thực hiện tiêu bản mô động vật dạ cỏ, dạ lá sách và dạ tổ ong trên bò; gan trên thỏ; tuyến fabricius trên gà và dạ dày trên heo

TÓM LƯỢC Với đề tài “thực hiện tiêu bản mô động vật: dạ cỏ, dạ lá sách và dạ tổ ong trên bò; gan trên thỏ; tuyến Fabricius trên gà và dạ dày trên heo” đươc thực hiện bằng phương pháp ti

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN THÚ Y

NGUYỄN HỮU ANH

THỰC HIỆN TIÊU BẢN MÔ ĐỘNG VẬT:

DẠ CỎ, DẠ LÁ SÁCH VÀ DẠ TỔ ONG TRÊN BÒ; GAN TRÊN THỎ; TUYẾN FABRICIUS

TRÊN GÀ VÀ DẠ DÀY TRÊN HEO

Luận văn tốt nghiệp Ngành: THÚ Y

Cần Thơ, 2014

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

TRÊN GÀ VÀ DẠ DÀY TRÊN HEO

MSSV: 3103003 Lớp: Thú Y

Cần Thơ, 2014

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Cần Thơ, ngày tháng năm Cần Thơ, ngày tháng năm

Duyệt Bộ môn Cán bộ hướng dẫn

Lê Hoàng Sĩ

Cần Thơ, ngày… tháng… năm…

Duyệt khoa Nông Nghiệp & SHƯD

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân Các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn tốt nghiệp là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình luận văn nào trước

Tác giả luận văn

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian học tập tại trường, tôi đã gặp rất nhiều khó khăn và vướng mắc nhưng bên cạnh tôi luôn có sự động viên, ủng hộ của gia đình Đặc biệt là người mẹ thân yêu của tôi, sự giúp đỡ của thầy cô, bạn bè, tôi đã cố gắng hoàn thành tốt khóa học và luận văn tốt nghiệp của mình

Với tất cả lòng kính trọng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến quý thầy cô Bộ môn Thú Y, các thầy cô của trường Đại Học Cần Thơ đã dạy dỗ tôi trong suốt thời gian học tập tại trường

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Lê Hoàng Sĩ và thầy Trần Hiền Nhơn đã hết lòng hướng dẫn, quan tâm, lo lắng, động viên giúp tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả các bạn sinh viên lớp Thú Y khóa 36 luôn động viên, giúp đỡ và chia sẽ những niềm vui nổi buồn trong suốt thời gian học tập

Xin chân thành biết ơn và kính chúc quý thầy cô, người thân và bạn bè tôi được dồi dào sức khỏe, có thật nhiều niềm vui và thành công trong cuộc sống

MỤC LỤC

Trang duyệt i

Lời cam đoan ii

Lời cảm ơn iii

Mục lục iv

Danh mục hình vii

Tóm lược viii

Chương 1: ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 2: CƠ SỞ LÝ LUẬN 2

2.1 Một số khái niệm về mô học 2

2.1.1 Khái niệm về mô 2

2.1.2 Biểu mô 2

2.1.2.1 Biểu mô phủ 2

2.1.2.2 Biểu mô tuyến 3

2.1.3 Tổ chức liên kết 3

2.1.4 Tổ chức cơ 3

2.1.5 Tổ chức thần kinh 4

2.2 Tổng quan về phương pháp thực hiện tiêu bản hiển vi 4

2.2.1 Lấy mẫu 4

2.2.2 Cố định 5

2.2.3 Khử nước 6

2.2.4 Tẩm dung môi trung gian của Paraffin 6

2.2.5 Tẩm paraffin 6

2.2.6 Đúc khuôn 6

2.2.7 Cắt lát mỏng 7

2.2.8 Tải tiêu bản lên lame 7

2.2.9 Nhuộm kép Hematoxylin - Eosin Y 7

2.2.9.1 Sự nhuộm màu tăng, giảm dần 7

2.2.9.2 Sự nhuộm màu nối tiếp, đồng thời 8

2.2.9.3 Nhuộm màu trực tiếp, gián tiếp 8

2.2.9.4 Nhuộm màu khác 8

2.2.10 Dán lamelle 8

2.3 Tổng quan về cấu tạo vi thể 9

2.3.1 Tuyến Fabricius 9

2.3.2 Gan 9

2.3.2.1 Cấu tạo 9

2.3.2.2 Chức năng 10

2.3.3 Dạ dày 11

2.3.4 Dạ cỏ 11

2.3.5 Dạ tổ ong 12

2.3.6 Dạ lá sách 12

Chương 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

3.1 Phương tiện 13

3.1.1 Địa điểm thực hiện 13

3.1.2 Dụng cụ, trang thiết bị, hóa chất 13

3.1.2.1 Dụng cụ 13

3.1.2.2 Hóa chất 13

3.2 Phương pháp tiến hành 13

3.2.1 Lấy mẫu lớn 13

3.2.2 Cố định mẫu 14

3.2.3 Lấy mẫu nhỏ 14

3.2.4 Rửa mẫu 14

3.2.5 Khử nước 14

3.2.6 Tẩm dung môi trung gian 15

3.2.7 Tẩm paraffin 15

3.2.8 Đúc khuôn 15

3.2.8.1 Chuẩn bị 15

3.2.8.2 Tiến hành 15

3.2.9 Cắt mẫu 16

3.2.9.1 Chuẩn bị 16

3.2.9.2 Tiến hành 17

3.2.10 Tải, dán, hấp mẫu 17

3.2.10.1 Chuẩn bị 17

3.2.10.2 Tiến hành 18

3.2.11 Nhuộm mẫu 19

3.2.11.1 Chuẩn bị 19

3.2.11.2 Tiến hành 20

3.2.12 Dán lamelle - Dán nhãn 21

3.2.12.1 Cố định mẫu bằng Canada balsam 21

3.2.12.2 Dán nhãn 21

Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22

4.1 Tuyến Fabricius 23

4.2 Gan 24

4.3 Dạ dày 26

4.4 Dạ cỏ 28

4.5 Dạ tổ ong 29

4.6 Dạ lá sách 30

Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 32

Tài liệu tham khảo 33

Phụ chương 34

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 Tiêu bản vi thể tuyến Fabricius 9

