Nghiên cứu bào chế vi cầu amoxicilin kết dính sinh học tại dạ dày

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HOÀI THƯƠNG NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VI CẦU AMOXICILIN KẾT DÍNH SINH HỌC TẠI DẠ DÀY LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI - 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HOÀI THƯƠNG NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VI CẦU AMOXICILIN KẾT DÍNH SINH HỌC TẠI DẠ DÀY LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ THUỐC MÃ SỐ: 60720402 Người hướng dẫn khoa học: TS Vũ Thị Thu Giang TS Phạm Xuân Chung HÀ NỘI - 2015 LỜI CẢM ƠN Lời xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới: TS Vũ Thị Thu Giang Là người thầy trực tiếp hướng dẫn, tận tình bảo động viên giúp đỡ suốt thời gian thực hoàn thành luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Phạm Xuân Chung thầy, cô, anh chị kỹ thuật viên môn Bào chế nhiệt tình giúp đỡ, hỗ trợ tạo điều kiện thuận lợi cho trình làm thực nghiệm Bộ môn Đồng thời xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô, anh chị kỹ thuật viên môn Y học sở, môn Dược lý, với anh chị Viện Kiểm nghiệm thuốc trung ương giúp đỡ nhiều trình làm đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Phòng sau đại học, thầy cô giáo, cán bộ, nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội – người dạy dỗ giúp đỡ suốt thời gian học tập trường Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè – người bên tôi, chia sẻ động viên suốt thời gian vừa qua Trong trình làm luận văn có nhiều cố gắng song tránh khỏi thiếu sót, mong nhận góp ý chân thành quý báu thầy cô giáo, hội đồng phản biện bạn Hà Nội, ngày 30 tháng năm 2015 Học viên Nguyễn Thị Hoài Thương MỤC LỤC DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ……………………………………………………………………… CHƯƠNG TỔNG QUAN……………………………………………………… 1.1 Sinh lý bệnh loét dày – tá tràng liên quan đến Helicobacter pylori 1.2 Tổng quan amoxicilin……………………………………………… 1.2.1 Công thức hóa học………………………………………………………… 1.2.2 Tính chất lý, hóa học……………………………………………………… 1.2.3 Dược động học…………………………………………………………… 1.2.4 Cơ chế tác dụng lên Helicobacter pylori………………………………… 1.2.5 Chỉ định cho diệt Helicobacter pylori…………………………………… 1.2.6 Một số biệt dược chứa amoxicilin thị trường……………………… 1.3 Hệ thuốc kết dính sinh học……………………………………………… 1.3.1 Khái niệm………………………………………………………………… 1.3.2 Quá trình chế kết dính sinh học…………………………………… 1.3.3 Polyme kết dính sinh học………………………………………………… 1.3.3.1 Yêu cầu polyme kết dính sinh học………………………………… 1.3.3.2 Phân loại polyme kết dính sinh học……………………………………… 1.3.4 Một số phương pháp đánh giá khả kết dính sinh học áp dụng vi cầu……………………………………………………………………… 11 1.3.4.1 Các phương pháp thử kết dính sinh học in vitro………………………… 11 1.3.4.2 Các phương pháp thử kết dính sinh học in vivo………………………… 15 1.4 Một số nghiên cứu hệ kết dính sinh học……………… ……… 15 1.4.1 Các nghiên cứu giới…………………………….……………… 15 1.4.1.1 Nghiên cứu bào chế vi cầu amoxicilin kết dính sinh học………………… 15 1.4.2 20 Nghiên cứu bào chế hệ kết dính sinh học khác chứa amoxicilin…… Các nghiên cứu nước……………………………………………………… 22 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU… 24 2.1 Nguyên liệu phương tiện nghiên cứu……………………………… 24 2.1.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu……………………………………………… 24 2.1.2 Động vật thí nghiệm……………………………………………………… 25 2.1.3 Thiết bị nghiên cứu……………………………………………………… 25 2.2 Phương pháp nghiên cứu……………………………………………… 25 2.2.1 Phương pháp bào chế……………………………………………………… 25 2.2.1.1 Bào chế vi cầu amoxicilin kết dính sinh học……………………………… 25 2.2.1.2 Bào chế viên nang chứa vi cầu amoxicilin kết dính sinh học…………… 26 2.2.2 Phương pháp đánh giá hiệu suất tạo vi cầu tỷ lệ vi cầu hóa……………… 27 2.2.3 Phương pháp đánh giá số tiêu chất lượng vi cầu………………… 27 1.4.2 2.2.3.1 Xác định kích thước tiểu phân tiêu khối lượng làm khô… 27 2.2.3.2 Đánh giá khả trơn chảy vi cầu………………………………… 27 2.2.3.3 Định lượng………………………………………………………………… 28 2.2.3.4 Đánh giá độ hòa tan vi cầu amoxicilin kết dính sinh học………… 29 2.2.3.5 Đánh giá độ ổn định dược chất môi trường có pH khác ……………………………………………………………………… 31 2.2.3.6 Đánh giá khả kết dính sinh học in vitro…………………………… 31 2.2.3.7 Đánh giá khả kết dính sinh học in vivo……………………………… 32 Phương pháp đánh giá số tiêu chất lượng viên nang…………… 33 2.2.4.1 Đánh giá độ đồng khối lượng………………………………………… 33 2.2.4.2 Đánh giá khả giải phóng dược chất từ viên nang…………………… 33 2.2.4.3 Định lượng dược chất viên nang…………………………………… 33 2.2.4.4 Phương pháp đánh giá độ ổn định chế phẩm………………………… 33 Phương pháp phân tích xử lý số liệu…………………………………… 34 CHƯƠNG KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT…………………… 35 3.1 Xây dựng đường chuẩn định lượng dược chất………………………… 35 3.1.1 Phương pháp đo quang phổ hấp thụ tử ngoại…………………………… 35 2.2.4 2.2.5 3.1.