Nghiên cứu xây dựng công thức bào chế vi cầu amoxicillin kết dính sinh học tại dạ dày

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI TRƢƠNG HỒNG HẠNH NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG CÔNG THỨC BÀO CHẾ VI CẦU AMOXICILLIN KẾT DÍNH SINH HỌC TẠI DẠ DÀY KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI – 2015 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới: TS. Vũ Thị Thu Giang DS. Nguyễn Thị Hoài Thƣơng Những người đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo và động viên giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành khóa luận. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy, các cô, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Bào chế đã nhiệt tình giúp đỡ, hỗ trợ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình làm thực nghiệm tại Bộ môn. Cũng như gửi lời tới các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Y học cơ sở, bộ môn Dược lý, cùng với các anh chị ở Viện Kiểm nghiệm thuốc trung ương đã giúp đỡ tôi rất nhiều để tôi có thể hoàn thành khóa luận này.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRƯƠNG HỒNG HẠNH

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG CÔNG THỨC BÀO CHẾ VI CẦU AMOXICILLIN

KẾT DÍNH SINH HỌC TẠI DẠ DÀY

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2015

KẾT DÍNH SINH HỌC TẠI DẠ DÀY

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới:

TS Vũ Thị Thu Giang

DS Nguyễn Thị Hoài Thương

Những người đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo và động viên giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành khóa luận

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy, các cô, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Bào chế đã nhiệt tình giúp đỡ, hỗ trợ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình làm thực nghiệm tại Bộ môn Cũng như gửi lời tới các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Y học cơ sở, bộ môn Dược lý, cùng với các anh chị ở Viện Kiểm nghiệm thuốc trung ương đã giúp đỡ tôi rất nhiều để tôi có thể hoàn thành khóa luận này

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, các phòng ban, các thầy cô giáo, cán bộ, nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội – những người đã dạy dỗ và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè – những người đã luôn ở bên tôi, chia sẻ động viên tôi trong suốt thời gian vừa qua

Hà Nội, ngày 14 tháng 5 năm 2015

Sinh viên Trương Hồng Hạnh

DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1

1.1 Sinh lý bệnh loét dạ dày –tá tràng liên quan đến Helicobacter pylori 2

1.2 Tổng quan về amoxicillin 3

1.2.1 Công thức hóa học 3

1.2.2 Tính chất lý, hóa học 3

1.2.3 Dược động học 3

1.2.4 Cơ chế tác dụng lên Helicobacter pylori 4

1.2.5 Chỉ định cho diệt Helicobacter pylori 4

1.2.6 Một số biệt dược chứa amoxicillin trên thị trường 4

1.3 Hệ thuốc kết dính sinh học 5

1.3.1 Khái niệm 5

1.3.2 Quá trình và cơ chế kết dính sinh học 5

1.3.3 Polyme kết dính sinh học 6

1.3.4 Một số phương pháp đánh giá khả năng kết dính sinh học áp dụng với vi cầu……… 9

1.4 Một số nghiên cứu về hệ KDSH của Amoxicillin 11

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Nguyên liệu và phương tiện nghiên cứu 15

2.1.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu 15

2.1.3 Thiết bị nghiên cứu 15

2.2 Phương pháp nghiên cứu 16

2.2.1 Xây dựng đường chuẩn định lượng 16

2.2.2 Phương pháp bào chế vi cầu amoxicillin kết dính sinh học 17

2.2.3 Phương pháp đánh giá hiệu suất tạo vi cầu và tỷ lệ vi cầu hóa 18

2.2.4 Phương pháp đánh giá chất lượng vi cầu 18

2.2.4.1 Xác định kích thước tiểu phân và chỉ tiêu mất khối lượng do làm khô 18

2.2.4.2 Đánh giá khả năng trơn chảy của vi cầu 19

2.2.4.3 Định lượng 19

2.2.4.4 Đánh giá khả năng giải phóng amoxicillin in vitro 20

2.4.4.5 Phương pháp đánh giá độ ổn định của dược chất 21

2.4.4.6 Phương pháp đánh giá khả năng kết dính sinh học in vitro 22

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT 24

3.1 Xây dựng đường chuẩn 24

3.1.1 Phương pháp đo quang phổ hấp thụ tử ngoại 24

3.1.2 Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao 25

3.2 Nghiên cứu bào chế vi cầu amoxicillin kết dính sinh học tại dạ dày 26

3.2.1 Khảo sát nhiệt độ sấy 26

3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của Aerosil 28

3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung dịch calci clorid 30

3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dược chất 32

3.2.5 Khảo sát ảnh hưởng của polyme phối hợp 35

3.2.6 Ảnh hưởng của chitosan và thời gian ngâm vi cầu 38

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 43

2 Đề xuất 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

AMOX Amoxicillin

DANH MỤC CÁC BẢNG

1.1 Một số biệt dược chứa amoxicillin trên thị trường 4

2.3 Yêu cầu phần trăm amoxicillin giải phóng theo thời gian 21

Hiệu suất tạo vi cầu, tỷ lệ vi cầu hóa và một số đặc tính

3.7

Hiệu suất tạo vi cầu, tỷ lệ vi cầu hóa và một số đặc tính

3.8

Hiệu suất tạo vi cầu, tỷ lệ vi cầu hóa và một số đặc tính

3.9

Hiệu suất tạo vi cầu, tỷ lệ vi cầu hóa và một số đặc tính của các mẫu vi cầu có nồng độ amoxicillin khác nhau 33