Hình 2 Paraffin trong tủ sấy 600C 16

Hình 3 Mẫu được đúc khuôn và khuôn đúc mẫu 16

Hình 4 Máy cắt mẫu 17

Hình 5 Chậu nước ấm đăt trên bếp tải 18

Hình 6 Dãy băng mẫu được chuyển vào chậu nước ấm 18

Hình 7 Dãy băng mẫu được tải lên chậu nước ấm 19

Hình 8 Dùng lame vớt mẫu 17

Hình 9 Nhuộm mẫu 21

Hình 10 Tiêu bản vi thể của tuyến Fabricius cắt ngang (X4) 23

Hình 11 Tiêu bản vi thể của tuyến Fabricius cắt ngang (X40) 23

Hình 12 Tiêu bản vi thể của gan cắt ngang (X10) 24

Hình 13 Tiêu bản vi thể của gan cắt ngang (X40) 25

Hình 14 Tiêu bản vi thể của gan cắt ngang (X40) 25

Hình 15 Tiêu bản vi thể của dạ dày cắt ngang (X10) 26

Hình 16 Tiêu bản vi thể áo trong của dạ dày cắt ngang (X40) 27

Hình 17 Tiêu bản vi thể của tuyến dạ dày cắt ngang (X40) 27

Hình 18 Tiêu bản vi thể của dạ cỏ bò cắt ngang (X10) 28

Hình 19 Tiêu bản vi thể của dạ tổ ong bò cắt ngang (X10) 29

Hình 20 Tiêu bản vi thể của dạ lá sách bò cắt ngang (X10) 30

TÓM LƯỢC

Với đề tài “thực hiện tiêu bản mô động vật: dạ cỏ, dạ lá sách và dạ tổ ong trên bò; gan trên thỏ; tuyến Fabricius trên gà và dạ dày trên heo”

đươc thực hiện bằng phương pháp tiêu bản cắt lát và nhuộm kép Hematoxylin

và Eosin Y; nhằm tạo ra tiêu bản vi thể đối với từng loại tổ chức cụ thể như trên Trong thời gian từ tháng 04 đến tháng 08 năm 2014, tại phòng thí nghiệm

mô học thuộc bộ môn Thú Y - Khoa Nông nghiệp & SHƯD - Đại học Cần Thơ cùng các trang thiết bị và các hóa chất cần thiết, tôi đã thực hiện được

350 lame tiêu bản trong đó chọn ra 175 lame tiêu bản hoàn chỉnh phục vụ cho công tác nghiên cứu, giảng dạy và hoc tập Qua đó rút ra được những bài học

về kinh nghiệm trong việc thực hiện tiêu bản vi thể và một số đặc điểm riêng trên từng mẫu so với quy trình chung Tôi đã khảo sát phương pháp thực hiện tiêu bản hiển vi cố định mô động vật và tìm ra thứ tự thời gian cố định mẫu thích hợp cho từng loại tổ chức như sau: cố định 36 giờ là dạ cỏ, dạ lá sách, dạ

tổ ong; cố định 24 giờ là dạ dày, gan, tuyến Fabricius

Chương 1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Đối với sinh viên ngành Thú y và ngành Chăn nuôi thì việc hiểu biết rõ

về cấu tạo cơ thể, cũng như các tổ chức của cơ thể động vật ở nhiều mức độ là điều rất quan trọng Trong đó, cấu tạo ở mức độ vi thể là một trong những lĩnh vực hết sức quan trọng Nó giúp cho chúng ta có thể giải thích được các quá trình cấu trúc sinh lý bình thường của cơ thể

Cơ thể người và động vật là một thể thống nhất, toàn vẹn và hoàn chỉnh Bất kỳ cấu tạo nào điều đảm nhận chức năng nhất định Ngược lại, bất kỳ chức năng nào cũng điều do một hoặc một số cấu tạo thực hiện, để phù hợp với điều kiện sống

Trong thực tiễn ngành thú y, để tìm hiểu rõ về mức độ gây thiệt hại, các tổn thương khi mắc bệnh, cơ chế sinh bệnh,… của một loại bệnh nào đó trên

cơ thể vật nuôi thì việc khảo sát ở mức độ tế bào là không thể bỏ qua Trong chuẩn đoán và điều trị đôi lúc chúng ta cũng cần những xét nghiệm đặc biệt trên bệnh tích để phân biệt các bệnh với nhau Trong đó có việc làm và đọc tiêu bản vi thể bệnh tích Nhằm đưa ra các hướng điều trị thích hợp và có hiệu quả Nhưng ta muốn khảo sát được mức độ tế bào của mô bệnh, thì trước hết

ta phải khảo sát ở mức độ tế bào của mô bình thường

Với lợi ích thiết thực nêu trên tôi thực hiện đề tài “thực hiện tiêu bản

mô động vật: dạ cỏ, dạ lá sách và dạ tổ ong trên bò; gan trên thỏ; tuyến Fabricius trên gà và dạ dày trên heo”

Mục tiêu của đề tài:

Thực hiện những tiêu bản có chất lượng phục vụ cho công tác nghiên cứu, giảng dạy và học tập

