Nghiên cứu xây dựng công thức và quy trình bào chế viên nang cứng nattokinase

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH - HUỲNH VĂN HẬU NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG CƠNG THỨC VÀ QUY TRÌNH BÀO CHẾ VIÊN NANG CỨNG NATTOKINASE LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Tp Hồ Chí Minh – Năm 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH HUỲNH VĂN HẬU NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG CƠNG THỨC VÀ QUY TRÌNH BÀO CHẾ VIÊN NANG CỨNG NATTOKINASE LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Chuyên ngành: Công nghệ dược phẩm bào chế thuốc Mã số: 60 72 04 02 Hướng dẫn khoa học: PGS.TS TRẦN CÁT ĐƠNG Thành phố Hồ Chí Minh – 2017 Lời Cam Đoan Tơi cam đoan cơng trình nghiên cứu Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Huỳnh Văn Hậu Lời cảm ơn Đầu tiên, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Thầy hướng dẫn tôi, PGS.TS.Trần Cát Đông Cảm ơn Thầy nhận, hướng dẫn truyền đạt kiến thức để thực đề tài Trân trọng cảm ơn TS Vũ Thanh Thảo, cô Nguyễn Thị Linh Giang tận tụy việc tạo điều kiện hướng dẫn q trình thực đề tài Cảm ơn mơn Bào chế hỗ trợ nhiều trang thiết bị máy móc Cảm ơn cán bộ, viên chức môn Vi sinh – ký sinh, môn Bào chế chia sẻ động viên trình học tập làm đề tài trường Cảm ơn gia đình, bạn bè đồng nghiệp tơi khuyến khích tơi suốt thời gian qua Mục Lục ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan Nattokinase 1.1.1 Lịch sử, khái niệm 1.1.2 Đặc điểm, tính chất lý hóa 1.1.3 Cơ chế q trình đông máu 1.1.4 Tác dụng sinh học 1.1.5 Tác dụng dược lý 1.1.6 Một số dạng bào chế phẩm natto nattokinase thị trường 1.1.7 Liều lượng, cách dùng 1.1.8 Các thử nghiệm lâm sàng nattokinase 1.2 Tổng quan viên nang cứng 1.2.1 Ưu, nhược điểm viên nang cứng 10 1.2.2 Cấu trúc chế hoạt động viên nang cứng 10 1.2.3 Các loại tá dược viên nang cứng 12 1.3 Kỹ thuật bào chế viên nang cứng 14 1.3.1 Phương pháp đóng thuốc khơng qua xát hạt 14 1.3.2 Phương pháp đóng thuốc qua xát hạt 14 1.4 Các nghiên cứu bào chế nattokinase Chương NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 16 2.1 Nguyên liệu tá dược 16 2.2 Trang thiết bị 17 2.3 Phương pháp nghiên cứu 18 2.3.1 Phương pháp định lượng hoạt tính enzym 18 2.3.2 Thẩm định quy trình định lượng nattokinase nguyên liệu 21 2.3.3 Thẩm định quy trình định lượng nattokinase viên nang cứng 23 2.3.4 Khảo sát ảnh hưởng tá dược đến hoạt tính nattokinase 23 2.3.5 Đánh giá công thức bào chế thử nghiệm 29 2.3.6 Bào chế viên nang cứng chứa nattokinase 31 2.3.7 Tối ưu hóa công thức 34 2.3.8 Nâng cỡ lô 300 viên 35 2.3.9 Đánh giá tiêu chất lượng viên nang cứng nattokinase 35 2.3.10 Theo dõi độ ổn định 36 Chương KẾT QUẢ 3.1 Thẩm định quy trình định lượng nattokinase nguyên liệu 37 37 3.1.1 Tính tuyến tính 37 3.1.2 Tính xác 39 3.1.3 Độ 39 3.2 Thẩm định quy trình định lượng nattokinase viên nang 40 3.3 Khảo sát ảnh hưởng tá dược đến hoạt tính nattokinase 41 3.3.1 Khảo sát tá dược tạo màng bảo vệ hoạt chất nattokinase 41 3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng tá dược đến hoạt tính