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao………………………………… 36 3.2 Nghiên cứu bào chế vi cầu amoxicilin kết dính sinh học……………… 37 3.2.1 Khảo sát nhiệt độ sấy……………………………………………………… 37 3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ Aerosil.……………………………… 39 3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ dược chất……………………………… 41 3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng polyme phối hợp……………………………… 43 3.2.5 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ calci clorid…………………………… 46 3.2.6 Khảo sát ảnh hưởng chitosan thời gian ngâm vi cầu……………… 48 3.2.7 Đánh giá độ ổn định dược chất mẫu vi cầu F17 môi trường pH khác nhau…………………………………………………………… 52 3.3 Đánh giá khả kết dính sinh học in vivo chuột……………… 53 3.4 Nghiên cứu bào chế đánh giá độ ổn định viên nang chứa vi cầu amoxicilin hàm lượng 250mg…………………………………………… 55 3.4.1 Bào chế vi cầu amoxicilin kết dính sinh học theo công thức lựa chọn … 55 3.4.2 Bào chế viên nang chứa vi cầu amoxicilin hàm lượng 250mg…………… 56 3.4.3 Đánh giá độ ổn định viên nang amoxicilin bào chế ……………….… 57 CHƯƠNG BÀN LUẬN……………………………………………… 59 4.1 Phương pháp bào chế vi cầu…………………………………………… 59 4.2 Phương pháp đánh giá lực kết dính sinh học vi cầu amoxicilin kết dính sinh học………………………………………………………….… 60 4.2.1 Thử nghiệm kết dính sinh học in vitro……………………………………….… 60 4.2.2 Thử nghiệm kết dính sinh học in vivo………………………………………… 60 4.3 Phương pháp đánh giá độ ổn định amoxicilin môi trường pH khác nhau…………………………………………………… 61 4.4 Nghiên cứu bào chế viên nang amoxicilin kết dính sinh học………… 62 4.5 Theo dõi độ ổn định viên nang amoxicilin kết dính sinh học bào chế………………………………………………………………………… 63 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……………………………………………………… 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO AMOX DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Amoxicilin BK Biểu kiến BP Dược điển Anh (Bristish Pharmacopoeia) CMC Carboxy methyl cellulose CT Công thức DC Dược chất DĐVN IV Dược điển Việt Nam IV EC Ethyl cellulose GPDC Giải phóng dược chất HL Hàm lượng H.P Helicobacter pylori HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao HPMC Hydroxy propyl methyl cellulose KDSH Kết dính sinh học kl/kl Khối lượng/khối lượng kl/tt Khối lượng/thể tích MT Môi trường NaA Natri alginat NL Nguyên liệu PEO Polyethylen oxid PVP Polyvinyl pyrolidon SKD Sinh khả dụng TCCS Tiêu chuẩn sở TKHH Tinh khiết hóa học tt/tt Thể tích/thể tích USP Dược điển Mỹ (United States Pharmacopeia) VC Vi cầu VCH Vi cầu hóa DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng Tên bảng Trang 1.1 Một số biệt dược chứa amoxicilin thị trường 1.2 Phân loại polyme kết dính sinh học 1.3 Tính chất đặc điểm mộtsố loại polyme KDSH thường dùng 10 2.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu 24 2.2 Yêu cầu phần trăm AMOX giải phóng theo thời gian (USP 36) 30 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 3.10 3.11 Tương quan mật độ quang (D) nồng độ C (µg/ml) dung dịch amoxicilin Tương quan diện tích peak nồng độ C (µg/ml) dung dịch amoxicilin Hiệu suất bào chế số đặc tính mẫu vi cầu có nhiệt độ sấy khác Hiệu suất bào chế số đặc tính mẫu vi cầu có nồng độ Aerosil khác Công thức bào chế vi cầu AMOX có nồng độ dược chất khác Hiệu suất bào chế số đặc tính mẫu vi cầu có nồng độ AMOX khác Công thức bào chế vi cầu AMOX có nồng độ polyme khác Một số đặc tính mẫu vi cầu có nồng độ polyme khác Hiệu suất bào chế số đặc tính mẫu vi cầu có nồng độ calci clorid khác Thành phần nhỏ giọt thời gian ngâm mẫu vi cầu Hiệu suất bào chế số đặc tính mẫu vi cầu có nồng độ chitosan thời gian ngâm khác 35 36 38 39 41 41 43 44 46 48 49 Bảng 3.12 3.13 3.14 3.15 3.16 3.17 Tên bảng Độ ổn định nguyên liệu AMOX mẫu vi cầu F17 môi trường pH khác Tỷ lệ vi cầu bám dính dày ruột non chuột thời điểm Một số tiêu chất lượng mẫu vi cầu bào chế Một số tiêu chất lượng viên nang AMOX KDSH hàm lượng 250mg Độ ổn định mẫu viên bào chế bảo quản điều kiện thực Độ ổn định mẫu viên bào chế bảo quản điều lão hóa cấp tốc Trang 52 54 56 56 58 58 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Tên hình vẽ, đồ thị Hình Trang 1.1 Sinh lý bệnh liên quan đến Helicobacter pylori 1.2 Quá trình xâm nhập Helicobacter pylori dày 1.3 Quá trình kết dính sinh học 1.4 Mô hình sử dụng cân phân tích cải tiến 13 2.1 