe mạnh, cung cấp Viện Pasteur TP Hồ Chí Minh sử dụng Hóa chất thuốc thử nghiệm Quercetin dẫn chất (Q, Q1, Q2, Q3, Q4, Q5, Q6, Q7, Q8, Q9) 10 dẫn chất chalcon (Ca, Cb, Cc, Cd, Ce, Cf, Cg, Ch, Ck, Cm) cung cấp Viện Cơng Nghệ Hóa Học TP Hồ Chí Minh Bộ mơn Hóa Dược – Đại Học Y Dược TP Hồ Chí Minh Độ tinh khiết cấu trúc hóa học dẫn chất kiểm tra phương pháp sắc ký lớp mỏng, phổ UV, phổ IR, phổ 1H-NMR trước đưa vào thử nghiệm với yêu cầu: độ tinh khiết > 95%; có đỉnh hấp thu UV đặc trưng nằm dãy: 310-350 nm, 250-280 nm; phổ IR cho thấy có mặt đỉnh đặc trưng nhóm chức phân tử nhóm -OH, -CH, -C=O, -C=C, -C-O-, phổ NMR tương ứng với cấu trúc xác định Cơng thức hóa học mẫu khảo sát sau: quercetin (Q): 3,3’,4’,5,7-pentahydroxy flavon, Q1: 3,3’,4’,5,7pentahydroxy-8-((4-methyl-piperazin-1- 575 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 yl)methyl) flavon, Q2: 3-hydroxy-3’,4’,5,7tetramethoxy flavon, Q3: 5-hydroxy-3,3’,4’,7tetraallyloxy flavon, Q4: 3,3’,4’,5,7pentahydroxy-8-(morpholin-1- ylmethyl) flavon, Q5: 3,3’,4’,5,7-pentapropioyloxy flavon, Q6: 3,3’,4’,5,7-pentamethoxy flavon, Q7: 3,3’,4’,7tetrakis(N-n-butylcarbamoyloxy)5-hydroxy flavon, Q8: 3,3’,4’,5,7-pentaacetoxy flavon, Q9: 3,3’,4’,5,7-pentahydroxy-6,8-bis(pyrolidin1ylmethyl) flavon, Ca (3-(furan-2-yl)-1-(pyridin-2yl) propen-1-on), Cb (1-(furan-2-yl)-3-(pyridin-3yl)propen-1-on, Cc (E)-1-(furan-2-yl)-3-(3hydroxyphenyl)prop-2-en-1-on, Cd (E)-1(pyridin-2-yl)-3-(pyridin-4-yl)prop-2-en-1-on, Ce (E)-3-(pyridin-3-yl)-1-(thiophen-2-yl)prop-2-en1-on, Cf (E)-1-(pyridin-2-yl)-3-(thiophen-2yl)prop-2-en-1-on, Cg (E)-3-(furan-2-yl)-1(thiophen-2-yl)prop-2-en-1-on, Ch (E)-3(pyridin-4-yl)-1-(thiophen-2-yl)prop-2-en-1-on, Ck (E)-1-(2,4-dihydroxy-5-(morpholinomethyl) phenyl)-3-(pyridin-3-yl)prop-2-en-1-on Cm (E)-1-benzyl-3-(3-(4-(benzyloxy)-2hydroxyphenyl)-3-oxoprop-1-en-1-yl)pyridin-1ium iodid Bộ Kit thử hoạt tính HMGR SigmaAldrich, bảo quản nhiệt độ -70oC lượng phương pháp Conj Grad với điểm dừng thay đổi lượng 0,0001 kcal.mol-1, số bước lặp lại tối đa 10.000 bước Ứng dụng phương pháp động lực học phân tử để thu cấu dạng lượng thấp Docking phối tử vào mục tiêu tác động Docking phần mềm LeadIT 2.0.2 Số kết tối đa cho bước lặp 1000, cho phân mảnh phối tử 200, giữ lại 10 cấu dạng tốt phân tử hợp chất phức hợp gắn kết để phân tích Cấu dạng tốt cấu dạng có điểm số docking âm Docking lại phối tử đồng kết tinh Docking lại phối tử đồng kết tinh cấu trúc tinh thể protein để đánh giá mức