3.10

Hiệu suất tạo vi cầu, tỷ lệ vi cầu hóa và một số đặc tính

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

1.1 Quá trình xâm nhập của Helicobacter pylori trong dạ dày 2

2.3 Thiết bị đánh giá khả năng kết dính sinh học được cải

tiến từ cân kĩ thuật

23

3.4 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa mật độ quang (D)

và nồng độ (C) của dung dịch amoxicillin trong nước

24

3.5 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ

amoxicilln và diện tích peak

ĐẶT VẤN ĐỀ

Helicobacter pylori (H.P) là một xoắn khuẩn gram âm ưa khí có trong dạ dày

của khoảng một nửa dân số thế giới [29] Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng nhiễm H.P có

thể gây ra viêm dạ dày mãn tính, loét đường tiêu hóa, ung thư dạ dày và một số bệnh khác Do đó, nhiễm H.P đã và đang là vấn đề được quan tâm trên toàn thế giới [25]

Nhiễm H.P là nguyên nhân chính của bệnh loét dạ dày tá tràng (làm tăng 3 – 4 lần

nguy cơ mắc bệnh loét dạ dày) và là yếu tố nguy cơ chính của ung thư dạ dày [21]

Amoxicillin là một trong ba kháng sinh được lựa chọn để điều trị H.P [26], [32] Tuy nhiên, do H.P có khả năng xâm nhập và khu trú sâu trong lớp niêm mạc dạ dày

trong khi các hệ phân phối thuốc thông thường có thời gian lưu thuốc ở dạ dày ngắn nên khó có thể cung cấp kháng sinh tới vị trí nhiễm trùng đạt nồng độ điều trị Do đó cần thiết nghiên cứu bào chế một hệ phân phối thuốc mới có khả năng kéo dài thời gian lưu của thuốc tại vị trí tác dụng và cải thiện nồng độ kháng sinh trong dạ dày để điều trị

nhiễm trùng H.P [27]

Hiện nay trên thế giới đã có một số nghiên cứu về các dạng bào chế chứa amoxicillin có khả năng làm tăng thời gian lưu thuốc tại dạ dày, giúp cải thiện hiệu quả điều trị như: viên nén, vi cầu nổi và/hoặc kết dính niêm mạc… Trong đó, vi cầu hoặc viên nang được đánh giá cao hơn hơn các dạng bào chế thông thường như viên nén và viên nang vì diện tích bề mặt tiếp xúc rộng, do đó làm tăng sự hấp thu của thuốc, làm giảm số lần dùng, và cải thiện sự tuân thủ của bệnh nhân Vi cầu giải phóng dược chất

ở ngay lớp niêm mạc, có lợi cho việc điều trị tại chỗ và tăng cường sinh khả dụng [9] Tuy nhiên, ở Việt Nam đến nay vẫn chưa có nghiên cứu về vi cầu kết dính sinh học chứa amoxicillin được công bố Xuất phát từ tình hình thực tế đó, chúng tôi thực hiện

đề tài: ―Nghiên cứu xây dựng công thức bào chế vi cầu amoxicillin kết dính sinh

học tại dạ dày‖ với mục tiêu: Xây dựng được công thức bào chế vi cầu amoxicillin kết

dính sinh học tại dạ dày bằng phương pháp trao đổi ion cố định gel

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Sinh lý bệnh loét dạ dày –tá tràng liên quan đến Helicobacter pylori

Helicobacter pylori là một xoắn khuẩn gram âm hình chữ S, cư trú chủ yếu ở

niêm mạc dạ dày người, đặc biệt là vùng hang vị Sở dĩ chúng có thể tồn tại trong môi trường acid khắc nghiệt của dạ dày là do có khả năng sản xuất ra urease tạo môi trường kiềm [11] Nhờ cấu tạo có 2 đến 6 roi, H.P có thể di chuyển nhịp nhàng tránh co bóp của dạ dày, thâm nhập niêm mạc một cách dễ dàng và bám chặt vào lớp sâu niêm mạc khi gặp điều kiện bất lợi Vì vậy, sự tiếp cận của các loại thuốc kháng sinh đến các vị trí trong lòng dạ dày bị hạn chế dẫn đến hiệu quả điều trị không cao [2], [22]

Hình 1.1 Quá trình xâm nhập của Helicobacter pylori trong dạ dày [17]

Helicobacter pylori là nguyên nhân chủ yếu gây viêm dạ dày mãn tính, viêm

loét dạ dày, u và ung thư dạ dày Phần lớn người bị nhiễm (> 70%) không có triệu chứng, tỉ lệ nhiễm khác nhau nhưng đang giảm ở hầu hết các nước phát triển và tăng nhanh ở các nước đang phát triển [18], [13] Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng tỉ lệ nhiễm phụ thuộc vào tình hình kinh tế xã hội, điều kiện sống và vệ sinh [13] Khoảng

15% người nhiễm H.P sẽ phát triển thành loét dạ dày tá tràng (tá tràng hoặc dạ dày)

hoặc tiến triển thành ung thư dạ dày sau một thời gian nhiễm trùng

Amoxicillin có những tính chất lý, hóa học sau [1], [12], [36]:

- Amoxicillin (trihydrat) là dạng bột tinh thể màu trắng hoặc gần như trắng, không mùi,

vị đắng

- Tan trong nước (4mg/ml), trong cồn (2,7mg/ml), không tan trong ether, cloroform, dầu, tan trong các dung dịch acid hoặc hydroxyd kiềm loãng

- Amoxicillin có ba proton phân ly, các giá trị pKa là 2,63; 7,55 và 9,64 ở 23oC

- Ổn định nhất trong dung dịch nước ở pH 4,0 - 7,0 và suy thoái trong môi trường acid

pH 1,0; pH 2,0 trong một giờ đầu lần lượt là 12,20% và 3,50%

- Khả năng thấm của AMOX là 5,5×10-6 cm.s-1 qua dịch dạ dày, 2,3×10-6 cm.s-1 qua mucin dạ dày, giả sử hệ số thấm của AMOX xấp xỉ như nhau trong niêm dịch dạ dày, thuốc sẽ thâm nhập vào một lớp 200 µm trong 2,4 giờ