nattokinase 42 3.4 Bào chế viên nang cứng chứa nattokinase 44 3.5 Khảo sát tỉ lệ tá dược viên 46 3.5.1 Saccharose 46 3.5.2 Tá dược trơn, bóng 46 3.5.3 Tá dược rã 47 3.6 Tối ưu hóa cơng thức 47 3.7 Khảo sát đặc tính lô H1, H2, H3, lô 300 viên 51 3.8 Kết theo dõi độ ổn định Chương BÀN LUẬN 54 58 4.1 Xây dựng thẩm định quy trình định lượng nattokinase nguyên liệu viên nang cứng 58 4.2 Xây dựng công thức bào chế viên nang nattokinase 58 4.3 Khảo sát tá dược tạo màng bảo vệ 59 4.4 Khảo sát tá dược độn 59 4.4.1 Khảo sát ảnh hưởng saccharose 60 4.4.2 Khảo sát tỉ lệ tá dược trơn, bóng 60 4.4.3 Khảo sát tỉ lệ tá dược rã 60 4.5 Tối ưu hóa cơng thức 61 4.6 Đánh giá tính chất viên nang cứng nattokinase 61 4.7 Theo dõi độ ổn định 62 Chương KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63 5.1 KẾT LUẬN 63 5.2 KIẾN NGHỊ 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO 65 PHỤ LỤC 68 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Sự phân chia kích thước vỏ nang cứng theo thể tích, khối lượng riêng 11 Bảng 2.1 Danh mục tá dược 16 Bảng 2.2 Danh sách trang thiết bị dùng bào chế kiểm nghiệm 17 Bảng 2.3 Tiêu chuẩn đánh giá tính trơn chảy dựa vào góc nghỉ 30 Bảng 2.4 Giới hạn chênh lệch khối lượng trung bình 30 Bảng 3.1 Khảo sát sơ tương quan nồng độ độ hấp thu 37 Bảng 3.2 Tương quan nồng độ độ hấp thu 37 Bảng 3.3 Kết khảo sát độ xác 39 Bảng 3.4 Kết khảo sát độ 39 Bảng 3.5 Các thông số bào chế kết hoạt tính cơng thức thử nghiệm 42 Bảng 3.6 Các thông số khảo sát đóng nang 44 Bảng 3.7 Các thông số bào chế đóng nang 45 Bảng 3.8 Một số đặc tính viên với tỉ lệ saccharose khác 46 Bảng 3.9 Một số đặc tính viên với tỉ lệ magnesi khác tỉ lệ talc % 46 Bảng 3.10 Một số đặc tính viên với tỉ lệ croscarmellose khác 47 Bảng 3.11 Loại tá dược mức cần khảo sát 47 Bảng 3.12 Mô hình cơng thức kết định lượng hoạt tính pH 48 Bảng 3.13 Phân tích phương sai mơ hình đáp ứng theo RSM 49 Bảng 3.14 Kết đánh giá mô hình tối ưu thực nghiệm 50 Bảng 3.15 Thành phần công thức khối lượng 51 Bảng 3.16 Kết đánh giá chất lượng lô H1, H2, H3 53 Bảng 3.17 Kết theo dõi độ ổn định mẫu nguyên liệu theo thời gian 54 Bảng 3.18 Kết theo dõi độ ổn định mẫu thành phẩm theo thời gian 55 Bảng 3.19 Tóm tắt kết theo dõi độ ổn định hoạt tính nguyên liệu viên nang nattokinase 56 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Công thức cấu tạo nattokinase Hình 1.2 Ảnh hưởng sinh lý nattokinase fibrin Hình 3.1 Đồ thị tương quan nồng độ độ hấp thu nattokinase 38 Hình 3.2 Phổ hấp thu hỗn hợp tá dược 40 Hình 3.3 Phổ hấp thu vỏ nang rỗng 41 Hình 3.4 Kết ảnh hưởng MCC 101, mannitol đến hoạt tính enzym 50 Hình 3.5 Một số viên thành phẩm 52 Hình 5.1 Hình ảnh kiểm tra chất ức chế Escherichia coli 69 Hình 5.2 Hình ảnh kiểm tra chất ức chế Salmonella 69 Hình 5.3 Hình ảnh kiểm tra chất ức chế Staphylococcus 69 Hình 5.4 Hình ảnh kiểm tra chất ức chế Pseudomonas aeruginosa 69 Hình 5.5 Hình ảnh kiểm tra tổng số vi khuẩn hiếu khí 70 Hình 5.6 Hình ảnh kiểm tra Staphylococcus aureus (thạch muối mannitol) 70 Hình 5.7 Hình ảnh kiểm tra Pseudomonas aeruginosa (thạch centrimid) 70 Hình 