Đọc và mô tả về mặt tổ chức học các tiêu bản đã thực hiện bao gồm: dạ

cỏ, dạ lá sách, dạ tổ ong, da dày, gan, tuyến Fabricius

Chương 2

CƠ SỞ LÝ LUẬN

2.1 MỘT SỐ KHÁI NIỆM VỀ MÔ HỌC

2.1.1 Khái niệm về mô

Tế bào là đơn vị sống đã tạo nên những cơ quan và cấu trúc cơ thể sinh vật Chúng thường tập hợp lại thành những cấu trúc gọi là mô Trong cơ thể chỉ có bốn loại mô cơ bản gồm: biểu mô, mô liên kết, mô cơ và mô thần kinh

2.1.2 Biểu mô

Là nhóm tế bào bao phủ mặt ngoài cơ thể hay lót bên trong những ống,

xoang của cơ thể sinh vật Biểu mô phân hóa cao độ tạo thành tuyến

Cấu tạo chung của biểu mô

- Biểu mô gồm một hay nhiều lớp tế bào xếp khít nhau

- Dưới lớp biểu mô là lớp màng đáy

- Dưới lớp màng đáy là tổ chức liên kết mềm

- Biểu mô hiện diện ở hai mặt khô và ướt của cơ thể

Nhiệm vụ

- Biểu mô bảo vệ cơ thể hay bộ máy không bị tác động của ngoại cảnh làm tổn thương Khi bị tổn thương, chúng có thể hàn gắn và phát triển lại được

- Biểu mô phủ của một số cơ quan có khả năng hấp thu một số chất như: biểu mô ruột, biểu mô bàng quang,…

- Biểu mô phủ các tuyến tiết ra một số chất giúp cho quá trình sinh trưởng, phát dục và trao đổi của cơ thể Đó là biểu mô tuyến nội tiết và tuyến ngoại tiết

Phân loại biểu mô: dựa vào chức năng và cấu trúc, người ta chia biểu mô làm

hai loại là biểu mô phủ và biểu mô tuyến

2.1.2.1 Biểu mô phủ: là những biểu mô lót mặt ngoài cơ thể hoặc phủ các

xoang tự nhiên trong cơ thể Ví dụ: Thành các ống tiêu hoá, ống tiết niệu, bàng quang, tử cung…Dựa vào số lớp tế bào biểu mô trên màng đáy và hình dạng tế bào ở lớp trên cùng mà người ta phân biểu mô phủ thành:

Biểu mô phủ đơn

Biểu mô phủ đơn lát: là lớp tế bào hình lát, dẹt, xếp sát vào nhau, rìa tế bào có dạng răng cưa, nhân tròn nằm giữa tế bào và nằm nổi lên bề mặt biểu

mô

Biểu mô phủ đơn hộp: là lớp tế bào có dạng hình hộp, nhân tròn to và nằm giữa tế bào

Biểu mô phủ đơn trụ: là lớp các tế bào hình trụ hay hình ống xếp xít nhau, ranh giới giữa các tế bào rõ; nhân tế bào hình tròn hoặc hình thoi nằm giữa hay thiên về cực đáy tế bào

Biểu mô phủ kép

Biểu mô phủ kép lát: có nhiều lớp tế bào dẹt, xếp chồng chất lên nhau Lớp tế bào trên cùng có hình lát dẹt, càng sâu hơn là những tế bào đa giác hay hình hộp Nhân nằm giữa tế bào Đôi khi lớp trên cùng hoá sừng

Biểu mô phủ kép trụ: lớp trên cùng có hình trụ, ở tầng sâu hơn có dạng

hình hộp, đa giác, hình thoi…Nhân thiên về cực đáy tế bào

Biểu mô phủ kép trụ giả: chỉ có một lớp tế bào nhưng có một số tế bào không lên đến bề mặt biểu mô, nhân nằm ở đáy tế bào Những tế bào còn lại nhô lên trên bề mặt biểu mô, nhân nằm ở trên Do đó, khi nhìn vào tiêu bản giống như có hai hàng tế bào

Biểu mô phủ kép biến dị: có lớp tế bào trên cùng rất to, có thể giãn nở được, tế bào bên dưới hình đa giác

2.1.2.2 Biểu mô tuyến

Là những tập đoàn tế bào biệt hoá cao để thích nghi với chức năng chế tiết và bài xuất

Tuyến đơn bào: chỉ có một tế bào tạo thành, mang cả hai nhiệm vụ chế tiết và bài xuất

Tuyến đa bào: do nhiều tế bào hơp lại tạo thành tuyến, có cấu trúc phức tạp, to nhỏ khác nhau Căn cứ vào tuyến có ống dẫn hay không có ống dẫn, người ta phân biệt:

Tuyến ngoại tiết: có ống dẫn chất tiết ra ngoài hay vào các xoang, ống thông với bên ngoài Tuyến ngoại tiết gồm: tuyến túi, tuyến ống, tuyến đơn, tuyến tạp

Tuyến nội tiết: chỉ có các tế bào chuyên làm nhiệm vụ chế tiết, không có ống dẫn Các chất tiết tạo thành được thẩm thấu qua màng tế bào rồi ngấm vào các vi huyết quản vào máu Các mao mạch tạo thành lưới chung quanh tuyến Tuyến nội tiết gồm: tuyến tản mác, tuyến túi, tuyến lưới

2.1.3 Tổ chức liên kết

Gồm ba thành phần: tế bào, chất gian bào, những sợi liên kết

Ngoài chức năng chống đỡ, mô liên kết còn có chức năng dự trữ, bảo vệ, vận chuyển các chất và sửa chữa, hàn gắn vết thương (Lâm Thị Thu Hương, 2005)

Tổ chức liên kết đa dạng gồm: dạng lỏng, dạng rắn, dạng mềm

2.1.4 Tổ chức cơ

Là tập hợp những tế bào đã biệt hoá cao để đảm nhận chức năng co giãn Trong cơ thể động vật có ba loại mô cơ: cơ trơn, cơ vân, cơ tâm (cơ tim)