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 3.10 3.11 4.1 Thiết bị đánh giá khả kết dính sinh học cải tiến từ cân Roberval Đồ thị biểu thị mối tương quan mật độ quang (D) nồng độ (C) dung dịch AMOX nước Đồ thị biểu diễn mối tương quan diện tích peak sắc kí nồng độ (C) dung dịch AMOX pha động Đồ thị biểu diễn khả GPDC theo thời gian mẫu vi cầu có nồng độ Aerosil khác Đồ thị biểu diễn khả GPDC theo thời gian mẫu vi cầu có nồng độ dược chất khác Lực KDSH mẫu vi cầu có nồng độ polyme khác Đồ thị biểu diễn khả GPDC theo thời gian mẫu vi cầu có nồng độ polyme khác Đồ thị biểu diễn khả GPDC mẫu vi cầu có nồng độ calci clorid khác Hình ảnh mẫu vi cầu bào chế Đồ thị biểu diễn phân hủy AMOX mẫu VC F17 môi trường pH khác Hình ảnh vi cầu AMOX kết dính dày chuột sau uống vi cầu AMOX Đồ thị biểu diễn khả GPDC mẫu vi cầu F17 viên nang pH dịch dày, màng nhầy lớp TB biểu mô dày 31 35 36 40 42 44 44 47 51 53 54 57 62 Bảng 3.14 Một số tiêu chất lượng mẫu vi cầu bào chế Chỉ tiêu Hàm lượng AMOX (%) Chỉ số Carr (%) Tỷ trọng biểu kiến Lực KDSH (N) % AMOX giải phóng (n = 6) Mẻ I Mẻ II Mẻ III Trung bình 54,12 5,09 0,81 0,17 56,87 68,85 88,43 52,68 4,93 0,80 0,18 58,47 69,31 89,01 55,14 5,01 0,81 0,17 57,13 70,05 89,14 53,98 ± 1,23 5,01 ± 0,08 0,81 ± 0,01 0,17 ± 0,01 57,49 ± 0,86 69,40 ± 0.61 88,86 ± 0,38 Đề xuất tiêu chuẩn > 50 0,75 > 0,15 50 - 65 65 - 85 > 85 Nhận xét: Kết thu cho thấy mẻ vi cầu bào chế đồng chất lượng, có hiệu suất bào chế cao (khoảng 95%), tỷ lệ VCH 77%.Vi cầu bào chế rắn có tỷ trọng biêu kiến khoảng 0,8; khả trơn chảy tốt (chỉ số Carr bé 7) Do hoàn toàn tiến hành đóng nang chứa vi cầu AMOX KDSH hàm lượng 250 mg sử dụng nang số 3.4.2 Bào chế viên nang chứa vi cầu AMOX hàm lượng 250mg Tiến hành bào chế mẻ viên nang chứa vi cầu AMOX KDSH với hàm lượng dược chất 250mg quy mô 100 viên từ mẻ vi cầu bào chế Đánh giá số tiêu mẫu viên nang bào chế cho, kết thể bảng 3.15 Bảng 3.15 Một số tiêu chất lượng viên nang AMOX KDSH hàm lượng 250mg Chỉ tiêu Mẻ I Mẻ II Mẻ III Trung bình Sai số khối lượng (%) (n = 20) Hàm lượng AMOX so với ghi nhãn (%) (n = 20) % AMOX giải phóng (n = 6) ± 2,53 ± 2,95 ± 2,27 ± 2,58 102,37 99,87 101,38 57,05 69,89 88,19 58,07 70,35 89,37 58,73 70,77 89,49 101,20 ± 1,25 56 57,95 ± 0,85 70,34 ± 0,44 89,02 ± 0,72 Đề xuất tiêu chuẩn ± 7,5 90 - 110 50 - 65 65 - 85 > 85 Khả giải phóng dược chất mẫu vi cầu F17 viêng nang thể % AMOX giải phóng qua đồ thị 3.11 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 Mẫu VC F17 Viên nang Thời gian (giờ) Hình 3.11 Đồ thị biểu diễn khả GPDC mẫu vi cầu F17 viên nang Nhận xét: Cả mẻ viên nang bào chế có chất lượng đồng đều, hàm lượng dược chất cao, đạt yêu cầu độ đồng khối lượng, khả GPDC mẫu đạt yêu cầu theo chuyên luận viên nén giải phóng kéo dài USP 36 Qua kết bảng 3.14, 3.15 đồ thị 3.11 ta thấy: khả giải phóng dược chất mẫu vi cầu trước sau đóng nang không thay đổi Với số f2 tính toán 97,32, hai đồ thị giải phóng dược chất từ mẫu VC F17 từ viên nang coi giống Điều chứng tỏ việc đóng nang không ảnh hưởng đến khả GPDC vi cầu 3.4.3 Đánh giá độ ổn định viên nang amoxicilin bào chế mẻ viên nang: mẻ I, mẻ II, mẻ III bào chế ngày 30/06/2015 Mỗi mẻ chia làm bảo quản điều kiện: a Điều kiện thực b Điều kiện lão hóa cấp tốc Sau tháng, tiến hành đánh giá độ ổn định mẻ viên nang Kết biến thiên hàm lượng, lực KDSH khả GPDC trình bày bảng 3.16, 3.17 57 Bảng 3.16 Độ ổn định mẫu viên bào chế bảo quản điều kiện thực Mẻ I.a Thời gian (tháng) % AMOX lại Lực KDSH vi cầu nang (N) % AMOX giải phóng 1h 3h 5h Mẻ II.a Mẻ III.a 100,56 99,94 101,03 100,15 99,86 98,90 0,17 0,17 0,18 0,17 0,17 0,17 57,43 69,50 88,09 58,35 70,04 90,22 58,90 70,12 89,34 58,80 69,83 88,76 58,03 71,01 89,62 58,05 70,74 89,42 Bảng 3.17 Độ ổn định mẫu viên bào chế bảo quản điều kiện lão hóa cấp tốc Mẻ I.b Thời gian (tháng) % AMOX lại Lực KDSH vi cầu nang (N) % AMOX giải phóng 1h 3h 5h Mẻ II.b Mẻ III.b 100,06 98,18 101,43 99,36 100,20 98,62 0,17 0,16 0,18 0,17 0,17 0,17 58,37 70,50 88,61 58,04 68,93 87,56 56,85 69,77 87,15 57,87 70,47 89,11 59,03 71,25 90,27 59,42 71,12 89,48 Nhận xét: Sau tháng bảo quản điều kiện thực lão hóa cấp tốc, lực KDSH vi cầu đóng nang (tháo vi cầu khỏi vỏ nang trước thử) hàm lượng dược chất, độ hòa tan viên nang bào chế thay đổi không đáng kể 58 CHƯƠNG BÀN LUẬN 4.1 Phương pháp bào chế vi cầu Trong nghiên cứu vi cầu AMOX bào chế theo phương pháp cố định gel ion với ưu điểm: phương pháp đơn giản, dễ tiến hành, không sử dụng dung môi hữu nên độc tiết kiệm chi phí Bên cạnh đó, vi cầu bào chế có hình cầu đẹp, kích thước đồng đều, không bị dính nhau, rắn chắc, bề mặt