- Thuộc nhóm III trong bảng phân loại sinh dược học: độ tan tốt, tính thấm kém

1.2.3 Dược động học

Amoxicillin có các thông số dược động học như sau:

- Sinh khả dụng (SKD) đường uống khoảng 70%, thức ăn không ảnh hưởng đến

sự hấp thu của thuốc [3], [12]

- Phân bố nhanh vào hầu hết các mô và dịch trong cơ thể trừ mô não và dịch não tủy nhưng khi màng não bị viêm thì amoxicillin lại khuếch tán vào dễ dàng [12]

- Thải trừ: khoảng 80% liều uống amoxicillin thải trừ ra dạng nước tiểu trong

6-8 giờ AMOX có nồng độ cao trong dịch mật, một phần thải trừ qua phân [3], [12]

1.2.4 Cơ chế tác dụng lên Helicobacter pylori

Amoxicillin liên kết với protein đặc hiệu liên kết với penicilin (PBPs) do đó tác động lên thành của vi khuẩn làm phân giải quá trình tổng hợp thành tế bào Nghiên cứu

lâm sàng cho thấy sử dụng amoxicillin để diệt trừ H.P có tỷ lệ kháng thuốc thấp nhất

so với clarithromycin hay metronidazol nên được sử dụng trong phác đồ điều trị H.P

rộng rãi [1]

1.2.5 Chỉ định cho diệt Helicobacter pylori

Phác đồ chuẩn 3 thuốc được FDA công nhận:

Amoxicillin 1 gam uống x 2 lần/ngày, omeprazol 20 mg uống x 2 lần/ ngày, clarithromycin 500 mg uống x 2 lần/ ngày Thời gian đợt điều trị là 7, 10 hoặc 14 ngày tùy theo những điều kiện khác nhau

1.2.6 Một số biệt dược chứa amoxicillin trên thị trường

Một số biệt dược chứa AMOX trên thị trường được trình bày trong bảng 1.1

Bảng 1.1 Một số biệt dược chứa amoxicillin trên thị trường [19]

875mg/125mg

5 Amoxipen Viên nang 250mg, 500mg

8 Clamoxyl Bột pha hỗn dịch uống 250mg

1.3 Hệ thuốc kết dính sinh học

1.3.1 Khái niệm

Kết dính sinh học là trạng thái gồm hai bề mặt được gắn kết với nhau trong 1 thời gian dài nhờ lực liên kết bề mặt, trong đó có ít nhất một bề mặt có nguồn gốc sinh học [15] hoặc là sự gắn kết của một polyme (tổng hợp hoặc tự nhiên) với một lớp mô sinh học nhằm kéo dài thời gian lưu giữ giữa chúng [20] Các bề mặt sinh học này có thể là lớp tế bào biểu mô, lớp màng nhầy hoặc niêm mạc

Vi cầu kết dính sinh học có nhiều ưu điểm: làm tăng khả năng hấp thu và tăng sinh khả dụng của thuốc do có diện tích bề mặt lớn, thời gian tiếp xúc với niêm mạc nhiều hơn, hệ vận chuyển thuốc đến vị trí hấp thu tối ưu và có khả năng giải phóng thuốc kéo dài và ổn định [24]

1.3.2 Quá trình và cơ chế kết dính sinh học

Hình 1.2 Quá trình kết dính sinh học [1], [7]

Quá trình kết dính có thể được chia thành 2 giai đoạn:

Giai đoạn củng cố Giai đoạn tiếp xúc

Vị trí hình thành liên kết Dạng thuốc

Lớp màng nhầy

- Giai đoạn tiếp xúc: polyme thấm ướt, trương nở để tiếp xúc với biểu mô sinh học

- Giai đoạn củng cố: xảy ra các tương tác lý hóa học để tạo ra liên kết

Các cơ chế kết dính sinh học [35]:

Cơ chế tĩnh điện: Do lớp màng nhầy và hệ KDSH tích điện trái dấu nhau nên khi

tiếp xúc với nhau, sự chuyển điện tử giữa chúng sẽ hình thành lớp điện tích kép ở bề mặt liên kết Lực hút tĩnh điện quyết định lực kết dính

Cơ chế thấm ƣớt: Áp dụng cho chất lỏng hoặc hệ KDSH có độ nhớt thấp Theo

đó, kết dính như một quá trình thấm, các chất kết dính xâm nhập vào bề mặt chất nền, đông cứng lại và lưu trên bề mặt sinh học Hệ polyme KDSH có khả năng hòa trộn lẫn với lớp màng nhầy tốt dẫn đến tỷ lệ lớn polyme trải rộng trên bề mặt màng nhầy Góc tiếp xúc bề mặt sinh học càng nhỏ thì sự kết dính càng tốt

Cơ chế khuếch tán: Đây là quá trình khuếch tán hai chiều với tỷ lệ thâm nhập phụ

thuộc vào hệ số khuếch tán của các polyme tương tác Các yếu tố ảnh hưởng là: trọng lượng phân tử, mật độ liên kết ngang, tính linh động của chuỗi polyme, nhiệt độ môi trường

Cơ chế hấp phụ: Sự kết dính là kết quả của các liên kết sơ cấp và thứ cấp giữa

polyme kết dính và bề mặt màng nhầy

1.3.3 Polyme kết dính sinh học

1.3.3.1 Yêu cầu đối với polyme kết dính sinh học

Một polyme lý tưởng cho sự KDSH cần có những đặc điểm sau [5]:

- Không độc hại và không hấp thu

- Không phân hủy trong thời gian bảo quản và trong quá trình sử dụng dạng bào chế

- Có các nhóm chức hóa học có khả năng tạo liên kết hydro (carboxylic, hydroxyl, amid, sulfat)

- Chuỗi polyme trọng lượng phân tử lớn, tính linh hoạt cao và mang điện tích bề mặt