2.1.5 Tổ chức thần kinh

Là loại mô cao cấp có nhiệm vụ điều khiển, đảm bảo tính thống nhất của mọi hoạt đông trong cơ thể, làm cho cơ thể có những đáp ứng thích hợp trước những kích thích và thay đổi của môi trường Gồm hai thành phần: thần kinh trung ương (não bộ và tuỷ sống) và thần kinh ngoại vi (dây thần kinh và hạch thần kinh)

2.2 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN TIÊU BẢN HIỂN

VI

Kính hiển vi là một phương tiện không thể thiếu trong nghiên cứu tổ chức học và tiêu bản có độ dày thích hợp cho phép quan sát được mẫu dưới kính hiển vi

Có nhiều phương pháp làm tiêu bản để nghiên cứu bao gồm: phương pháp xét nghiệm tươi; phương pháp tế bào, hóa mô; phương pháp phóng xạ tự chụp; phương pháp làm tiêu bản cố định và nhuộm màu

Trong các phương pháp trên phương pháp làm tiêu bản hiển vi cố định

và nhuộm màu là phương pháp phổ biến dùng trong xét nghiệm mẫu bệnh so với đối chứng

Phương pháp làm tiêu bản cố định và nhuộm màu:

Thực hiện tiêu bản hiển vi cố định bằng phương pháp tiêu bản cắt lát và nhuộm kép bằng Hematoxylin và Eosin Y Kỹ thuật mô học này nhằm tạo được những mảnh cắt mỏng, trong suốt của mô và của cơ quan, cho phép quan sát được dưới kính hiển vi Thêm vào đó, mảnh cắt sẽ nhuộm bằng các thuốc nhuộm đặc hiệu, các phần của mô học bắt màu khác nhau giúp cho việc quan

sát dễ dàng

Tiêu bản hiển vi cố định được thực hiện theo phương pháp này phải trãi qua nhiều giai đoạn Phải thực hiện tốt tất cả các giai đoạn mới thu được tiêu bản có chất lượng Nếu một giai đoạn nào đó thực hiện không tốt thì tiêu bản thu được sẽ không đạt được chất lượng Quy trình được thực hiện qua các giai đoạn:

2.2.1 Lấy mẫu

Là bước đầu tiên có mục đích là lấy mô, cơ quan ở cơ thể sống hay đã chết

Khi thực hiện phải tuân thủ một số quy tắc sau:

- Mẫu được lấy phải tươi

- Động tác lấy mẫu phải nhẹ nhàng, tránh gây những biến đổi do tác nhân

- Khi cắt xong phải cố định ngay trong hóa chất để tránh hiện tượng hoại

tử sau khi chết của tế bào (Phạm Phan Địch và Trịnh Bình, 1998)

2.2.2 Cố định

Là thủ thuật làm chết tế bào nhưng vẫn giữ chúng trong tình trạng giống như khi chúng còn sống Việc cố định đạt được kết quả tốt khi tế bào giữ nguyên được hình dáng, thành phần cấu tạo như khi còn sống, đồng thời không làm xuất hiện những chi tiết mới

Dung dịch cố định có tác dụng ngăn cản sự hoại tử sau khi tế bào đã chết Dung dịch cố định tốt là dung dịch có tác dụng nhanh mà ít gây sự thay đổi cấu trúc Mô được cố định tốt khi tế bào cấu tạo nên mô đó vẫn giữ nguyên hình dáng, đồng thời vẫn giữ được mối liên quan tương hỗ trong tế bào và trong mô giống như khi còn sống Mọi sự thay đổi về kích thước và cấu trúc không vượt quá 0.2mm (Phạm Phan Địch và Trịnh Bình, 1998)

Phương pháp cố định phụ thuộc vào bản chất của mô cần cố định, mục đích cần nghiên cứu, tính chất thuốc cố định Vì vậy, việc chọn thuốc cố định mẫu rất quan trọng

Một số loại thuốc cố định thường gặp:

- Thuốc cố định khoáng chất: acid osmic, acid chromic và các thuốc cố định muối khoáng

- Thuốc cố định hữu cơ: bao gồm các acid hữu cơ như acid acetic, acid piric và các chất khử oxy như: methylic, ethylic, formaldehyde

- Các dung dịch cố định: dung dịch Bouin, dung dịch Duboscq- Brasil, dung dịch Carnoy, dung dịch Branca

- Thời gian cố định phụ thuộc vào từng loại mô và từng loại thuốc dùng

để cố định; nguyên tắc kéo dài thời gian cố định tốt hơn là rút ngắn (trừ một số thuốc cố định làm giòn mô)

Việc rửa mô sau khi cố định có tầm quan trọng lớn Trên nguyên tắc sau khi cố định phải làm cho mô mất chất cố định càng sớm càng tốt, vì những chất cố định có ảnh hưởng đến việc nhuộm và bảo tồn tiêu bản Các chất cố định khác nhau có cách rửa mô khác nhau Có thể rửa ngang với thời gian cố định nếu rửa bằng nước Các dung dịch cố định có Hg rửa với dung dịch cồn

và Iod (Phạm Phan Địch và Trịnh Bình, 1998)

Nguyên tắc cố định mẫu:

- Mẫu phải được cố định ngay sau khi lấy

- Không được làm dập, nát mẫu

- Mẫu không được cắt quá dày

- Dung dịch dùng để cố định phải đạt đúng nồng độ

- Thời gian cố định thích hợp 48-72 giờ

2.2.3 Khử nước

Chúng ta phải khử nước vì paraffin không tan trong nước Vì vậy paraffin không thể ngấm vào khối mẫu còn nước

Mục đích của việc khử nước là rút hết nước trong mẫu ra mà không làm

mô hoặc tế bào bị thay đổi về cấu tạo và vị trí Mẫu sau khi cố định được rửa nước Sau đó, chuyển sang ngâm trong cồn 700 mẫu sẽ được tiếp tục ngâm trong các lọ cồn có nồng độ cao dần đến cồn nguyên chất Thời gian khử nước tùy theo độ dày của mẫu