độ phù hợp Phân tích kết docking Phân tích tương tác phối tử với mục tiêu tác động: liên kết hydro, tương tác π-π, cation-π, tương tác Val der Waals… (phần mềm FlexX) Chọn chất có điểm số tương đối tốt để thử nghiệm in vitro để tìm mối liên quan cấu trúc tác dụng Bộ kit định lượng triglycerid, cholesterol huyết tương Human Co., Đức Hóa chất, thuốc thử khác đạt tiêu chuẩn thí nghiệm Mơ hình docking phân tử quercetin dẫn chất quercetin HMGR Lựa chọn, chuẩn bị cấu trúc mục tiêu tác động Sử dụng ngân hàng sở liệu protein (PDB) để tìm cấu trúc nhiễu xạ tinh thể tia X HMGR người, có phối tử đồng kết tinh thuốc nhóm statin, có độ phân giải cao Chuẩn bị cấu trúc phối tử Tập hợp cấu trúc phối tử xây dựng từ chất tổng hợp tài liệu tham khảo Cấu trúc 3D vẽ phần mềm Sybyl–X 2.0 sau tối thiểu hóa 576 Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Khảo sát tác động ức chế HMGR in vitro quercetin, chalcon dẫn chất Hoạt tính HMGR xác định cách đo độ giảm hấp thu NADPH bước sóng 340 nm (mỗi 15 giây phút) theo phản ứng xảy với xúc tác HMGR sau(3): HMG-CoA + 2NADPH + 2H → mevalonat + 2NADP+ + CoA-SH + Hoạt độ enzym tính theo cơng thức sau: Trong đó: 12,44 = εmM – độ hấp thu NADPH 6,22 mM1 cm-1; 12,44 = NADPH tiêu thụ TV = Tổng thể tích phản ứng (1 ml đo ống đo 0,2 ml đo đĩa) V = thể tích enzym sử dụng định lượng (ml) 0,6 = Nồng độ enzym tính mg-protein (mgP)/ml (0,50-0,70 mgP/ml) LP = độ dài đường truyền tính cm (1 ống đo 0,55 đĩa) Khi thêm vào hỗn hợp phản ứng chất ức chế HMGR (pravastatin chất thử nghiệm), mức độ phản ứng xảy thấp làm độ hấp thu tăng lên so với khơng có chất ức chế Khả ức chế HMGR chất thử nghiệm tính theo cơng thức: Nghiên cứu Y học DMSO 5% 0,1 ml/10g/ngày (DMSO dùng để hòa tan chất thử nghiệm) - Lơ Tyloxapol 250 mg/kg: IV dung dịch tyloxapol liều 250 mg/kg, sau uống nước 0,1 ml/ngày - Lơ Atorvastatin 64 mg/kg: IV tyloxapol 250 mg/kg, sau uống atorvastatin 64 mg/kg/ngày - Các lô điều trị: IV tyloxapol 250 mg/kg, sau uống chất thử nghiệm với liều khác Sau 24 IV tyloxapol, lấy máu tĩnh mạch đuôi chuột định lượng cholesterol, triglycerid Phương pháp định lượng cholesterol triglycerid huyết nồng độ Định lượng cholesterol triglycerid theo nguyên tắc enzym màu theo KIT Human Co KẾTQUẢ Docking phân tử atorvastatin, quercetin, chalcon dẫn chất HMGR Trong 19 cấu trúc nhiễu xạ tinh thể tia X có 13 protein khơng có phối tử đồng kết tinh (PDB code: 3CCT, 3CCW, 3CCZ, 3CD0, 3CD5, 3CD7, 3CDA, 3CDB, 2R4F, 3BGL, 2Q1L, 2Q6B, 