nhẵn có khả trơn chảy tốt Tuy nhiên, AMOX không bền với nhiệt ẩm nên khó khăn lớn gặp phải trình nghiên cứu đảm bảo độ ổn định dược chất Để khắc phục khó khăn này, nghiên cứu phải áp dụng nhiều biện pháp để cải thiện độ ổn định AMOX: - Sử dụng phối hợp thêm polyme HPMC K100M Polyox WSR Coalugant mục tiêu tăng khả KDSH vi cầu bào chế, để tăng độ ổn định dược chất: HPMC K100M có tính acid nhẹ [12], nên phối hợp với natri alginat (pH 7,4) cho dịch gel có pH – khoảng pH mà AMOX ổn định (từ 4-7) [5], [57] Polyox WSR Coalugant làm tăng độ nhớt dung dịch gel nên góp phần ổn định dược chất môi trường acid [22] - Bao chitosan nhằm tạo phức hợp chitosan – alginat bao quanh bề mặt vi cầu nhằm hạn chế khuếch tán dược chất môi trường nhỏ giọt, từ làm tăng tỷ lệ vi cầu hóa đồng thời cải thiện khả KSGP dược chất Ngoài ra, phối hợp thêm chitosan vi cầu thu có số ưu điểm sau: tỷ trọng cải thiện đáng kể (từ 0,68 mẫu F12 lên 0,8 mẫu F17), đặc tính trơn chảy tốt vi cầu có hình cầu bề mặt nhẵn - Giảm thời gian ngâm vi cầu xuống 15 phút nhằm hạn chế tối đa thời gian dược chất tiếp xúc với nước mà đảm bảo tiêu chất lượng vi cầu bào chế - Khảo sát nhiệt độ sấy thiết bị sấy để lựa chọn tủ sấy tĩnh, nhiệt độ sấy 45oC thời gian sấy từ 16-18 để vi cầu thu đạt độ ẩm 3% có hàm lượng AMOX cao 59 4.2 Phương pháp đánh giá lực KDSH vi cầu amoxicilin kết dính sinh học 4.2.1 Thử nghiệm KDSH in vitro Trong điều kiện tiến hành nghiên cứu chưa có thiết bị chuyên dụng để đánh giá khả KDSH Do tham khảo nghiên cứu nước nước tự chế tạo thiết bị đánh giá kết dính từ cân Roberval Niêm mạc dày thỏ xử lý đánh giá khả KDSH vi cầu bào chế Kết nghiên cứu cho thấy vi cầu AMOX KDSH bào chế có lực KDSH cao (0,17 N) Điều giải thích Polyox WSR Coalugant polyme KDSH nghiên cứu năm gần đây, Polyox WSR Coalugant có ưu điểm kết dính tốt có độ nhớt cao (khoảng 5.500 – 7.500 mPas (dung dịch 1%)) nên lực liên kết Polyox WSR Coalugant với màng nhầy dày lớn Ngoài ra, natri alginat, chitosan HPMC K100M polyme có khả trương nở cao, kết dính tốt làm tăng khả kết dính vi cầu Bên cạnh vi cầu có diện tích bề mặt nhỏ khả tiếp xúc với môi trường để trương nở kết dính tốt Kết phù hợp với nghiên cứu công bố [8], [9], [14] Tuy nhiên, phương pháp đánh giá khả KDSH in - vitro chưa thực mô tả trình xảy thể người sau uống thuốc Do cần tiến hành thêm thử nghiệm KDSH in vivo 4.2.1 Thử nghiệm KDSH in vivo Trong dày, vi cầu không trạng thái tĩnh mà di chuyển liên tục chịu tác động nhu động tiêu hóa theo nhiều chiều Thời gian tiếp xúc với niêm mạc dày ảnh hưởng lớn đến khả kết dính, thời gian tiếp xúc dài vi cầu kết dính tốt, thử nghiệm KDSH in vitro lại cố định thời gian tiếp xúc phút Bên cạnh đó, vị trí tiếp xúc với màng nhầy có ảnh hưởng đến thời gian lưu giữ thuốc dày Với nhiều yếu tố ảnh hưởng kiểm soát nên kết thử nghiệm in vitro chưa thể kết luận khả kết dính thực tế đưa vi cầu vào đường tiêu hóa Để đảm bảo tính khả thi nghiên cứu, thử nghiệm KDSH in vivo tiến hành chuột cống để khẳng định thêm khả kết dính sinh học vi cầu AMOX KDSH Mẫu F0 sử 60 dụng để so sánh nghiên cứu mẫu vi cầu KDSH sử dụng natri alginat làm polyme kết dính, kết cho thấy sau có 51% vi cầu mẫu bám dính dày chuột Tuy nhiên việc sử dụng thêm polyme kết dính khác Polyox WSR Coalugant, HPMC K100M chitosan, khả kết dính mẫu vi cầu F17 tăng đáng kể (sau 88% số vi cầu bám dính niêm mạc dày, cao 1,73 lần so với mẫu F0) Điều phù hợp với kết nghiên cứu Narkar M cộng năm 2010 (sử dụng chitosan gôm gellan): 85% số hạt bám dính niêm mạc dày sau [38] cao 1,47 lần (93,33% số vi cầu mẫu F17 bám dính dày sau so với 63,6% nghiên cứu Liu cộng năm 2005 [34]) 4.3 Phương pháp đánh giá độ ổn định amoxicilin môi trường pH khác Phương pháp đánh giá độ ổn định AMOX môi trường dung dịch HCl pH 1,2 đệm phosphat pH tiến hành dựa vào điều kiện nghiên cứu công bố [34], [49] Trong môi trường acid HCl pH 1,2: nguyên liệu amoxicilin dễ bị phân hủy, sau lại 40,00% so với ban đầu Kết tương thích với nghiên cứu độ ổn định AMOX nguyên liệu môi trường dung dịch HCl pH 1,2 Liu [34] Nguyễn Thị Huyền [8] Việc bào chế vi cầu KDSH góp phần cải thiện độ ổn định dược chất Ở tất thời điểm, phần trăm AMOX lại mẫu vi cầu cao mẫu nguyên liệu từ 14,5 đến 21,4% Tiến hành đánh giá độ ổn định mẫu nguyên liệu AMOX mẫu vi cầu F17 môi trường đệm phosphat pH cho thấy hàm lượng dược chất lại mẫu cao (sau hai mẫu 94% AMOX) Kết phù hợp với nghiên cứu Vahdat L [57] (pH bền vững AMOX từ 4,6 đến 7) Chadha R cộng [18]: AMOX bền vững pH từ đến 7, thời gian bán hủy AMOX 183,58 pH (37oC) Bên cạnh đó, tác động thành phần tá dược vi cầu, dược