Dung dịch để khử nước là ethylic, methylic, butylic và cateton

Muốn biết một mẫu đã khử hết nước chưa, người ta cho xylen vào lọ đựng mẫu đã rút cồn Nếu xylen vẫn trong, điều này chứng tỏ sự khử nước tốt, nếu xylen hơi có vẫn đục (màu trắng sữa) thì phải khử nước lại bằng cồn tuyệt đối (Phạm Phan Địch và Trịnh Bình, 1998)

2.2.4 Tẩm dung môi trung gian của paraffin

Mục đích là dùng một dung môi của paraffin để đẩy cồn trong mô sau khi rút hết nước ra (vì paraffin cũng không tan trong cồn) Dung dịch được sử dụng phải vừa hòa tan trong cồn vừa hòa tan được paraffin Nên chuyển mẫu dần qua 2-3 lọ dung môi Thời gian ngâm mẫu thay đổi tùy theo loại mô và khối lượng mẫu

Các dung môi thường dùng là benzen, toluen, xylen, chloroform

2.2.5 Tẩm paraffin

Trước hết cần chọn loại paraffin tốt và thích hợp Paraffin chỉ có thể ngắm vào mẫu và loại xylen ra khi nó ở trạng thái lỏng Người ta khử dung môi trung gian bằng cách chuyển mẫu lần lượt vào những lọ có paraffin tinh khiết ở dạng lỏng

Thời gian tẩm lâu hay mau là tùy kích thước và tính chất của mẫu: nếu mẫu nhỏ và lỏng lẻo thì tẩm 2-3 giờ, nếu to và cứng thì tẩm từ 24-36 giờ Mục đích của việc tẩm paraffin là làm cho mẫu và paraffin liên kết với nhau thành một khối thống nhất Nhờ vậy có thể cắt mẫu thành những lát mỏng theo mục đích nghiên cứu

2.2.6 Đúc khuôn

Đổ paraffin lỏng vào khuôn kim loại Nhúng ngay mẫu vào paraffin đang lỏng Dùng kẹp đã được làm nóng để định hướng mẫu theo ý muốn Sau vài phút paraffin sẽ đông đặc lại và giữ mẫu ở nguyên vị trí Khi lớp vỏ ngoài paraffin đã đủ cứng, làm ướt cả khuôn vào trong bát đựng đầy nước lạnh và chú ý đừng làm rạn vỡ màng mỏng paraffin bên trên Khoảng 20-30 phút sau paraffin sẽ cứng lại và thuần nhất toàn bộ Cần tránh làm lạnh ngay khi paraffin còn lỏng Không được cắt mảnh ngay mà phải đợi đến 24 giờ sau

- Đặt lưỡi dao vào máy khóa thật chặt, chỉnh độ nghiêng của lưỡi dao khoảng 150-200 so với mặt của khối paraffin

- Cắt mẫu: bắt đầu cắt mẫu ở độ dày từ 10-12µm Sau khi dãy mẫu đã ổn định thì chỉnh lại độ dày khoảng 6-7µm Nếu quá trình tẩm paraffin tốt, lưỡi dao sắc và nhiệt độ phòng cắt thích hợp các lát cắt sẽ dính vào nhau thành dãy băng

Tốc độ của tay quay vừa phải, không quá nhanh cũng không quá chậm nhưng phải dứt khoát

2.2.8 Tải tiêu bản lên lame

Để tải tiêu bản lên lame dùng nhiều loại dung dịch gồm: nước cất, dung dịch lòng trắng trứng pha với glycerin theo tỉ lệ 1:1 Trước khi tải tiêu bản lên lame phải làm tiêu bản giãn ra bằng cách đặt dãy băng lên chậu nước nóng ấm (400C) Sau đó, đưa lame xuống phía dưới để vớt tiêu bản được chọn và mang

đi hấp ở 600C trong 30 phút (Phạm Phan Địch và Trịnh Bình, 1998)

2.2.9 Nhuộm kép Hematoxylin – Eosin Y

Ở tế bào sống, các thành phần cấu tạo của tế bào và mô có chỉ số chiết quang gần giống nhau nên khó phân biệt dưới kính hiển vi quang học Vì vậy, việc nhuộm màu làm cho các thành phần này bắt màu khác nhau, tạo được sự tương phản giúp ta dễ quan sát

Về phương diện mô học người ta chia thuốc nhuộm ra thành hai nhóm: thuốc nhuộm tự nhiên và thuốc nhuộm nhân tạo

- Thuốc nhuộm tự nhiên là những loại được chiết xuất từ động vật hoặc thực vật như Carmine hay Hematoxyline

- Thuốc nhuộm nhân tạo được chia làm ba nhóm: các chất base, các chất acid, các chất màu trung tính

Có nhiều phương pháp nhuộm màu:

2.2.9.1 Sự nhuộm màu tăng, giảm dần

Nhuộm màu tăng dần được tiến hành bằng cách ngâm tiêu bản trong dung dịch nhuộm màu cho đến lúc tiêu bản bắt màu vừa đủ

Nhuộm màu giảm dần là nhuộm cho đến khi tế bào hoặc mô bắt màu thật thẩm rồi sau đó tẩy màu ở tiêu bản cho đến khi màu vừa ý

2.2.9.2 Sự nhuộm màu nối tiếp, đồng thời

Nhuộm màu nối tiếp là phương pháp nhuộm tiêu bản bằng cách chuyển tiêu bản qua các dung dịch thuốc nhuộm theo một trình tự