2Q6C) protein có phối tử đồng kết tinh: mevastatin (1HW8), simvastatin (1HW9), fluvastatin (1HWI), cerivastatin (1HWJ), atorvastatin (1HWK) Chất thử nghiệm hòa tan DMSO 5% thử nồng độ khác (sàng lọc) tối thiểu nồng độ khác (xác định IC50) Ảnh hưởng DMSO lên hoạt tính HMGR kiểm tra trước đánh giá tác động ức chế enzym chất khảo sát Khảo sát tác động dẫn chất tiềm mơ hình tăng lipid cấp tyloxapol Chuột sau ổn định, cho nhịn đói tối thiểu chia ngẫu nhiên thành lô: - Lô chứng: tiêm IV dung dịch NaCl 0,9% (0,1 ml/10 g chuột) Sau đó, chuột uống Chuyên Đề Dược rosuvastatin (1HWL) Dựa vào cấu trúc protein mục tiêu nghiên cứu (ức chế HMGR người in vitro, in vivo với chất đối chiếu pravastatin atorvastatin), có HMGR 1HWK đáp ứng yêu cầu Docking 20 chất nghiên cứu atorvastatin protein HMGR 1HWK cho kết có 17 hợp chất dock vào vùng tác động HMGR với điểm số docking từ -30,38 kJ/mol đến -4,23 kJ/mol Có hợp chất không tương tác với HMGR (bảng 1) 577 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học Bảng 1: Kết docking enzym HMGR 1HWK STT Công thức Điểm docking(kJ/mol) Liên kết hydro Q -24,79 Asp B690, Lys B691, Asn A755, GluA559, Cys A561, Ser B684, Lys A735 Q1 -30,38 Lys B691, Asn A755, Ala A751, Ser B684, Glu A559 Q2 -15,97 Asn B658, Lys B691 Q3 -4,23 Arg B590, Ser A565 Q4 -25,55 Asn B658, Lys B691, Gly A560, Arg B590, Glu A559 Q5 -14,14 Arg A568, Asn A755, Lys B691, Arg B590, Ser B684 Q6 -13,80 Ser A565, Lys B691 Ca -20,083 Lys B691, Arg B590 (π-cation) Cb -18,236 Lys A735, Arg B590 (π-cation) 10 Cc -18,235 Glu A559, Asn A755, Lys B691, Arg B590 (π-cation) 11 Cd -17,710 Lys A735, Arg B590 12 Ce -21,177 Lys A735, Arg B590 (liên kết hydro π-cation) 13 Cf -16,139 Asn A755 14 Cg -16,946 Arg B590, Lys B692 (π-cation) 15 Ch -17,627 Asn A755, Lys A735, Ser B684, Lys B591, Arg B590 Lys A735, Arg B590 (π-cation) 16 Ck 17 Cm 18 Atorvastatin 19 Pravastatin -18,293 -18,926 -39,725 -35,353 Glu A559, Lys A735, Asp B690, ArgB590, Lys B691 (π-cation), Arg B590 (π-cation) Lys B591, Lys B592 Ser A565, Glu A59, Asn A755, Asp B690, Lys A735, Arg B590, Ser B684 Lys A735, Glu A559, Asn A755, Lys B691, Asp B690, Arg B590, Ser B684, Lys B692 Hình 1: Docking lại phối tử đồng kết tinh atorvastatin (Ator) HMGR 1HWK (A) tương tác Q1 (B), Q3 (C), Ce (D) với acid amin HMGR 1HWK 578 Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Các hợp chất Q1, Q4, Q, Ca, Ce (< -20 KJ/mol) hợp chất tương tác mạnh; Q2, Q5, Q6, Cb, Cc, Cf, Cg, Ch, Ck, Cm (-20 KJ/mol-