- Sức căng bề mặt cho phép trải rộng bề mặt tiếp xúc với màng sinh học

- Chi phí thấp

1.3.3.2 Phân loại polyme KDSH

Các polyme KDSH được phân loại như sau [4], [7]:

 Polyme thế hệ 1:

Polyme cation: khả năng KDSH do tương tác tĩnh điện giữa nhóm chức mang điện tích dương trong phân tử với acid sialic tích điện âm của glycoprotein màng nhầy Ví dụ: chitosan, trimethyl chitosan, aminodextran,

Polyme anion: Khả năng KDSH do nhóm carboxyl trong phân tử tạo liên kết hydro với nhóm hydroxyl trên chuỗi oligosaccarid của protein chất nhầy Các polyme anion kết dính hiệu quả hơn polyme cation và polyme không ion hóa Ví dụ: Carbopol, carboxymethyl cellulose, NaCMC, natri alginat, pectin,

Polyme không ion hóa: Khả năng KDSH kém hơn so với polyme anion và cation

Sự kết dính với chất nhầy không phụ thuộc vào pH hay sự có mặt của các ion trong môi trường Ví dụ: HPMC, hydroxyethyl cellulose, PVA, PVP,

 Polyme thế hệ 2:

Kết dính trực tiếp với bề mặt tế bào hơn là lớp chất nhầy bằng receptor đặc hiệu hoặc liên kết cộng hóa trị thay vì các cơ chế không đặc hiệu như polyme thế hệ trước

Ví dụ: chitosan thiol hóa, lectin,

Đặc điểm về polyme KDSH thường dùng [4], [7]:

Polyethylen oxid (PEO):

- Loại dược dụng: PEO 5 000 000, PEO 7 000 000…

- Độ nhớt: PEO 5 000 000 khoảng 5500 - 7500 cps; PEO 7 000 000 khoảng 7500 –

10000 cps (dung dịch 1%)

- Tan trong nước và một số dung môi hữu cơ như acetonitril, chloroform, methylenclorid, không tan trong hydrocarbon béo, ethylen glycol và hầu hết các alcol

- Là một polyme KDSH tốt

- Có khả năng trương nở cao, PEO có khối lượng phân tử cao giải phóng thuốc chậm

- Nhiệt độ cao có thể làm giảm độ nhớt

- Không độc hại, tương kỵ với tác nhân oxy hóa mạnh

Hydroxypropyl methylcellulose:

- Loại dược dụng: K100, K4M, K15M, K100M…

- Khối lượng phân tử: 85 – 150 (kilodalton)

- Độ nhớt: 4000 cps – K4M, 100000 cps – K100M (dung dịch 2%)

- Tan trong nước lạnh, không tan trong cồn, cloroform, ổn định ở pH 3,0 – 11,0

- Có khả năng trương nở rất cao, kết dính sinh học tốt, dễ dàng hình thành gel, pH trung tính, không độc hại, ảnh hưởng nhỏ trên các thông số sản xuất và công nghệ sản xuất tương đối đơn giản vì vậy HPMC được sử dụng rộng rãi trong việc xây dựng các dạng bào chế

Natri alginat:

- Thường dùng ở dạng bột, bột màu trắng, không mùi, không vị

- Khối lượng phân tử: 32000 đến 400000 g/mol

- Tan trong nước tạo dung dịch keo có pH 7,2, không hòa tan trong các dung môi hữu

cơ và dung dịch acid có pH dưới 3,0

- Đặc tính tạo gel tốt, tương hợp sinh học tốt, độc tính thấp, giá thành rẻ Thường được dùng làm chất nhũ hóa, chất ổn định, thành phần trong viên nén kết dính

1.3.4 Một số phương pháp đánh giá khả năng kết dính sinh học áp dụng với vi cầu

Do có khả năng tăng thời gian lưu giữ của thuốc tại vị trí hấp thu tối ưu các hệ KDSH giữ vai trò quan trọng trong việc tăng SKD của thuốc Vì vậy, các phương pháp thử kết dính là một bước quan trọng để phát triển dạng bào chế này Dưới đây là một số phương pháp đánh giá khả năng KDSH in vitro được áp dụng đối với vi cầu:

- Phương pháp sử dụng cân đo vi lực

Thiết kế mô hình thí nghiệm như sau [24], [10]:

Thiết bị:

+ Thiết bị phân tích góc tiếp xúc động học Cahn, sử dụng mô hình DCA-322

Mô hình này bao gồm 1 cân đo vi lực, một máy tính Cahn DACS IBM tương thích Thiết bị này có độ nhạy lên tới 1×10-5 mN [22]

+ Thiết bị khác: cân phân tích cải tiến

Phương pháp này chỉ áp dụng cho những vi cầu có kích thước > 300 µm

Tiến hành:

Đối với thiết bị phân tích góc tiếp xúc động học Cahn, sử dụng mô hình DCA-322:

+1 vi cầu được gắn cố định vào 1 sợi dây

+ Màng sinh học được đặt trong 1 buồng di động có pH và nhiệt độ kiểm soát + Sau đó buồng được nâng lên cho đến khi tiếp xúc với vi cầu, sau thời gian tiếp xúc xác định (7 phút) buồng được hạ xuống về vị trí ban đầu

+ Quỹ đạo lực thu được từ phần mềm máy tính sẽ xác định được lực kết dính

Đối với thiết bị là cân phân tích cải tiến:

Hai miếng niêm mạc được gắn với 2 lam kính, một lam kính sẽ được cố định trên giá đỡ Phần giá đỡ này được đặt trong cốc thủy tinh chứa dung dịch đệm có pH thích hợp và được duy trì nhiệt độ 37 ± 1oC, tuy nhiên dung dịch chỉ tiếp xúc với lớp niêm mạc để giữ cho nó ẩm để không làm ảnh hưởng tới kết quả Lam kính còn lại sẽ được gắn với đĩa cân của thiết bị thử Polyme kết dính được gắn vào một trong hai lớp niêm mạc Sau đó tác dụng một lực khoảng 1 - 2N để nén 2 lớp niêm mạc lại trong một

khoảng thời gian thích hợp Sau khi ngừng tác dụng lực, đĩa cân bên kia sẽ được thêm dần 200 mg/ phút cho đến khi hai lớp niêm mạc tách ra [23], [38]