Nhuộm màu đồng thời được thực hiện bằng cách pha tất cả các thuốc cần nhuộm thành một dung dịch và nhuộm màu một lần (chú ý: các thuốc sử dụng phải phù hợp với nhau, không chống nhau, những thuốc tham gia vào dung dịch phải có tác dụng với bào tương và vào nhân cùng một thời gian)

2.2.9.3 Nhuộm màu trực tiếp, gián tiếp

Nhuộm màu trực tiếp là phương pháp nhuộm được tiến hành khi thuốc nhuộm có khả năng trực tiếp nhuộm vào tế bào và mô, không cần phải qua khâu làm ăn màu

Nhuộm màu gián tiếp được tiến hành bằng cách trước khi nhuộm phải ngâm tiêu bản vào dung dịch làm ăn màu, sau đó ngâm vào dung dịch thuốc nhuộm

Chuẩn bị lamelle, keo Canada Balsam, kim mũi giáo, giấy thấm

Sau khi dùng cồn lau sạch màu dư trên tế bào cần phủ lamelle với keo để bảo quản tiêu bản Đồng thời, keo còn làm tăng tính chiết quang để quan sát tế bào dễ dàng hơn

Nhỏ giọt keo lên lame gần mẫu Đặt lamelle lên lame có mẫu với độ nghiêng khoảng 450 Sau đó hạ dần lamelle xuống tránh làm xuất hiện bọt khí

sẽ ảnh hưởng đến quá trình quan sát mẫu Thao tác dán lamelle cần thực hiện nhanh để tránh sự xâm nhập của hơi nước trong không khí vào mô Ấn nhẹ cho keo lan đều ra bốn cạnh lamelle Dùng vải thấm xylene lau sạch keo bị lan

có thể kéo dài khoảng một tháng

Đánh số hiệu ghi thông tin về tiêu bản vi thể vừa hoàn thành

2.3 Tổng quan về cấu tạo vi thể

2.3.1 Tuyến Fabricius

Là một cơ quan nhỏ nằm ở trên ổ nhốp và dưới xương sống Tuyến Fabricius có lớp niêm mạc tạo thành các nếp gấp cao, quay đầu lại với nhau bao phủ lấy tuyến Niêm mạc, lớp cơ của tuyến Fabricius nối tiếp với các thành phần của đường tiêu hóa Biểu mô thuộc loại đơn trụ nhưng không có tiết nhày, dưới biểu mô có nhiều hạt lâm ba (ở gà có 40–50 hạt trong một tuyến Fabricius) tập trung thành hai vùng: vỏ và tủy, được ngăn cách nhau bằng màng đáy

1: Xoang tuyến 2: Biêu mô phủ 3: Túi tuyến 4: Lớp cơ

Ở vùng vỏ, nốt bạch huyết chứa nhiều tế bào lưới, các lympho trưởng thành và một số tương bào Trong khi ở vùng tủy, ngoài tế bào lưới còn có đại thực bào, và các tế bào lympho non đang phân chia

Tuyến Fabricius xuất hiện khá sớm ở gia cầm (khoảng ngày thứ năm sau khi ấp trứng), rồi phát triển mạnh ở gia cầm non, khi bắt đầu trưởng thành (tháng thứ tư) thì tuyến teo đi, hầu như mất hẳn sau một năm Tuyến Fabricius cũng kích thích sự hình thành kháng thể khi có sự kích thích của protid lạ, vi khuẩn (Lâm Thị Thu Hương, 2005)

Hình 1: Tiêu bản vi thể tuyến Fabricius

Mỗi tiểu thùy gan là một khối hình đa diện Những tiểu thùy ngăn cách nhau bởi vách liên kết mỏng gọi là khoảng Kiernan

Trong mỗi tiểu thùy các tế bào gan xếp thành dãy tế bào gọi là bè Remark, các bè này lại đang chéo nhau tạo thành lưới Giữa các mắc lưới của tiểu thùy có những mao mạch chạy khúc khuỷu Những mao mạch này sẽ tập trung lại đỗ vào một tĩnh mạch nằm giữa tiểu thùy gọi là tĩnh mạch trung tâm hay tĩnh mạch giữa tiểu thùy Đây là một nhánh của tĩnh mạch trên gan Ngoài

ra, giữa mặt bên của hai tế bào gan nằm sát nhau có một khe tròn gọi là vi quản mật Các vi quản mật không có vách do các tế bào tiết ra đổ vào các ống dẫn mật nằm ở vách liên kết rồi tích trữ ở túi mật (ngựa, chuột, bồ câu không

Khoảng Kiernan: là khoảng liên kết rộng ở góc tiểu thùy, trong đó chứa các cấu trúc sau:

- Những nhánh tĩnh mạch cửa: là những nhánh nhỏ, lòng rộng không đều, thành mỏng chỉ gồm một lớp nội mô với một lớp liên kết đàn hồi ở ngoài

- Những nhánh của động mạch gan: lòng ống tròn đều, thành có một lớp

cơ vòng khá dày, cách nội mô bởi một lớp đàn hồi trong

- Những ống dẫn mật: biểu mô thuộc loại khối đơn nhỏ bao quanh có một màng đáy Ở những ống lớn, biểu mô thuộc loại trụ đơn có lông rung được bao bởi một áo liên kết chứa sợi cơ trơn chạy vòng

Sự phân bố mạch máu ở gan:

Gan tiếp nhận máu từ hai nguồn: tĩnh mạch cửa mang máu từ dạ dày, ruột về và động mạch gan mang máu từ tim đến

- Tĩnh mạch cửa vào gan sẽ phân nhánh đi vào các vách liên kết tạo thành các tĩnh mạch gian thùy (chạy trong khe Kiernan) Sau đó chúng phân nhánh thành những mao mạch nan hoa Lưới mao mạch này dẫn máu đổ vào tĩnh mạch giữa tiểu thùy Máu ở tĩnh mạch giữa tiểu thùy chạy về đáy của tiểu thùy rồi tập họp lại đổ về tĩnh mạch gan