chất có xu hướng bảo vệ ổn định dạng nguyên liệu tự 61 Hơn nữa, theo nghiên cứu Lin Y.H [33] pH lớp màng nhầy dày nằm khoảng từ 4,5 đến 7,0, cao pH dịch dày (từ 1,2 đến 2,5) (hình 4.1) Do vi cầu kết dính vào lớp màng nhầy niêm dày giải phóng dược chất amoxicilin bảo vệ ổn định nhiều so với dạng thuốc qui ước Hình 4.1 pH dịch dày, lớp màng nhầy lớp tế bào biểu mô dày [33] 4.4 Nghiên cứu bào chế viên nang amoxicilin KDSH Kết đánh giá tiêu chất lượng vi cầu bào chế cho thấy mẫu vi cầu bào chế có hiệu suất cao (khoảng 95%), hàm lượng AMOX đạt trung bình 53,98 ± 1,23%, vi cầu bào chế rắn có tỷ trọng biểu kiến khoảng 0,8 với Vbk = M/dbk = 0,25/0,5398/0,8 = 0,579 ml; khả trơn chảy tốt (chỉ số Carr < 6) Do hoàn toàn tiến hành đóng nang chứa vi cầu AMOX KDSH hàm lượng 250 mg sử dụng nang cứng số tích 0,67ml Với phương pháp đong thể tích, để bào chế viên nang chứa vi cầu AMOX hàm lượng 250mg cần bào chế thêm vi cầu trơ để đảm bảo thể tích Tuy nhiên, nghiên cứu bước đầu khảo sát khả đóng nang vi cầu AMOX KDSH quy mô bào chế nhỏ lựa chọn phương pháp đóng theo khối lượng để bào chế viên nang Cả mẻ viên nang bào chế theo phương pháp đạt yêu cầu hàm lượng dược chất, độ đồng khối lượng khả GPDC So sánh với kết GPDC vi cầu 62 trước đóng nang cho thấy vỏ nang không ảnh hưởng đến khả GPDC 4.5 Theo dõi độ ổn định viên nang amoxicilin bào chế Các mẫu viên bào chế đóng lọ thủy tinh tiến hành nghiên cứu độ ổn định khoảng thời gian tháng hai điều kiện lão hóa cấp tốc điều kiện thực Lọ thủy tinh có nhiều ưu điểm như: không thấm ẩm khí, tương đối trơ mặt hóa học Đặc tính quan trọng chế phẩm bào chế với dược chất AMOX bền, với tá dược HPMC K100M, Polyox WSR Coalugant, chitosan có khả hút ẩm tiếp xúc với không khí Trong thực tế, để chống thấm ẩm khí, tiến hành ép vỉ nhôm – nhôm cho viên nang AMOX Tuy nhiên, nghiên cứu bước đầu đánh giá độ ổn định tiến hành quy mô nhỏ nên bao bì lọ thủy tinh lựa chọn Do hạn chế mặt thời gian, nghiên cứu độ ổn định viên nang AMOX bào chế tiến hành đánh giá sau tháng bảo quản Kết nghiên cứu cho thấy thay đổi đáng kể hàm lượng dược chất, lực KDSH khả GPDC viên Tuy nhiên, để khẳng định chắn độ ổn định thuốc cần tiếp tục theo dõi đánh giá độ ổn định điều kiện thực thời gian dài 63 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Đề tài nghiên cứu đạt số kết sau: - Về xây dựng công thức bào chế vi cầu amoxicilin kết dính sinh học dày + Đã lựa chọn phương pháp trao đổi ion cố định gel để bào chế vi cầu + Đã khảo sát ảnh hưởng yếu tố thuộc công thức quy trình bào chế đến số tiêu chất lượng vi cầu Từ xây dựng công thức bào chế vi cầu AMOX KDSH dày với thành phần cho 100ml dịch sau: Amoxicilin trihydrat …………… 5,0 gam Aerosil…………………………… 0,4 gam Natri alginat…………………… 1,3 gam HPMC K100 M………………… 0,1 gam Polyox WSR Coagulant………… 0,05 gam Nước vừa đủ……………………… 100 ml Tiến hành nhỏ giọt hỗn hợp vào: Môi trường nhỏ giọt…… dung dịch calci clorid 10% phối hợp chitosan 0,1% Thời gian ngâm vi cầu………… 15 phút Nhiệt độ sấy: 45OC, sấy đến độ ẩm < 3% + Đã đánh giá khả kết dính sinh học in vivo vi cầu bào chế chuột cống - Về nghiên cứu bào chế viên nang chứa vi cầu amoxicilin kết dính sinh học hàm lượng 250mg + Đã tiến hành đóng nang vi cầu AMOX KDSH hàm lượng 250mg đánh giá số tiêu viên nang bào chế + Bước đầu theo dõi độ ổn định mẻ viên nang bào chế điều kiện thường lão hóa cấp tốc thời gian tháng Kết cho thấy thay đổi đáng kể khả KDSH, hàm lượng AMOX khả giải phóng dược chất Kiến nghị - Tiếp tục nghiên cứu độ ổn định theo điều kiện thời gian quy định để khẳng định độ ổn định chế phẩm bào chế 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Bộ Y tế (2010), Bệnh học, NXB Y học, Hà Nội, tr 140-144 Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, tr 50 Bộ Y tế (2005), Dược lý học lâm sàng, NXB Y học, tr 247-248 Bộ Y tế (2009), Dược thư quốc gia Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội, tr 165 170 Bộ Y tế (2007), Hóa dược tập 2, NXB Y học, tr 115 - 116 CMPMedica (2009), Vidal Việt Nam, tr 34, 50-51, 131,498 Trường Đại Học Dược Hà Nội (2005), Một số chuyên đề bào chế đại, NXB Y học Hà Nội, tr.165 – 172 Nguyễn Thị Huyền (2014), Nghiên cứu bào chế viên nén amoxicilin kết dính sinh học dày, Luận văn thạc sỹ dược học, Trường Đại học dược Hà Nội Vũ Thị Thúy (2013), Nghiên cứu bào chế vi cầu acyclovir kết dính sinh học theo phương pháp cố định gel ion, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội Tài liệu tiếng Anh 10 Ahmed M.G, et al (2012), “Formulation and Evaluation Of Gastric Mucoadhesive Drug Delivery Systems Of Captopril”, J Current Pharm Res., 