- Kỹ thuật sử dụng túi ruột chuột

Thiết kế mô hình thí nghiệm như sau [14], [16], [11]:

+ Sau đó lấy túi ruột ra, xác định lượng vi cầu bám dính vào túi

+ Tỷ lệ % bám dính được tính theo công thức:

×100

No: Số lượng vi cầu ban đầu

N: Số lượng vi cầu còn lại trong ống nghiệm

- Mô hình máng rửa trôi

Thiết kế mô hình thí nghiệm [11], [14], [16], [31]:

Môi trường: dung dịch đệm có pH thích hợp

Tiến hành:

+ Thường tiến hành với ruột non chuột Phần ruột được tách ra và cắt theo chiều dọc Sau đó được đặt trên các bán trụ đã được tráng bề mặt bằng nước muối sinh lý + Phân tán một số lượng chính xác vi cầu đã được hydrat hóa với một ít môi trường thử lên bề mặt niêm mạc, để trong thời gian nhất định (khoảng 15-20 phút) Toàn bộ hệ thống được đặt trong một buồng có độ ẩm tương đối 90%

+ Cho môi trường chảy qua hệ thống với tốc độ gần nhu động đường tiêu hóa + Đếm số lượng các vi cầu còn lại trên bề mặt niêm mạc Khả năng bám dính được tính bằng tỷ lệ vi cầu còn lại trên niêm mạc so với lượng vi cầu ban đầu

- Phương pháp sử dụng ống trụ quay tròn

Thí nghiệm được tiến hành với thiết bị ống trụ quay tròn làm bằng thép không gỉ, Tốc

độ quay 125 vòng/phút trong Môi trường là dung dịch đệm có pH thích hợp

1.4 Một số nghiên cứu về hệ KDSH của Amoxicillin

Năm 2007, Patel M M., Patel J K [31] đã tiến hành nghiên cứu bào chế vi cầu

AMOX KDSH chứa chitosan bằng kỹ thuật tách pha nhũ tương đơn giản sử dụng tác nhân liên kết ngang glutaraldehyd Chitosan (900 mg) được hòa tan trong 90 ml dung dịch acid acetic 1% tt/tt 300 mg AMOX được phân tán trong dung dịch polyme Tỷ lệ polyme : dược chất được giữ ổn định là 3 : 1 Hỗn hợp được ép đùn qua một bơm nhu động (ống tiêm số 20) trong 900 mL parafin lỏng (tỷ trọng cao và tỷ trọng thấp với tỷ

lệ 1: 1) có chứa 0,2% kl /tt DOSS (dioctyl sodium sulfosuccinat) và khuấy bằng máy cánh khuấy (Remi, Mumbai, Ấn Độ) tốc độ 1000 rpm Sau 15 phút, thêm glutaraldehyd (25% tt/tt trong dung dịch nước) và tiếp tục khuấy Lượng tác nhân liên kết ngang và thời gian tạo liên kết ngang được thay đổi trong đợt thử nghiệm sơ bộ từ 5 đến 50 ml và 1-3 giờ Lô thí nghiệm từ B1 đến B9 sử dụng 40 ml glutaraldehyd làm tác nhân liên kết ngang, thời gian liên kết ngang là 1 giờ, thay đổi tỷ lệ polyme : dược chất

và tốc độ khuấy Vi cầu thu được được lọc và rửa sạch nhiều lần với ether dầu hỏa (80:20) để loại bỏ vết dầu sau đó được rửa sạch bằng nước để loại bỏ glutaraldehyd dư Các vi cầu sau đó được sấy khô ở điều kiện phòng (250C, độ ẩm 60%) trong 24 giờ

Tối ưu hóa công thức vi cầu được thiết kế theo mô hình 32 đầy đủ Kết quả cho thấy lô thử tốt nhất là lô B7 (với 1% chitosan kl/tt, 1% acid acetic tt/tt và 0.2% DOSS, 40ml glutaraldehyd) có hiệu lực thuốc lên đến 70%, khả năng trương nở là 1,39, tỷ lệ phần trăm kết dính sau 1 giờ là 79%, GPDC duy trì trong hơn 12giờ Vi cầu AMOX KDSH

sử dụng chitosan kéo dài thời gian lưu thuốc ở đường tiêu hóa và tăng cường độ ổn

định của thuốc, có tiềm năng trong việc tiêu diệt triệt để H.P

Năm 2009, Singh S.K., Chidrawar V.R và cộng sự [37] đã tiến hành bào chế vi

cầu amoxicillin kết dính dạ dày sử dụng tá dược Eudagit RS100 và HPMC K4M bằng phương pháp bốc hơi dung môi Vi cầu tạo thành có bề mặt nhẵn, hình cầu và trơn chảy tốt (tỷ trọng các vi cầu bé hơn 1,2 g/cm3, góc nghỉ < 400), kích thước vi cầu khoảng 533-588,02 mm, hàm lượng dược chất trong vi cầu đạt từ 72,03% đến 82,15% kl/kl, hiệu suất tạo vi cầu khoảng 78,90 – 90,95%, thử nghiệm hòa tan tiến hành trong