5.8 Hình ảnh ria lên mơi trường MacConkey để tìm E coli 71 Hình 5.9 Hình ảnh cấy ria mẫu H3 lên mơi trường EMB 71 Hình 5.10 Hình ảnh kiểm tra Salmonella (thạch Bismuth sulfit) 71 Hình 5.11 Hình ảnh kiểm tra Enterobacteria (muối mật violet-red) 72 Hình 5.12 Hình ảnh kiểm tra tổng số nấm men, mốc 72 Hình 5.13 Hình ảnh điện di protein mẫu nattokinase 72 4.4.1 Khảo sát ảnh hưởng của saccharose Sự có mặt saccharose cơng thức ảnh hưởng nhiều đến người bị đái tháo đường Cần phải hạn chế lượng saccharose mức thấp Qua nghiên cứu mức saccharose/viên khác (5 % - 10 % - 15 %) khơng thấy ảnh hưởng đến hoạt tính enzym Vậy việc chọn lượng saccharose thấp (5 %) hợp lý Thêm nữa, cơng thức có saccharose giúp việc tạo hạt tốt hơn, qua giúp q trình đóng nang ổn định 4.4.2 Khảo sát tỉ lệ tá dược trơn, bóng Tá dược trơn, bóng mục đích giúp cho khối bột, hạt dễ dàng đóng vào nang, khơng gây dính máy qua giúp đảm bảo độ đồng khối lượng hoạt tính viên lơ Việc sử dụng tá dược trơn, bóng có nhược điểm gây cản trở thời gian rã viên nang Magnesi stearate (1 %) aerosil (0,5 %) dùng công thức ban đầu, tá dược trơn bóng thơng thường hay sử dụng viên nén viên nang Nhưng đặc tính dính nattokinase khối lượng nattokinase viên nhiều, thêm nattokinase không xát hạt nên dẫn đến độ trơn chảy khối hạt thấp Nghiên cứu với việc tăng tỉ lệ magnesi stearate lên %, đồng thời thêm talc % vào công thức làm tốc độ chảy khối hạt tăng lên, thời gian rã viên khơng có tăng lên đáng kể 4.4.3 Khảo sát tỉ lệ tá dược rã Tùy vào chất tá dược rã mà có lựa chọn khác phù hợp với đặc tính sản phẩm Croscarmellose có chất dẫn xuất cellulose phù hợp với đặc tính nattokinase Tá dược rã giúp viên rã nhanh hơn, qua giúp viên dễ dàng hòa tan kiểm tra độ hòa tan Khi nâng tỉ lệ croscarmellose từ 3,5 % lên 8,5 % có cải thiện nhẹ độ rã Tuy nhiên chúng tơi nhận thấy khơng có ý nghĩa cải thiện độ rã Vì vậy, lựa chọn tỉ lệ tá dược rã mức thấp (3,5 %) mà đáp ứng yêu cầu phù hợp Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn trích dẫn 60 Ở mức độ rã viên vào khoảng 14 phút 4.5 Tối ưu hóa cơng thức Các tá dược độn lựa chọn để tối ưu hóa calci carbonate, cellulose vi tinh thể mannitol Việc sử dụng phần mềm design expert 7.0 giúp đưa mơ hình cơng thức để tiến hành thực nghiệm Thông qua phần mềm thực nghiệm, tỉ lệ calci carbonate (25 %), cellulose vi tinh thể (25 %) mannitol (35 %) lựa chọn Tỉ lệ giúp cho pH viên thành phẩm đạt mong muốn (8,5 ± 0,5), nattokinase ổn định pH từ - nên việc tạo pH thích hợp cần thiết để đảm bảo ổn định viên nang, đồng thời giúp viên thành phẩm có khả giảm tác động acid dày 4.6 Đánh giá tính chất viên nang cứng nattokinase Đề tài đánh giá tiêu viên nang cứng nattokinase dựa vào tiêu chí dược điển Việt Nam IV Bên cạnh đó, sản phẩm chứa enzym nên phải hạn chế có mặt phát triển vi sinh vật Việc hạn chế cần thiết sản xuất quy mơ lớn, vi sinh vật phát triển gây tiêu hủy enzym làm viên thành phẩm không đạt tiêu chuẩn chất lượng Trong đề tài, tiêu vi sinh tổng số vi khuẩn hiếu khí cao 43 cfu/g (so với chuẩn: < 5.104 cfu/g), tổng số nấm men, mốc cao 38 cfu/g (so