- Động mạch gan cùng vào gan rồi phân nhánh thành các động mạch gian thùy chạy song song tĩnh mạch gian thùy Sau đó nó tạo ra lưới mao mạch để

đi vào tiểu thùy

2.3.2.2 Chức năng

Gan đảm nhiệm cùng lúc hai chức năng:

- Ngoại tiết: tiết ra mật

- Nội tiết: gan tham gia chuyển hóa các chất, tham gia dự trữ sắt cho quá trình tạo máu, gan tổng hợp được nhiều loại protein cho cơ thể…

2.3.3 Dạ dày

Dạ dày là phần phình lớn nhất của ống tiêu hóa, nằm trong xoang bụng

Nó là một khối cơ lớn nối thực quản với ruột non Dạ dày là cơ quan để chứa cũng như để tiêu hóa thức ăn Từ trong ra ngoài gồm có 3 lớp:

 Lớp áo trong

Niêm mạc trong của dạ dày chia làm ba vùng:

- Vùng thượng vị: là một diện tích hẹp quanh miệng nối thực quản với dạ dày

- Vùng thân vị: là vùng xung quanh nơi có đường kính to nhất của dạ dày

- Vùng hạ vi: chiếm 1/3 dưới cùng của dạ dày

Biểu mô phủ thuộc loại đơn trụ, rõ nhất ở thân vị Đó là những tế bào hình trụ cao, nhân nằm sát đáy Biểu mô này lõm xuống tạo thành lỗ châm kim Những tế bào biểu mô lớp dạ dày có khả năng tiết ra chất nhầy tạo thành một lớp nhầy nằm trên mặt biểu mô có tác dụng bảo vệ biểu mô chống tác động của acid chlohydric (HCl) thường xuyên có trong dạ dày

Lớp đệm bên dưới biểu mô có nhiều sợi lưới và chứa các tuyến dạ dày Lớp cơ niêm gồm những sợi cơ trơn chạy vòng phía trong, bên ngoài chạy dọc Lớp dưới niêm được tạo thành bởi mô liên kết thưa có nhiều tế bào mỡ, tế bào lympho tự do và những bạch cầu trung tính Trong tầng dưới niêm mạc có nhiều mạch máu, mạch bạch huyết và những đám rối thần kinh

Các tuyến trong lớp đệm của dạ dày thuộc loại tuyến ống, mở vào đáy các rãnh Sản phẩm của các tuyến gọi là dịch vị có vai trò quan trọng trong sự tiêu hóa thức ăn

có ở những bó cơ riêng lẻ, thường tập trung quanh góc gai Lớp hạ niêm mạc dày

 Lớp áo giữa

Gồm có hai lớp cơ trơn: lớp cơ vòng bên trong và lớp cơ dọc bên ngoài

Ở lớp cơ vòng có những bó rất phát triển chia dạ cỏ ra làm nhiều túi có thể quan sát được: túi lưng và túi bụng Ở vùng thượng vị, lớp cơ này là cơ vân

 Lớp áo giữa

Có cấu tạo gồm hai lớp cơ: lớp cơ phía trong chạy dài tạo thành những rãnh, đặc biệt là rãnh thực quản nối liền thực quản vào dạ tổ ong Lớp phía ngoài gồm những sợi cơ chạy xéo hoặc song song nhau, ở đáy rãnh những sợi

cơ trơn xếp nằm ngang

 Lớp áo ngoài

Có cấu tạo là tổ chức liên kết

2.3.6 Dạ lá sách

Ở trâu bò, dạ lá sách chiếm khoảng 7–8% thể tích dạ dày

Ở một vài thú nhai lại như lạc đà không có hoặc có dạ lá sách rất nhỏ Ở

bò, dạ lá sách tương đối lớn

 Lớp áo trong

Mặt trong của dạ lá sách tạo thành những nếp gấp hình lá được bao bọc bởi biểu mô kép lát có nhiều gai thấp Lá rộng nhất chạy từ đường cong lớn đến rãnh lá sách Cơ niêm phát triển, những sợi cơ chạy dọc hợp với biểu mô

và mô liên kết tạo thành ở trong các lá những nếp gấp dọc Ở đỉnh nếp lá, cơ niêm phát triển mạnh tạo thành cơ khỏe ở rìa có tác dụng giúp lá lay động

Chương 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 PHƯƠNG TIỆN

3.1.1 Địa điểm thực hiện

Đề tài được thực hiện tại phòng Mô học – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng

Thời gian: từ ngày 01/04/2014 đến ngày 25/08/2014

3.1.2 Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất

3.1.2.1 Dụng cụ

- Thủy tinh: chai, phễu, ống đong, lame và lamelle

- Dụng cụ giải phẫu: dao, kéo, kẹp

- Các dụng cụ khác: đèn cồn, khay mổ, kim mũi giáo, kim mũi nhọn, ống nhỏ giọt…

- Cồn, xylen, formol, paraffin

- Keo Canada balsam

- Phẩm nhuộm: Hematoxylin, Eosin Y

- Dạ cỏ: cắt lấy một mảnh ngay giữa túi cỏ

- Dạ tổ ong: cắt lấy một mảnh ở giữa tổ ong phía bên mặt hông

- Dạ lá sách: cắt lấy một mảnh tại đường cong lớn

Đối với thỏ: chọn thỏ trưởng thành có trọng lượng 2kg, khỏe mạnh, giết thỏ bằng cách tiêm không khí ở tĩnh mạch tai Sau đó tách nội tạng ra khỏi cơ thể, dùng kéo giải phẫu cắt lấy gan

Đối với gà: chọn gà khoảng hai tuần tuổi, khỏe mạnh, giết gà bằng cách hủy tủy, dùng kéo mổ quanh hậu môn và cắt lấy tuyến Fabricius

Đối với heo: heo vừa giết mổ, lấy mẫu dạ dày

3.2.2 Cố định mẫu

Cố định mẫu bằng dung dịch formol 10% Mẫu sau khi lấy phải được cố định ngay để tránh tình trạng bị thoái hóa, tự hủy hay biến dạng do một số phản ứng sinh hóa của những enzyme nội bào hay do điều kiện ngoại cảnh tác động như vi sinh vật Người ta sử dụng formol là thông dụng nhất do formol

có những đặc tính:

- Vận tốc xuyên thấm, cố định mẫu nhanh

- Không làm co mẫu nhưng làm cho mẫu cứng lại

- Làm tăng sự kiềm tính của cấu trúc khi nhuộm

- Bảo quản tốt cấu trúc tế bào

Mục đích giai đoạn này là giết thật nhanh tổ chức nhưng vẫn giữ nguyên hình dạng, cấu trúc bên trong như lúc tổ chức còn sống Ban đầu ngâm nguyên các phần trong dung dịch formol 10% trong 15 phút để ổn định tổ chức cho dễ cắt Sau đó vớt ra dùng lưỡi lam cắt sạch các phần không cần thiết như mỡ…

3.2.4 Rửa mẫu

Mẫu sau khi cố định xong phải được rửa lại bằng nước sạch Bằng cách cho mẫu vào trong chậu nước đặt dưới vòi nước chảy nhẹ liên tục trong 2 giờ Mục đích để loại trừ tất cả formol thừa trong mẫu Vì nếu formol sót lại sẽ kết hợp với Hematoxyline khi nhuộm sẽ tạo ra kết tủa màu đen sậm; làm phai màu mẫu nên không giữ mẫu được lâu Đồng thời dễ làm vỡ khối mẫu

3.2.5 Khử nước

Dùng các lọ cồn với nồng độ tăng dần từ 700, 800, 900, 1000, 1000 để khử nước, tránh tổ chức bị mất nước đột ngột co rúm lại Ngâm mỗi lọ trong 2 giờ Giai đoạn này rất quan trọng, nếu khử nước không tốt thì các giai đoạn sau cũng không tốt vì paraffin không tan trong nước, paraffin sẽ không thấm vào mẫu Nếu mẫu còn nước, khi cắt mẫu sẽ bể nát hoặc nứt nẻ Có nhiều hóa chất dùng để rút nước trong mẫu như: cồn, acetol, diazon…

Muốn khử nước đạt kết quả cao cần chú ý:

- Hai lọ cồn tuyệt đối cuối cần đảm bảo nồng độ

- Mật độ mẫu trong lọ không nên nhiều sẽ làm loãng nồng độ ảnh hưởng đến sự rút nước từ mẫu ra ngoài

- Thường xuyên lắc đầu lọ ngâm mẫu để tránh nước thoát ra ngoài từ trong mẫu lắng xuống ở đáy lọ

- Để rút ngắn thời gian rút nước nhưng vẫn đảm bảo đạt yêu cầu nên tăng

số lọ ngâm hơn tăng thể tích cồn tuyệt đối

3.2.6 Tẩm dung môi trung gian

Paraffin không tan trong cồn Để paraffin ngấm vào tổ chức hoàn toàn, ta

sử dụng xylen làm dung dịch trung gian Sử dụng xylen vừa loại được cồn trong mẫu, vừa làm tan paraffin ngấm vào trong mẫu dễ dàng Đồng thời xylen còn làm trong mẫu và tan mỡ Nó có thể làm cứng mẫu nếu ngâm lâu Chuyển mẫu qua 2 lọ xylen, mỗi lọ ngâm trong 45 phút

3.2.7 Tẩm paraffin

Chuyển mẫu từ lọ xylen cuối cùng vào các lọ có chứa paraffin đang lỏng đặt trong tủ sấy ở nhiệt độ 600C Chuyển mẫu qua các lọ paraffin khác nhau, mỗi lọ tẩm trong 2 giờ

Mục đích của việc tẩm paraffin là làm cho mẫu và paraffin liên kết với nhau thành một khối thống nhất Nhờ vậy có thể cắt mẫu thành những lát mỏng theo mục đích nghiên cứu

3.2.8 Đúc khuôn

3.2.8.1 Chuẩn bị

- Lau sạch thanh kim loại và bản kim loại

- Dùng các thanh kim loại gãy góc xếp thành hình chữ nhật có kích thước tùy ý muốn

- Đèn cồn, kẹp gắn mẫu

3.2.8.2 Tiến hành

Lấy lọ paraffin lỏng đã lọc từ trước (paraffin tinh khiết), đổ vào khuôn bằng kim loại Dùng kẹp hơi nóng trên ngọn đèn cồn, gấp mẫu vào khuôn và định vị cấu trúc không gian của mẫu theo ý muốn của mình Sau 15 phút ta tách khối paraffin ra khỏi thanh kim loại và đúc mẫu khác

Dán nhãn, ghi ký hiệu vào khối mẫu Cần tránh làm lạnh ngay khi paraffin còn lỏng Không được cắt mảnh ngay mà phải đợi đến 24 giờ sau

3.2.9 Cắt mẫu

3.2.9.1 Chuẩn bị

- Dao cắt vi mẫu: phải sắc vì nếu dao không bén hay răng cưa, dơ bẩn,… đều gây hư tổn cho lát cắt, làm tổ chức bị rách nát, biến dạng,… Nên chuẩn bị

dao mới hoặc dao đã được làm bén trước khi cắt

- Gọt khối paraffin (chừa chừng 2–3mm paraffin quanh mẫu)

- Tra dầu vào các bộ phận chuyển động của máy cắt mẫu

Hình 2: Paraffin trong tủ sấy 600C

Hình 3: Mẫu được đúc khuôn và khuôn đúc mẫu