2(1), pp 26-32 11 Amid A., et al (2011), “Theories and factors afecting mucoadhensive drug delivery systems: a review”, IJRAP, 2(4), pp 1155 – 1161 12 Andrews G P., Laverty T P., and Jones D S (2009), "Mucoadhesive polymeric platforms for controlled drug delivery", Eur J Pharm Biopharm, 71(3), pp 505-518 13 Arora S., Bisen G., and Budhiraja R (2012), "Mucoadhesive and mucopenetrating delivery systems for eradication of Helicobacter pylori", Asian J Pharmaceutics, 6(1), vol.6, pp.18-30 14 Arora S., Gupta S., Narang R K., et al (2011), "Amoxicilin loaded chitosanalginate polyelectrolyte complex nanoparticles as mucopenetrating delivery system for H Pylori" Sci Pharm, 79 (3), pp 673-694 15 Asane G S., et al (2008), "Polymers for mucoadhesive drug delivery system: a current status", Drug Dev Ind Pharm, 34(11), pp 1246-1266 16 Belgamwar V., et al (2009), “Formulation and Evaluation of Oral Mucoadhesive Multiparticulate system Containing Metoprolol Tartarate: An In Vitro – Ex Vivo Characterization”, Current Drug Del., 6, pp 113-121 17 Carvalho F.C., et al.(2010), “Mucoadhesive drug delivery systems”,Brazilian J Pharm Sci., vol 46, pp.1 – 16 18 Chadha R., Kashid N., and Jain D (2003), "Kinetic studies of the degradation of an aminopenicillin antibiotic (amoxicilin trihydrate) in aqueous solution using heat conduction microcalorimetry", J pharmacy and pharmacology, 55(11), pp 1495-1503 19 Chowdary K.P.,et al (2004), “Mucoadhesive Microspheres for Controlled Drug Delivery”, Biol Pharm Bull, 27(11), pp 1717—1724 20 De Boer W A and Tytgat G N (2000), "Regular review: treatment of Helicobacter pylori infection", BMJ, 320(7226), pp 31-34 21 Dhaliwal S., et al (2008), “Mucoadhesive Microspheres for Gastroretentive Delivery of Acyclovir: In Vitro and In Vivo Evaluation”, The AAPS Journal, Vol 10, pp 323- 330 22 Dhawan S., et al (2005), "Applications of poly(ethylen oxide) in drug delivery systems" Pharm Technol, 29(9), pp 82-96 23 Diasa R.J.,et al (2009),“Design and Development of Mucoadhesive Acyclovir Tablet”, IJPR, (4), pp 231-239 24 Dodou D., Breedveld P., and Wieringa P A (2005), "Mucoadhesives in the gastrointestinal tract: revisiting the literature for novel applications", European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics, 60(1), pp 1-16 25 EI – Kamel A., et al (2002), "Chitosan and Sodium Alginat - Based Bioadhesive Vaginal Tablets" AAPS PharmaSci 4(4), pp 1-7 26 Elmolla E S and Chaudhuri M (2009), "Degradation of the antibiotics amoxicilin, ampicillin and cloxacillin in aqueous solution by the photoFenton process", J Hazard Mater, 172(2-3), pp 1476-1481 27 Emara L H., Abdou A R., et al (2013), "In Vitro Release Evaluation of Gastroretentive Amoxicilin Floating Tablets Employing a Spescific Design of the Flow - Through Cell" Dissolution Technologies, pp 27-34 28 Frenck Jr R W and Clemens J (2003), "Helicobacter in the developing world", Microbes and infection, 5(8), pp 705-713 29 Goswami D.S., et al (2012), “ Development of new mucoadhesive polyme from natural source”, Asian J Pharm Clin Res., Vol 5, pp.247-250 30 Jain N.,et al (2012), “Microspheres Mucoadhesion Based Controlled Drug Delivery System”, RGUHS J Phar Sci., 2(3), pp 28- 40 31 Lahoti S.S., et al.(2011), “Mucoadhesive Drug Delivery System: A Review”, Indo-Global J Pharm Sci., Vol 1, pp 243-251 32 Legen I., et al (2006), "The evaluation of some pharmaceutically acceptable excipients as permeation enhancers for amoxicilin", International J pharmaceutics, 2(1), pp 84-89 33 Lin YH, Chung CK, Chen CT, Liang HF, Chen SC, Sung HW (2009), “Development of pH-responsive chitosan/heparin nanoparticles for stomachspecific anti-Helicobacter pylori therapy”, Biomaterials, 30, pp 3332-3342 34 Liu Z., et al (2007), "In vitro and in vivo studies on mucoadhesive microspheres of amoxicilin", J Control Release, 102(1), pp 135-144 35 Mishra S., Singh V., Rao G R., et al.(2008), "Prevalence of Helicobacter pylori in asymptomatic subjects a nested PCR based study", Infect Genet Evol, 8(6), pp 815-819 36 Murakami K., Okimoto T., Kodama M., et al (2006), "Comparison of amoxicilin-metronidazole plus famotidine or lansoprazole for amoxicilinclarithromycin-proton pump inhibitor treatment failures for Helicobacter pylori infection" Helicobacter, 11 (5), pp 436-440 37 Nallasamy V., Ramanathan S (2012), "Role of novel drug delivery systems in stomach specific anti helicobacter pylori therapy" Journal of Phamarcy research, (2), pp 1165-1168 38 Narkar M, Sher P, Pawar A (2010), “Stomach-specific controlled release gellan beads of acid-soluble drug prepared by ionotropic gelation method” AAPS PharmSciTech; 11, pp 267-277 39 Ozbek A., Ozbek E., Dursun H., et al (2010), “Can Helicobacter pylori invade human gastric mucosa: an in vivo study using electron microscopy, immunohistochemical methods, and real-time polymerase chain reaction”, J Clin Gastroenterol, 44(6), pp 416-422 40 Parmar H., et al (2010), “Different methods of formulation and evaluation of mucoadhensive microsphere”, IJABPT,1 (3), pp 1157- 1167 41 Patel J K., Chavda J R., (2009), "Formulation and evaluation of stomachspecific amoxicilin-loaded carbopol-934P mucoadhesive microspheres for anti-Helicobacter pylori therapy" J Microencapsul, 26 (4), pp 365-376 42 Patel J K., Patel MM (2007), "Stomach specific anti-Helicobacter pylori therapy: Preparation and evaluation of amoxicilin-loaded chitosan mucoadhesive microspheres" Curr Drug Del, 4, pp 41-50 43 Patil P., et al (2012), “A review on ionotropic gelation method: Novel approach for controlled gastroretentive Glelispheres”, Int J Pharm Pharm.Sci., vol 4, pp.27-32 44 Patronella CK, Vanek I, Bowen JC (1988), “In vivo measurement of gastric mucus pH in canines: effect of high luminal acidity and prostaglandin E2”, Gastroenterology, 95(3), pp.612-618 45 Pedrazzoli J J., Calafatti S A., Ortiz R A., et al (2001), "Transfer of clarithromycin to gastric juice is enhanced by omeprazole in Helicobacter pylori-infected individuals" Scand J Gastroenterol, 36 (12), pp 1248-1253 46 Rajnikanth PS, Balasubramaniam J, Mishra B (2007), “Development and evaluation of a novel floating in situ gelling system of amoxicilin for eradication of Helicobacter pylori”, Int J Pharm, 335, pp.114-122 47 Ranade V.,et al (2011), Drug delivery systems, Taylor and Francis group, USA,pp 85 -149 48 Raymond C R., Paul J S., Marian E Q (2009), Handbook of Pharmaceutical Excipients, Pharmaceutical Press and American Pharmacists Association, pp 522-524 49 Sahasathian T., et al (2007), "Sustained release of amoxicilin from chitosan tablets", Arch Pharm Res, 30(4), pp 526-531 50 Salamat-Miller N., Chittchang M., and Johnston T P (2005), "The use of mucoadhesive polymers in buccal drug delivery", Advanced drug delivery reviews, 57(11), pp 1666-1691 51 Shah S., et al (1999), "Evaluation of the factors influencing stomach-specific delivery of antibacterial agents for Helicobacter pylori infection", J Pharm Pharmacol, 51(6), pp 667-672 52 Singh S.K., et al (2010), “Pharmaceutical characterization of amoxicilin trihydrate as mucoadhesive microspheres in management of H pylori”, International Journal of Pharmtech Research, Vol.2, No.1, pp 348-358 53 Sudhakar Y., Kuotsu K (2006), "Buccal bioadhesive drug delivery-a promising option for orally less efficient drugs" J Control Rel., 114(1), pp 15 - 40 54 Turnberg LA, Ross IN (1984), “Studies of the pH gradient across gastric mucus”, Scand J Gastroenterol Suppl, 92, pp 48-50 55 Udayakumar T., et al (2013), "Design and development of bioadhesive gastro retentive drug delivery system of metoprolol succinate" Int J Res Dev Pharm L Sci., 2(2), pp 355-362 56 USP 36, pp 711-712 57 Vahdat L., Sunderland V.B (2007), “Kinetics of amoxicilin and clavulanate degradation alone and in combination in aqueous solution under frozen conditions”, International Journal of pharmaceutics, 342, pp.95-104 58 Venkateswaramurthy N., et al (2010), “Design, development and evaluationof amoxicilin trihydrate as mucoadhesive microspheres for Helicobacter pylorieradication therapy”, International Journal of Applied Phar., vol (1), pp 23-25 59 Vinod K.R., et al (2012), “Critical Review on Mucoadhesive Drug Delivery Systems”, Hygeia.J.D.Med, (1), pp 7- 28 60 Wang J, et al (2000), “Positively charged gelatin microspheres as gastric mucoadhesive drug delivery system for eradication of H pylori.” Drug Deliv, 7, pp 237-243 61 Warren J R., Marshall B (1983), “Unidentified curved bacilli on gastric epithelium in active chronic gastritis”, Lancet, pp.1273–1275 62 Yadav S., et al (2011), “Formulation and In Vitro and In Vivo Characterization of Acyclovir Loaded Mucoadhesive Microspheres”, J Pharm Sci Tech., Vol (1), pp 441-447 63 Yih Yong Wong, et al (2011), “Degradation of PEG and non-PEG alginate chitosan microcapsules in different pH environments”, Polymer Degradation and Stability, 96, pp 2189-2197 [...]