12 giờ theo dược điển Mỹ XXIII cho thấy khi tăng lượng polyme trong công thức thì

có thể kéo dài giải phóng dược chất lên đến 12 giờ Kết quả nghiên cứu cho thấy: tỷ lệ polyme : dược chất ảnh hưởng đến kích thước hạt cũng như mô hình giải phóng thuốc của vi cầu và hàm lượng dược chất trong thử nghiệm hòa tan in vitro Quá trình giải phóng dược chất từ vi cầu bị ảnh hưởng bởi ít nhất bốn thông số: loại niêm mạc, khả năng kết dính dạ dày, khả năng trương nở và khả năng kiểm soát giải phóng của vi cầu Động học giải phóng amoxicilin trihydrat từ vi cầu KDSH tại dạ dày tuân theo mô hình

ma trận Higuchi Tốc độ giải phóng thuốc chậm khi nồng độ của cả hai polyme tăng Công thức F7 (amoxicillin trihydrat 250mg tương đương với 235 mg amoxicillin, HPMC K4M 480mg, Eudragit RS100 1000mg) đã được chọn là xây dựng được tối ưu hóa để nghiên cứu tiếp với 96,15% dược chất giải phóng vào giờ thứ 12

Năm 2009, Patel J K và cộng sự [11] đã tiến hành nghiên cứu bào chế vi cầu

kết dính niêm mạc của amoxicillin có chứa Carbopol-934P là polyme kết dính và ethyl cellulose là một chất mang bằng kỹ thuật bốc hơi dung môi nhũ tương Các lô J1-J9 sử dụng Span 80 2,0% tt/tt làm chất nhũ hoá, thời gian khuấy 3 giờ, thay đổi tỷ lệ dược

chất : EC : Carbopol-934P và tốc độ khuấy Vi cầu thu được được lọc và rửa sạch nhiều lần với ether dầu hỏa (80: 20) để loại bỏ vết dầu Các vi cầu sau đó được sấy khô

ở điều kiện phòng (25°C, độ ẩm 60%) trong 24 giờ Tối ưu hóa công thức vi cầu được thiết kế theo mô hình 32 đầy đủ Kết quả cho thấy cả 9 mẫu vi cầu bào chế đều có khả năng KDSH, trong đó lô J4 có tỷ lệ AMOX : Carbopol 934P : EC (1:3:1), Span 2% tt/tt, tốc độ khuấy 800 vòng/phút và thời gian khuấy 3 giờ cho vi cầu có kích thước 109 µm,

khả năng trơn chảy tốt, có tỷ lệ thuốc KDSH là tốt nhất (trên 56%) Thử nghiệm in vivo cho thấy khả năng diệt H pylori của vi cầu amoxicillin bào chế được trong điều kiện

sử dụng liều duy nhất hoặc nhiều lần đều tốt hơn so với bột amoxicillin

Năm 2005, Liu và cộng sự [30] đã bào chế vi cầu kết dính niêm mạc của

amoxicillin trong ethyl cellulose và Carbomer 937 bởi các phương pháp bốc hơi dung môi và thấy rằng sự giảm hàm lượng AMOX trong vi cầu bào chế được cải thiện đáng

kể Ngoài ra, vi cầu kết dính niêm mạc chứa AMOX có thể lưu lại trong đường tiêu hóa trong một thời gian dài hơn thời gian và kết quả diệt H pylori cao hơn so với bột AMOX

Năm 2010, Narkar và cộng sự [23] đã nghiên cứu bào chế hạt gellan KDSH

amoxicillin bằng phương pháp cố định gel bằng cation Những lượng amoxicillin khác nhau được phân tán trong 10 ml dung dịch gellan với nồng độ khác nhau (1,5%, 1,75%

và 2,0% kl/tt) bằng cách khuấy liên tục (300 vòng/phút) ở 40°C đến khi tạo thành dung dịch đồng nhất Các dung dịch đồng nhất được ép đùn qua ống kim tiêm 18G vào 100

ml dung dịch chứa 5% calci clorid pH 5 hoặc pH 9, khuấy liên tục (100 vòng/phút) để tạo liên kết chéo và tiếp tục khuấy thêm 5 phút để tăng độ bền cơ học cho hạt Các hạt thu được được rửa sạch bằng nước cất hai lần, và sấy khô ở 25 - 30°C trong 24 giờ pH của các dung dịch tạo liên kết chéo được điều chỉnh bằng HCl loãng và dung dịch ethylamin 10% Hạt gellan thuốc tạo liên kết chéo trong dung dịch kiềm được bao chitosan Thiết kế thí nghiệm ngẫu nhiên theo mô hình 32 đầy đủ Hiệu suất và khả năng vi cầu hóa tạo liên kết chéo trong môi trường acid thấp hơn trong môi trường

kiềm (40% đến 65% so với 70% đến 97% kl/kl và 32% đến 40% so với 60% đến 89% kl/kl tương ứng) Khả năng kiểm soát giải phóng của hạt tạo liên kết chéo trong kiềm tốt hơn trong acid (khoảng 80% so với khoảng 100% tại giờ thứ 2) Các hạt được bao chitosan có khả năng kiểm soát giải phóng dược chất trong khoảng thời gian 7 giờ (giải phóng khoảng 80%) theo mô hình Peppas (r = 0,9998) Lô AM8 có khả năng

KDSH cao hơn trong thử nghiệm in vitro đã được thử nghiệm in vivo và có hơn 85%

hạt được giữ lại trên niêm mạc dạ dày sau 7 giờ Kết quả nghiên cứu cho thấy amoxicillin hạt gellan bao chitosan có khả năng kéo dài giải phóng, thời gian bám dính

tại dạ dày và khả năng ức chế H pylori tốt hơn so với thuốc quy ước

Qua tham khảo các tài liệu có thể rút ra một số điểm đáng chú ý sau:

- Dược chất amoxicillin không bền với nhiệt và ẩm, đặc biệt phân hủy nhanh trong môi trường pH thấp như trong dạ dày

- Các hệ kết dính sinh học, trong đó có vi cầu, vừa có khả năng kết dính sinh học tốt làm tăng thời gian lưu thuốc tại nơi điều trị, vừa có khả năng kéo dài giải phóng dược chất và bảo vệ dược chất khỏi sự phân hủy nhanh chóng trong dạ dày, do đó có thể cho hiệu quả điều trị tốt hơn