với chuẩn: < 500 cfu/g), enterobacteria dường không xuất (so với chuẩn: < 500 cfu/g) Qua chứng tỏ việc sử dụng ethanol 70 % để xử lý mơi trường phịng pha chế cần thiết Chỉ tiêu độ rã theo yêu cầu < 30 phút, thực tế viên đề tài độ rã cao < 15 phút Giới hạn hoạt tính đề tài đưa 90 % – 120 % Đây khoảng giới hạn rộng, phù hợp sản phẩm chứa enzym thường bền so với thuốc hóa dược giới hạn hoạt tính giúp sản phẩm tồn lâu đem đến giá trị sử dụng nhiều Về tiêu định tính, phải có phản ứng tiêu hủy fibrin Thơng thường để thực phản ứng này, nghiên cứu trước thường đo vòng tan máu đĩa fibrin [15] Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn trích dẫn 61 Tuy nhiên, phản ứng định lượng hoạt tính nattokinase bao gồm phản ứng tiêu sợi fibrin Đã có tăng độ hấp thu thời gian mẫu thử so với mẫu trắng nên chứng tỏ có phản ứng tiêu hủy fibrin, đề tài khơng thực việc đo vịng tan máu đĩa fibrin Thông qua phản ứng định lượng để khẳng định ln phản ứng định tính 4.7 Theo dõi độ ổn định Theo dõi độ ổn định nguyên liệu viên nang cứng nattokinase điều kiện khác (nhiệt độ mát °C – °C; nhiệt độ thường 30 °C ± °C, độ ẩm 75 % ± %; nhiệt độ 40 °C ± 0,5 °C, độ ẩm 75 % ± %) Mặc dù thời gian theo dõi hạn chế, đề tài khẳng định nguyên liệu nattokinase bị hoạt tính sau tháng điều kiện 40 °C ± 0,5 °C, độ ẩm 75 % ± % Có giảm nhẹ hoạt tính mẫu nguyên liệu điều kiện 30 °C ± °C, độ ẩm 75 % ± % Đối với mẫu viên nang nattokinase, nhiệt độ 40 °C ± 0,5 °C có sụt giảm hoạt tính từ 113,17 % xuống cịn 92,35 %, chưa thể khẳng định điều Cần thêm thời gian để rút kết luận Hiện sau tháng, sơ hoạt tính nằm khoảng cho phép Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn trích dẫn 62 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Đã thẩm định quy trình định lượng nattokinase nguyên liệu viên nang cứng phương pháp quang phổ UV-Vis đạt tính tuyến tính, độ đúng, độ xác Đã khảo sát tìm tá dược khơng có ảnh hưởng đến hoạt tính nattokinase quy trình bào chế viên nang nattokinase: - Sử dụng tá dược thân dầu thân nước tạo lớp bao phủ mỏng bên nattokinase sáp ong, sáp carnauba, paraffin, hydroxyl propyl methyl cellulose 606 không khả thi - Tá dược nên sử dụng: calci carbonate, cellulose vi tinh thể 101, mannitol, saccharose, talc, magnesi stearate, aerosil, povidon k30, croscarmellose - Tá dược không nên sử dụng: tinh bột bắp, lactose, natri starch glycolate - Phương pháp bào chế: xát hạt phần, không xát hạt ướt nattokinase Cải thiện độ chảy khối bột, hạt cách trộn nattokinase với tá dược trơn bóng trước giai đoạn trộn hoàn tất Đã bào chế 900 viên nang cứng số chứa nattokinase có khối lượng viên 347 mg đạt tiêu chuẩn theo DĐVN IV độ đồng khối lượng, độ rã, độ hòa tan, định tính, định lượng (90 % - 120 %) pH (8,5 ± 0,5) Đã theo dõi độ ổn định nguyên liệu nattokinase viên nang cứng chứa nattokinase tháng điều kiện khác - Nguyên liệu nattokinase điều kiện 40 °C ± 0,5 °C, độ ẩm 75 % ± % bị hoạt tính - Viên nang cứng chứa nattokinase đạt tiêu chuẩn cho phép Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn trích dẫn 63 5.2 KIẾN NGHỊ - Nghiên cứu tạo pellet chứa nattokinase phương pháp phun đông lạnh - Nghiên cứu sử dụng vỏ nang tan ruột để bào chế viên nang tan ruột với công thức nghiên cứu - Tiếp tục theo dõi độ ổn định điều kiện Đặc biệt điều kiện nhiệt độ phòng 30 °C ± °C, độ ẩm tương đối 75 % ± % tối thiểu lô tháng Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn trích dẫn 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT [1].Hội đồng dược điển, Bộ y tế, (2009), Dược điển Việt Nam IV, Nxb Y học, PL 11, PL 13, PL 20 [2].Bộ mơn hóa phân tích – kiểm nghiệm (2009), Giáo trình kiểm nghiệm dược phẩm, Khoa dược, đại học y dược TP Hồ Chí Minh, tr 86-117 [3].Đặng Văn Giáp (2002), Thiết kế tối ưu hóa cơng thức quy trình, Tp Hồ Chí Minh: Nxb y học, tr 1-97 [4].Trần Thị Thu Hằng (2007), Dược lực học (tái lần 9), TP Hồ Chí Minh, NXB Phương Đông, tr 535-545 [5].Lê Quan Nghiệm (2011), Giáo trình Bào chế sinh dược học (tập 2), Tp Hồ Chí Minh, Khoa dược, Đại học Y Dược Tp.Hồ Chí Minh, Nxb Y học, tr 279290 [6] Đại học Y Hà Nội (2012), Bệnh học Nội Khoa (tập 1), Hà Nội, Nxb Y học, tr 185 -190 TIẾNG ANH [7].Ashoor S H and J B Zent (1984), “Maillard browning of common amino acids and sugars”, Journal of Food Science 49 (4), pp 1206-1207 [8].Bradley J and Lampe J.C.E (2016), “Toxicological assessment of nattokinase derive from Bacillus subtilis var.natto”, Food and Chemical Toxicology 88, pp 87-99 [9].Chang Wei Hsieh, W C L, Wen Ching Hsieh, Yun Peng Huang, Cheng Hung Lai, Wen Ching Ko (2009), “Improvement of the stability of nattokinase using g-polyglutamic acid as a coating material for microencapsulation”, LWT - Food Science and Technology, Volume 42, Issue 1, pp 144-149 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn trích dẫn 65 [10].Chien Hsun Hsia, Ming Ching Shen, Jen-Shiou Lin, Yao Ke Wen, Kai (2009), “Nattokinase decreases plasma levels of fibrinogen, factor VII, and factor VIII in human subjects”, Nutrition Research 29, pp 190–196 [11].Empty Capsule Size Chart: https://www.capsuline.com/empty-capsule-sizechart Date of access 12 december 2016 [12].Fujita M et al (1995), “Thrombolytic effect of nattokinase on a chemically induced thrombosis model in rat”, Biol Pharm Bull 18, pp 1387–1391 [13].Fujita M, H K, Ito Y, Misawa S, Takeuchi N, Kariya K, Nishimuro S (1995), “Transport of nattokinase across the rat intestinal tract”, Biol Pharm Bull 18, pp 1194–1196 [14].Haritha Meruvu, M V (2011), “Nattokinase :A Review on Fibrinolytic Enzym” International journal of chemical, environmental and pharmaceutical research, pp 673-679 [15].Herbert A Perkins and Mary R Rolfs (1973), “Quantitative Assay of Fibrinogen and Fibrinolytie Activity”, Blood 22 (4), pp 485-498 [16].ICH (1995), “Stability testing of biotechnological/ biological products" Q5C Vol Current Step 4version [17].Kazuya O, Shigeo I, Kenichi S (2006), “An oral safety study of nattokinase containing food, Natural Super Kinase II: a randomized, placebo controlled, double blind study”, Progress in Medicine, 26, pp 1137-1148 [18].Kim J Y et al (2008), “Effects of Nattokinase on blood pressure: a randomized controlled trial”, Hypertens res, 31, pp 1583 – 1588 [19].Kurosawa Y et al (2015), “A single-dose of oral nattokinase potentiates thrombolysis and anti-coagulation profiles”, Sci Rep 5, pp.11601 - 11605 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn trích dẫn 66 [20].Law D and Zhang Z (2007), “Stabilization and target delivery of Nattokinase using compression coating”, Drug development and industrial pharmacy, 33 (5), pp 495-503 [21].Masada M (2004), “Determination of the thrombolytic activity of Natto extract” Food style, (1) pp 92-95 [22].Nakamura T, Youhei Yamagata and Eiji Ichishima (1992), “Nucleotide sequence of the subtilisin NAT gene, aprN, of Bacillus subtilis (natto)”, Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 56 (11), pp 1869-1871 [23].Peng Y, Xiaojuan Yang and Yizheng Zhang (2005), “Microbial fibrinolytic enzyms: an overview of source, production, properties, and thrombolytic activity in vivo”, Applied Microbiology and Biotechnology, 69 (2), pp 126 -128 [24].Raymond C Rowe, P J S and M E Q (2009), Handbook of pharmaceutical excipients 6th edition, Pharmaceutical Press, pp 118 – 367 [25].Sumi H, Tsushima H, Mihara H, Murica H (1987), “A novel fibrinolytic enzym (nattokinase) in the vegetable cheese Natto: a typical and popular soybean food in the Japanese diet”, Experientia, 43, pp 1110–1111 [26].Sumi H, K Nakanishi, H Hiratani (1990), “Enhancement of the fibrinolytic activity in plasma by oral administration of Nattokinase”, Acta Haemotol 84, pp 139–140 [27].UranoT, I H, Umemura K, Suzuki Y, Oike M, Akita S, Tskamoto Y, Suzuki I, Takada A (2001), “The profibrinolytic enzym subtilisin NAT purified from Bacillus subtiliscleaves and inactivates plasminogen activator inhibitor type 1”, J Biol Chem, 276, pp 24690-24696 [28].Yanagisawa, Yasuhide et al (2010),"Purification, crystallization and preliminary X-ray diffraction experiment of nattokinase from Bacillus subtilis natto", Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications, 66 (12), pp 1670-1673 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn trích dẫn 67 PHỤ LỤC PL Kết kiểm tra tiêu vi sinh lô H1, H2, H3 PL 2: Hình ảnh nattokinase nguyên liệu bột, hạt viên thành phẩm theo dõi độ ổn định Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn trích dẫn 68 PL Kết kiểm tra tiêu vi sinh của lô H1, H2, H3 Chứng Mẫu H1 Mẫu H2 Mẫu H3 Hình 5.1 Hình ảnh kiểm tra chất ức chế Escherichia coli Kết luận: chất ức chế Escherichia coli Chứng Mẫu H1 Mẫu H2 Mẫu H3 Hình 5.2 Hình ảnh kiểm tra chất ức chế Salmonella Kết luận: khơng có chất ức chế Salmonella Chứng Mẫu H1 Mẫu H2 Mẫu H3 Hình 5.3 Hình ảnh kiểm tra chất ức chế Staphylococcus Kết luận: khơng có chất ức chế Staphylococcus Chứng Mẫu H1 Mẫu H2 Mẫu H3 Hình 5.4 Hình ảnh kiểm tra chất ức chế Pseudomonas aeruginosa Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn trích dẫn 69 Kết luận: khơng có chất ức chế Pseudomonas aeruginosa Hình 5.5 Hình ảnh kiểm tra tổng số vi khuẩn hiếu khí Kết luận: tổng số vi khuẩn hiếu khí lớn có g thành phẩm 43 CFU (đối chiếu với bảng 13.6.1 phụ lục 13.6 DĐVN IV) Chứng Mẫu H1 Mẫu H2 Mẫu H3 Hình 5.6 Hình ảnh kiểm tra Staphylococcus aureus (thạch muối mannitol) Kết luận: khơng có Staphylococcus aureus Chứng Mẫu H1 Mẫu H2 Mẫu H3 Hình 5.7 Hình ảnh kiểm tra Pseudomonas aeruginosa (thạch centrimid) Kết luận: khơng có Pseudomonas aeruginosa Tn thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn trích dẫn 70 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Chứng Mẫu H1 Mẫu H2 Mẫu H3 Hình 5.8 Hình ảnh ria lên mơi trường MacConkey để tìm E coli Kết luận: có khóm mẫu H3 trực khuẩn gram âm Tiếp tục ria lên mơi trường EMB: Chứng Mẫu H3 Hình 5.9 Hình ảnh cấy ria mẫu H3 lên mơi trường EMB Kết luận: khơng có E Coli mẫu H3 Chứng Mẫu H1 Mẫu H2 Mẫu H3 Hình 5.10 Hình ảnh kiểm tra Salmonella (thạch Bismuth sulfit) Kết luận: khơng có Salmonella Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn trích dẫn 71 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Chứng Mẫu H1 Mẫu H2 Mẫu H3 Hình 5.11 Hình ảnh kiểm tra Enterobacteria (muối mật violet-red) Kết luận: khơng có Enterobacteria Hình 5.12 Hình ảnh kiểm tra tổng số nấm men, mốc Kết luận: số lượng nấm lớn có 1g thành phẩm 38 CFU (đối chiếu với bảng 13.6.1 phụ lục 13.6 DĐVN IV) M NL TP kDa 75 63 48 35 25 Hình 5.13 Hình ảnh điện di protein mẫu nattokinase Kết luận: Có xuất protein 25 kDa Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn trích dẫn 72 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL 2: Hình ảnh của nattokinase nguyên liệu bột, hạt của viên thành phẩm theo dõi độ ổn định Già hóa cấp tốc Điều kiện thường Nhiệt độ mát Hình 5.14 Màu sắc nattokinase nguyên liệu sau tháng bảo quản điều kiện khác Già hóa cấp tốc Điều kiện thường Nhiệt độ mát Hình 5.15 Màu sắc nattokinase nguyên liệu sau tháng bảo quản điều kiện khác Già hóa cấp tốc Điều kiện thường Nhiệt độ mát Hình 5.16 Màu sắc nattokinase nguyên liệu sau tháng bảo quản điều kiện khác Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn trích dẫn 73 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM Già hóa cấp tốc Điều kiện thường Nhiệt độ mát Hình 5.17 Màu sắc bột, hạt viên nang nattokinase sau tháng bảo quản điều kiện khác Già hóa cấp tốc Điều kiện thường Nhiệt độ mát Hình 5.18 Màu sắc bột, hạt viên nang nattokinase sau tháng bảo quản điều kiện khác Già hóa cấp tốc Điều kiện thường Nhiệt độ mát Hình 5.19 Màu sắc bột, hạt viên nang nattokinase sau tháng bảo quản điều kiện khác Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn trích dẫn 74 ... pháp bào chế phù hợp cho công thức 1.4 Các nghiên cứu bào chế nattokinase Các nghiên cứu công bố bào chế nattokinase hạn chế, số nghiên cứu gần tóm tắt sau: Law D Zhang Z (2007) nghiên cứu xây dựng. .. bảo vệ sức khỏe Nhận thấy vấn đề nên đề tài ? ?Nghiên cứu xây dựng cơng thức quy trình bào chế viên nang cứng nattokinase? ?? nghiên cứu nhằm xây dựng cơng thức có tiềm năng, đảm bảo chất lượng cho sản... sàng nattokinase 1.2 Tổng quan viên nang cứng 1.2.1 Ưu, nhược điểm viên nang cứng 10 1.2.2 Cấu trúc chế hoạt động viên nang cứng 10 1.2.3 Các loại tá dược viên nang cứng 12 1.3 Kỹ thuật bào chế viên