... Nghiên cứu bào chế vi cầu amoxicilin kết dính sinh học tại dạ dày với các mục tiêu sau: 1 Xây dựng được công thức bào chế vi cầu amoxicilin kết dính sinh học tại dạ dày 2 Bước đầu nghiên cứu bào chế vi n nang chứa vi cầu amoxicilin kết dính sinh học hàm lượng 250mg Để thực hiện các mục tiêu trên, đề tài đã tiến hành các nội dung: - Xây dựng được công thức bào chế vi cầu amoxicilin kết dính sinh học. .. thuốc tại vị trí tác dụng và cải thiện nồng độ kháng sinh trong dạ dày để điều trị nhiễm khuẩn H.P [37] Hiện nay trên thế giới đã có một số nghiên cứu về các dạng bào chế chứa amoxicilin có khả năng làm tăng thời gian lưu thuốc tại dạ dày, giúp cải thiện hiệu quả điều trị như: vi n nén, vi cầu nổi và/hoặc kết dính niêm mạc… Trong đó, vi cầu kết dính sinh học có khả năng tăng thời gian lưu thuốc tại dạ dày. .. phương pháp trao đổi ion cố định gel - Đánh giá được khả năng kết dính sinh học in vivo của vi cầu bào chế trên động vật thí nghiệm - Bào chế vi n nang chứa vi cầu amoxicilin kết dính sinh học hàm lượng 250mg - Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng và bước đầu theo dõi độ ổn định của vi n bào chế 2 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Sinh lý bệnh loét dạ dày – tá tràng liên quan đến Helicobacter pylori Kể từ khi được... Trong các chế phẩm ở bảng trên, không có chế phẩm nào thuộc hệ kết dinh sinh học chứa amoxicilin Do vậy, nghiên cứu bào chế hệ KDSH chứa amoxicilin là cần thiết và có ý nghĩa khoa học 6 1.3 Hệ thuốc kết dính sinh học 1.3.1 Khái niệm Kết dính sinh học là trạng thái gồm hai bề mặt được gắn kết với nhau trong một thời gian dài nhờ lực liên kết bề mặt, trong đó có ít nhất một bề mặt có nguồn gốc sinh học [29]... năng phân hủy sinh học, không độc, liên kết sinh học tốt, đặc biệt là kết dính sinh học 1.3.4 Một số phương pháp đánh giá khả năng kết dính sinh học áp dụng đối với vi cầu Các hệ KDSH giữ vai trò quan trọng trong vi c tăng SKD của thuốc thông qua vi c tăng thời gian lưu giữ của thuốc tại vị trí hấp thu tối ưu Vì vậy, các phương pháp thử kết dính là một bước quan trọng để phát triển dạng bào chế này Có... phát xạ gamma Nhấp nháy đồ cho phép thấy rõ đường đi của thuốc trong cơ thể [19] 1.4 Một số nghiên cứu về các hệ kết dính sinh học 1.4.1 Các nghiên cứu trên thế giới 1.4.1.1 Nghiên cứu bào chế vi cầu AMOX KDSH Năm 2009, Singh J.K, Chidrawar V.R và cộng sự [52] đã tiến hành bào chế vi cầu amoxicilin kết dính dạ dày sử dụng tá dược Eudagit RS100 và HPMC K4M bằng phương pháp bốc hơi dung môi Eudragit được... nhất định, đếm số vi cầu còn dính trên niêm mạc Khả năng bám dính được tính bằng tỷ lệ vi cầu còn lại so với số vi cầu ban đầu 1.3.4.2 Các phương pháp thử kết dính sinh học in vivo + Cho chuột uống một lượng chính xác vi cầu bằng ống xông và chiêu với nước Sau khi uống một khoảng thời gian nhất định, gây chết chuột, phẫu thuật đường tiêu hóa, đếm số lượng vi cầu còn kết dính lại trên dạ dày và ruột non... bám dính tại dạ dày và khả năng ức chế H.P tốt hơn so với thuốc quy ước 19 Năm 2010, Venkateswaramurthy N cùng cộng sự [58] đã tiến hành bào chế vi cầu amoxicilin bằng phương pháp bốc hơi dung môi, sử dụng Carbopol 934P và Eudragit RL 100 Nghiên cứu đã đánh giá độ ổn định của vi cầu amoxicilin trong môi trường HCl 0,1N, hiệu suất tạo vi cầu, kích thước vi cầu tạo thành, đánh giá khả năng kết dính sinh. .. gần 4 lần so với vi cầu không kết dính (16,2 %, n = 5), p < 0,01 Ngoài ra, vi cầu kết dính niêm mạc của amoxicilin có thể lưu lại trong đường tiêu hóa trong một thời gian dài hơn thời gian và kết quả diệt H.P cao hơn so với bột amoxicilin Năm 2010, Narkar và cộng sự [38] đã nghiên cứu bào chế hạt gellan kết dính sinh học amoxicilin bằng phương pháp cố định gel bằng cation Những lượng amoxicilin khác... trước đó Tiếp tục ngâm có khuấy từ dung dịch chứa vi cầu mới tạo thành trong thời gian thích hợp với tốc độ 200 vòng/phút đối với MT (1) và 600 vòng/phút đối với MT (2) + Gạn rửa vi cầu bằng nước RO (50ml × 3 lần), sấy ở nhiệt độ thích hợp đến khi vi cầu đạt độ ẩm < 3% 2.2.1.2 Bào chế vi n nang chứa vi cầu amoxicilin kết dính sinh học Vi cầu amoxicilin bào chế được đóng vào nang cứng số 0 với hàm lượng ... cứu bào chế vi cầu amoxicilin kết dính sinh học dày với mục tiêu sau: Xây dựng công thức bào chế vi cầu amoxicilin kết dính sinh học dày Bước đầu nghiên cứu bào chế vi n nang chứa vi cầu amoxicilin. .. giới…………………………….……………… 15 1.4.1.1 Nghiên cứu bào chế vi cầu amoxicilin kết dính sinh học ……………… 15 1.4.2 20 Nghiên cứu bào chế hệ kết dính sinh học khác chứa amoxicilin … Các nghiên cứu nước………………………………………………………... lực kết dính sinh học vi cầu amoxicilin kết dính sinh học ……………………………………………………….… 60 4.2.1 Thử nghiệm kết dính sinh học in vitro……………………………………….… 60 4.2.2 Thử nghiệm kết dính sinh học in vivo…………………………………………