- Việc phối hợp các polyme khác nhau đặc biệt việc sử dụng chitosan trong quá trình bào chế mang lại nhiều đặc tính quí báu cho vi cầu như khả năng kết dính, khả năng bảo vệ dược chất, khả năng kiểm soát giải phóng tốt…

- Phương pháp bào chế vi cầu trao đổi ion cố định gel có các ưu điểm: dễ thực hiện, chi phí thấp, sử dụng dung môi không độc, phù hợp lựa chọn để nghiên cứu

Ngoài ra, như chúng ta đã biết, để bảo vệ tế bào biểu mô dạ dày khỏi sự phá hủy bởi chính các chất do nó tiết ra (HCl, pepsin), trên bề mặt của dạ dày được bao phủ bởi một lớp chất nhày kết hợp với ion HCO3- Chính sự có mặt của ion này làm cho

pH của lớp nhày được duy trì ở khoảng 7,0 Do đó, nếu vi cầu amoxicillin có thể kết dính với lớp chất nhày này và giải phóng dược chất tại đây thì dược chất giải phóng

ra sẽ được bảo vệ tốt hơn so với các dạng bào chế thông thường

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu và phương tiện nghiên cứu

2.1.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu

ảng 2.2 Nguyên vật liệu nghiên cứu

2.1.2 Động vật thí nghiệm

Thỏ trắng, trưởng thành, giống đực, cân nặng 2 – 2,5kg, được nuôi trong điều kiện

có kiểm soát và chế độ ăn đầy đủ Trước khi thí nghiệm để thỏ nhịn đói qua ngày và cho uống nước tự do

2.1.3 Thiết bị nghiên cứu

Máy khuấy từ: IKA – WERK (Đức), bơm nhu động: IKA – WERK (Đức), máy siêu âm ULTRASONIC LC 60H, hệ thống thử độ hòa tan: ERWERKA DT 600, máy

đo quang phổ: UV – VIS HITACHI U – 1800, cân xác định hàm ẩm: SARTORIUS MA30, máy đo thể tích biểu kiến của hạt: ERWEKA SVM (Đức), cân kỹ thuật cải tiến, cân kỹ thuật SARTORIUS, cân phân tích SARTORIUS, hệ thống sắc ký lỏng hiệu

năng cao: HP 1260 ALIGENT, thiết bị đánh giá khả năng KDSH tự chế tạo từ cân kỹ

thuật, máy đo pH EUTECH INSTRUMENTS pH 510, tủ sấy BINDER, HERAEUS,

MEMMERT ULM 200, máy lọc nén, micropipet và các dụng cụ thuỷ tinh

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Xác định khoảng nồng độ tuyến tính

* Phương pháp đo quang phổ hấp thụ tử ngoại

Cân chính xác 100mg AMOX cho vào bình định mức 100ml, thêm 60ml nước

và siêu âm khoảng 30 phút để hòa tan hoàn toàn Thêm nước vừa đủ đến vạch, lắc đều

và lọc Sau đó pha loãng thành các dung dịch có nồng độ lần lượt 100, 120, 140, 160,

180, 200 µg/ml Tiến hành đo mật độ quang các dung dịch trên ở bước sóng 272 nm

Từ kết quả thu được xây dựng phương trình hồi quy thực nghiệm, vẽ đồ thị biểu thị sự tương quan giữa mật độ quang và nồng độ AMOX

* Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

pH 5,0 vừa đủ đến vạch, lắc đều Sau đó pha loãng thành các dung dịch có nồng độ 20,

40, 60, 80, 100 µg/ml Lọc các dung dịch qua màng lọc 0,45 µm, chạy sắc ký

Từ các diện tích peak thu được xây dựng phương trình hồi quy thực nghiệm, vẽ

đồ thị sự tương quan giữa diện tích peak và nồng độ AMOX

2.2.2 Phương pháp bào chế vi cầu amoxicillin kết dính sinh học

Bào chế vi cầu AMOX KDSH bằng phương pháp cố định gel bằng ion theo các

bước sau:

Chuẩn bị dung dịch polyme:

+ Natri alginat và các polyme phối hợp được ngâm trương nở trong 70 ml nước

RO, khuấy từ qua đêm để tạo thành dung dịch polyme đồng nhất

Phối hợp AMOX vào dung dịch polyme:

+ Tạo hỗn hợp bột kép của AMOX và Aerosil, sau đó phân tán trong khoảng 10 ml nước rồi phối hợp với dung dịch polyme đã chuẩn bị, tráng sạch cốc, gộp dịch tráng và bổ sung nước vừa đủ 100 ml Khuấy trộn bằng máy khuấy từ trong 30 phút để tạo thành hỗn dịch đồng nhất

Chuẩn bị môi trường nhỏ giọt:

Môi trường nhỏ giọt không có chitosan (1): 300 ml dung dịch calci clorid 10% (kl/tt)

Môi trường nhỏ giọt có phối hợp thêm chitosan (2):

+ Dung dịch chitosan được chuẩn bị 1 giờ trước khi bào chế bằng cách: phân tán chitosan trong 200 ml dung dịch acid acetic 1,5% (tt/tt) để trương nở hoàn toàn

+ Chuẩn bị 100 ml dung dịch calci clorid 30% (kl/tt), điều chỉnh về pH = 5 bằng dung dịch natri hydroxyd 0,4N và dung dịch acid hydroclorid 0,1N

+ Phối hợp hai dung dịch trên với nhau, khuấy trộn 15 phút để tạo thành một dung dịch đồng nhất

Tạo vi cầu:

+ Sử dụng bơm nhu động bơm hỗn dịch dược chất đã chuẩn bị qua kim phun cỡ 18 với tốc độ thích hợp vào 300 ml môi trường nhỏ giọt đã chuẩn bị trước đó Tiếp tục khuấy

từ dung dịch chứa vi cầu mới tạo thành trong thời gian thích hợp với tốc độ 200 vòng/phút đối với MT (1) và 600 vòng/phút đối với MT (2)

+ Gạn rửa vi cầu bằng nước RO (50ml × 3 lần), sấy ở nhiệt độ thích hợp đến khi vi cầu đạt độ ẩm < 3%

2.2.3 Phương pháp đánh giá hiệu suất tạo vi cầu và tỷ lệ vi cầu hóa

- Hiệu suất của quá trình bào chế vi cầu được tính theo công thức:

H % = × 100 Trong đó: H: Hiệu suất tạo vi cầu (%)

mt: Khối lượng vi cầu thu được (g)

mo: Khối lượng nguyên liệu rắn đầu vào (g)

- Tỷ lệ vi cầu hóa: là tỷ lệ giữa lượng dược chất có trong vi cầu với lượng dược chất

đưa vào ban đầu

Từ kết quả định lượng AMOX trong vi cầu, tỷ lệ vi cầu hóa được xác định theo công thức:

%VCH = × 100 Trong đó:

% VCH: Tỷ lệ AMOX được vi cầu hóa (%)

No: Lượng AMOX đưa vào ban đầu (g)

Nt: Lượng AMOX định lượng được trong vi cầu thu được (g)

2.2.4 Phương pháp đánh giá chất lượng vi cầu

2.2.4.1 Xác định kích thước tiểu phân và chỉ tiêu mất khối lượng do làm khô

+ Xác định kích thước tiểu phân: sử dụng bộ cỡ rây: 0,8mm, 1mm, 1,2mm, 1,4mm + Tiến hành trên cân xác định độ ẩm nhanh SARTORIUS MA 30

2.2.4.2 Đánh giá khả năng trơn chảy của vi cầu

+ Thiết bị: Sử dụng máy đo tỷ trọng biểu kiến ERWEKA SVM

+ Tiến hành: Cân chính xác 5,0 g mẫu vi cầu cho vào ống đong 10 ml, gõ đều đặn 10 nhịp ghi thể tích thô, gõ đều đặn đến thể tích không đổi ghi thể tích biểu kiến

Tỷ trọng biểu kiến và tỷ trọng thô của mẫu vi cầu được tính theo công thức:

Dt =

Db = Khả năng trơn chảy của vi cầu được đánh giá thông qua chỉ số Carr:

% Carr = × 100 Trong đó:

db: Tỷ trọng biểu kiến (g/ml)

dt: Tỷ trọng thô (g/ml)

Vt: Thể tích thô của vi cầu (ml)

Vb: Thể tích biểu kiến của vi cầu (ml)

mc: Khối lượng vi cầu (g)

2.2.4.3 Định lƣợng

 Mẫu chuẩn

Cân chính xác 120 mg bột AMOX, hòa tan hoàn toàn bằng dung dịch đệm phosphat pH 5,0 trong bình định mức 100 mL, bổ sung vừa đủ thể tích, thu được dung dịch gốc nồng độ 1,2 mg/mL

Tiếp tục pha loãng dung dịch gốc 20 lần với dung dịch đệm phosphat pH 5,0 để thu được mẫu chuẩn có nồng độ 60 µg/mL Lọc qua màng lọc 0,45 µm Sau đó tiêm mẫu vào cột và chạy HPLC với điều kiện như đã trình bày ở mục 2.2.1

 Mẫu thử

Nghiền vi cầu thành bột mịn Cân chính xác một lượng bột tương ứng khoảng 0,2 g AMOX cho vào cốc có mỏ 100 mL, thêm khoảng 60ml dung dịch đệm phosphat pH 5,0

siêu âm 30 phút, gạn lấy phần dịch trong vào bình định mức 100ml, thêm tiếp khoảng 30ml dung dịch đệm phosphat pH 5,0 vào phần cắn và tiếp tục siêu âm trong 30 phút Trong quá trình siêu âm, dùng đá lạnh để duy trì nhiệt độ trong bể siêu âm dưới 40°C Dùng dung dịch đệm phosphat pH 5,0 tráng cốc dồn tất cả dịch và cắn vào bình định mức

ở trên, thêm dung dịch phosphat pH 5,0 vừa đủ đến vạch Hút chính xác 2,0 ml vào bình định mức 50 ml rồi thêm dung dịch đệm phosphat pH 5,0 vừa đủ đến vạch Lọc qua màng lọc 0,45 m Sau đó tiêm mẫu vào cột và chạy HPLC với điều kiện như đã trình bày ở mục 2.2.1

 Cách tính kết quả:

%AMOX =

Trong đó:

Sth,Sch lần lượt là diện tích pic sắc kí của mẫu thử và mẫu chuẩn

mth, mch lần lượt là khối lượng của mẫu thử và mẫu chuẩn (mg)

Fth, Fch lần lượt là hệ số pha loãng của mẫu thử và mẫu chuẩn

2.2.4.4 Đánh giá khả năng giải phóng amoxicillin in vitro

Khả năng GPDC của viên AMOX bào chế được tiến hành trong điều kiện tham khảo USP 36 như sau [40]:

- Thiết bị cánh khuấy, tốc độ khuấy 75 1 vòng/phút

- Môi trường hoà tan 900 ml dung dịch nước cất

- Nhiệt độ 37 ± 0,50C

- Tiến hành thử nghiệm trong 5 giờ, lấy mẫu ở các khoảng thời gian 1 giờ, 3 giờ, 5 giờ

- Lấy mẫu: Hút 10 ml mẫu, bổ sung lại 10 ml môi trường

- Định lượng bằng phương pháp đo mật độ quang ở bước sóng λ = 272 nm

- Cách tính kết quả: Nồng độ AMOX ở thời điểm t được tính theo công thức: