Nhãn được dán lên một góc của lame với nội dung : - Tên tổ chức: dạ cỏ, dạ tổ ong,…
- Loài: Bò, thỏ, heo, gà. - Chiều hướng cắt: cắt ngang. - Ngày, tháng, năm làm tiêu bản. - Đặt tiêu bản vào hộp chứa tiêu bản.
22
Chương 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Qua quá trình thực hiện tiêu bản mô trên thỏ, bò, gà, heo, tôi đã đúc được 72 khối mẫu trong đó có 28 khối mẫu hoàn chỉnh. Cắt nhuộm được 350 tiêu bản và chọn ra 175 tiêu bản đạt yêu cầu gồm có: dạ cỏ (20 tiêu bản), dạ tổ ong (27 tiêu bản), dạ lá sách (32 tiêu bản), gan (23 tiêu bản), dạ dày (42 tiêu bản), tuyến Fabricius (31 tiêu bản).
Các tiêu bản hoàn chỉnh phải đạt yêu cầu sau:
- Tiêu bản trong, sạch, lát cắt có độ dày thích hợp.
- Tiêu bản có màu tương phản, phân biệt rõ cấu trúc tế bào: nhân có màu tím xanh, tế bào chất có màu hồng nhạt.
CÁC ƯU ĐIỂM VÀ KHUYẾT ĐIỂM Ưu điểm
- Qui trình thực hiện tiêu bản đơn giản, dễ tiến hành.
- Mẫu bắt màu tốt và có sự tương phản màu rõ rệt: nhân màu tím xanh, tế bào chất màu hồng nhạt.
- Các lớp tổ chức có thể phân biệt được dưới kính hiển vi quang học.
Khuyết điểm
23
KẾT QUẢ MÔ HỌC 4.1. Tuyến Fabricius
Biểu mô phủ Mao quản
Vùng vỏ túi tuyến Vùng tủy túi tuyến
Lớp đệm
Hình 11: Tiêu bản vi thể của tuyến Fabricius cắt ngang (X40)
Hình 10: Tiêu bản vi thể của tuyến Fabricius cắt ngang (X10) Lớp cơ
Biểu mô phủ Hạch lâm ba
24
Quan sát tiêu bản từ trong ra ngoài ta thấy: - Biểu mô phủ: là biểu mô đơn trụ.
- Các hạt lâm ba nằm dưới biểu mô và xen vào là các mao quản. Hạt lâm ba tập trung thành hai vùng: có nhiều ở miền vỏ, miền tủy ít hơn.
- Lớp đệm bao quanh lấy hạt lâm ba, là tổ chức liên kết. - Lớp cơ: bao bọc ở ngoài là lớp cơ trơn.
4.2. Gan
- Về đúc khuôn và cắt mẫu:
Đúc khuôn được 8 block, trong đó có 6 block hoàn chỉnh.
Có 2 block bị bật mẫu khi cắt, nguyên nhân do paraffin đúc khuôn bị nguội. Làm cho mẫu không gắn chặt được với khối paraffin.
Thực hiện được 23 tiêu bản hoàn chỉnh, cấu trúc mô của gan được quan
sát dưới kính hiển vi như sau:
Hình 12: Tiêu bản vi thể của gan cắt ngang (X10) Tĩnh mạch trung tâm
Tĩnh mạch cửa Động mạch gan
Ống dẫn mật Vách liên kết Khoảng Kiernan
25 Tế bào Kupffer Hồng cầu Tĩnh mạch trung tâm Tế bào gan Tiểu quản mạch
Mao mạch nan hoa
Hình 13: Tiêu bản vi thể của gan cắt ngang (X40)
Tế bào gan
Tĩnh mạch Tế bào Kupffer
Ống dẫn mật
26
4.3. Dạ dày
Đi từ trong ra ngoài có cấu tạo như sau: - Lớp áo trong:
+ Lớp biểu mô thuộc loại đơn trụ và lõm xuống tạo thành lỗ châm kim. + Lớp cơ niêm gồm những sợi cơ trơn chạy vòng phía trong, bên ngoài chạy dọc. Lớp dưới niêm được tạo thành bởi mô liên kết thưa có nhiều tế bào mỡ, dưỡng bào, tế bào lympho tự do và những bạch cầu hạt trung tính.
+ Trong tầng dưới niêm mạc có nhiều mạch máu, mạch bạch huyết và những đám rối thần kinh.
+ Các tuyến trong lớp đệm của dạ dày thuộc loại tuyến ống.
- Lớp áo giữa chủ yếu là cơ trơn, bên trong là cơ vòng, bên ngoài là cơ dọc. - Lớp áo ngoài là phúc mạc, đó là mô liên kết thưa xen lẫn mô mỡ, thần kinh và mạch máu.
Hình 15: Tiêu bản vi thể của dạ dày cắt ngang (X10)
Cơ vòng
Biểu mô đơn trụ Tuyến dạ dày Hạch lâm ba Cơ niêm Hạ niêm mạc Cơ dọc Tổ chức liên kết Áo trong Áo giữa Áo ngoài
27
Hình 17: Tiêu bản vi thể của tuyến dạ dày cắt ngang (X40)
Tuyến dạ dày Biểu mô đơn trụ
Tuyến dạ dày Hạch lâm ba Cơ niêm Động mạch Tĩnh mạch Hạ niêm mạc
28
4.4. Dạ cỏ
Đi từ trong ra ngoài có cấu tạo như sau: - Lớp áo trong:
+ Lớp biểu mô phủ kép lát có các lớp tế bào phía trên bị keratin hóa. + Tổ chức liên kết nhô cao lên cùng với lớp tế bào biểu mô tạo thành các gai dạ cỏ.
+ Cơ niêm phát triển thành từng bó, tập trung nhiều ở gốc gai. + Lớp hạ niêm mạc là tổ chức liên kết dày.
- Lớp áo giữa gồm: hai lớp cơ trơn, lớp cơ vòng rất phát triển tạo thành từng bó. Bên ngoài là lớp cơ dọc.
- Lớp áo ngoài là tổ chức liên kết.
Hạ niêm mạc Biểu mô phủ kép lát Cơ niêm Cơ vòng Áo trong Áo giữa
Áo ngoài Tổ chức liên kết
Cơ dọc Động mạch
29
4.5. Dạ tổ ong
Đi từ trong ra ngoài có cấu tạo như sau: - Lớp áo trong:
+ Lớp biểu mô phủ kép lát có các lớp tế bào phía trên bị keratin hóa. + Tổ chức liên kết nhô lên hợp với các lớp tế bào biểu mô tạo thành những nếp gấp. Cơ niêm nằm rải rác nhưng ở đỉnh của nếp gấp, tập trung thành từng bó.
+ Hạ niêm mạc là tổ chức liên kết.
- Lớp áo giữa gồm: hai lớp cơ trơn, lớp cơ phía bên trong chạy dài tạo thành những rãnh. Lớp cơ bên dưới chạy xéo hoặc chạy song song nhau.
- Lớp áo ngoài là tổ chức liên kết.
Nếp gấp dạ tổ ong Cơ niêm Biểu mô phủ kép lát Hạ niêm mạc Cơ vòng Cơ dọc Tổ chức liên kết Áo ngoài Áo giữa Áo trong
30
4.6. Dạ lá sách
Đi từ trong ra ngoài có cấu tạo như sau: - Lớp áo trong:
+ Lớp biểu mô phủ kép lát có các lớp tế bào phía trên bị keratin hóa. + Cơ niêm phát triển, những sợi cơ dọc hợp với tổ chức đệm và biểu mô tạo thành các lá sách. Ở đỉnh các lá, cơ niêm phát triển mạnh có tác dụng giúp lá lay động.
+ Hạ niêm mạc là tổ chức liên kết.
- Lớp áo giữa gồm: hai lớp cơ trơn, lớp cơ vòng dày ở bên trong, cơ dọc bao bên ngoài.
- Lớp áo ngoài là tổ chức liên kết.
Tổ chức liên kết Cơ dọc Cơ vòng Hạ niêm mạc Cơ niêm Biểu mô phủ kép lát Áo trong Áo giữa Áo ngoài
31
MỘT SỐ NGUYÊN NHÂN LÀM TIÊU BẢN KHÔNG ĐẠT YÊU CẦU: - Tiêu bản bị rách: do dao không sắc, mẻ, dơ; nước trong chậu tải quá nóng.
- Tiêu bản bị nếp gấp: do nước trong châu tải không đủ nóng. - Tiêu bản bị sọc: do tốc độ cắt không đều hay do dao không sắc.
- Ăn màu không tương phản giữa màu nhân với màu tế bào chất: thời gian nhuộm tiêu bản không thích hợp.
- Lame chứa bọt khí: do thao tác đặt lamelle trên lame không đúng.
MỘT SỐ LƯU Ý KHI THỰC HIỆN TIÊU BẢN
Tùy vào tổ chức mà ta có thời gian ngâm hóa chất khác nhau:
- Thời gian ngâm formol: những mẫu có tổ chức dai và dày thì thời gian ngâm formol lâu hơn bình thường. Ta có thể ngâm từ 24-48 giờ.
- Thời gian ngâm xylen: những mẫu có tổ chức dai và dày thì thời gian ngâm xylen cũng lâu hơn bình thường. Ta có thể ngâm hơn 90-120 phút thì xylen mới ngấm vào tổ chức hoàn toàn và loại bỏ hết cồn.
Đối với giai đoạn khử nước thì chúng ta có thể lưu mẫu ở cồn 700 đến 12 giờ.
Đối với việc lọc paraffin: paraffin có lẫn nhiều tạp chất nên ta phải lọc
nhiều lần. Lọc paraffin càng nhiều lần càng tốt vì paraffin càng tinh khiết thì
khả năng loại hoàn toàn xylen ra khỏi mẫu càng cao. Mặt khác, khi đúc mẫu
paraffin sẽ trong và không bị rạn nức.
Khi tẩm paraffin thì ta chọn paraffin non để tẩm là tốt nhất. Do tinh thể của paraffin non nhỏ hơn tinh thể của paraffin già nên dễ len vào các tổ chức hơn, làm cho mẫu được tẩm hoàn toàn bởi paraffin.
Đối với giai đoạn nhuộm mẫu: các tổ chức khác nhau cũng bắt màu khác nhau. Tùy theo tổ chức mà ta có thời gian ngâm khác nhau, không nhất thiết phải giống chính xác thời gian trong qui trình nhuộm.
Nếu tiêu bản bắt màu lợt thì ta nên tăng thời gian ngâm Hematoxylin hay Eosin Y sao cho tiêu bản có độ tương phản màu rõ nhất. Đối với màu Hematoxylin thì thời gian ngâm khoảng 1 phút 30 giây đến 2 phút 30 giây, còn Eosin Y thì thời gian ngâm nên từ 20 đến 25 phút là tốt nhất.
Nếu tiêu bản không ăn màu thuốc nhuộm, thì cần coi lại phẩm chất của thuốc nhuộm do để lâu ngày và cần phải pha thuốc nhuộm khác. Ngoài ra, nếu tiêu bản không ăn màu Eosin Y thì cần bổ xung thêm acid acetic, với lượng là 0,5ml vào 100ml Eosin Y nhuộm. Cần phải theo dõi và thường xuyên thay mới hóa chất nhưng tránh lãng phí. Trung bình khi nhuộm khoảng 50-60 lame tiến hành thay hóa chất một lần.
32
Chương 5
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
KẾT LUẬN
Bằng phương pháp tiêu bản cắt lát và nhuộm kép Hematoxylin và Eosin Y, các mục tiêu của đề tài “thực hiện tiêu bản mô động vật: dạ cỏ, dạ lá sách và dạ tổ ong trên bò; gan trên thỏ; tuyến Fabricius trên gà và dạ dày trên heo” đã được thực hiện hoàn chỉnh.
Tôi đã khảo sát phương pháp thực hiện tiêu bản hiển vi cố định mô động vật trên bò, thỏ, heo, gà và tìm ra thứ tự thời gian cố định mẫu thích hợp cho từng loại tổ chức.
Tiêu bản làm ra đáp ứng được các yêu cầu quan sát cấu trúc mô học, có thể phục vụ tốt cho nhu cầu học tập, giảng dạy và nghiên cứu.
ĐỀ NGHỊ
Thực hiện thêm tiêu bản vi thể ở các loài khác nhau để so sánh sự khác biệt.
33
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Lâm Thị Thu Hương, 2005. Mô phôi gia súc. Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh.
2. Lê Hoàng Sĩ, Phan Ngọc Anh, 2000. Tổ chức học động vật, Đại Học Cần Thơ.
3. Lăng Ngọc Quỳnh, 2007. Bài giảng cơ thể gia súc A, Đại Học Cần Thơ. 4. Phạm Phan Địch và Trịnh Bình, 1998. Mô học. Nhà xuất bản Y học. Hà Nội.
5. Vũ Công Hòe. 1967. Kỹ thuật kính hiển vi thông thường. Nhà xuất bản Y học Hà Nội.
6. Dương Thị Kim Lan, 2010. Thực hiên tiêu bản vi thể ống tiêu hóa thỏ. Luận văn tốt nghiệp Đại Học Cần Thơ.
7. Phan Thanh Trúc. 2010. Thực hiện một số tiêu bản: hạch màng treo ruột, bàng quang, dịch hoàng, mào tinh và tuyến mang tay trên thỏ. Luận văn tốt nghiệp Đại học Cần Thơ.
8. Nguyễn Quang Mai, 2004. Sinh lý học động vật và người, Nhà xuất bản Khoa học xã hội và kỹ thuật Hà Nội.
9. Mariano S.H.D Fiore. 1974. Atlas of human histoslogy. Leu & Febger Philadenphia.
34
PHỤ CHƯƠNG
35
36
37
38
MỘT SỐ TIÊU BẢN CỦA DẠ TỔ ONG (X10)
39
40
Bảng 1. Trở ngại, nguyên nhân và cách khắc phục khi đúc mẫu
Trở ngại Nguyên nhân Khắc phục
Block vỡ có nhiều hạt
Paraffin xấu, không tinh khiết Thay và lọc thật kỹ paraffin Mẫu bật ra khỏi block khi cắt, trong block có khí Thao tác đúc khuôn chậm
Đúc lại mẫu, thao tác nhanh hơn
Mẫu khó cắt hay vỡ ra từng mảnh
Paraffin quá cứng Thay paraffin khác mềm hơn Tổ chức bị co rúm lại Nhiệt độ tẩm paraffin cao hơn 65oC Loại bỏ mẫu đó Khó cắt, tổ chức bị tước xơ
Paraffin chưa thấm hoàn toàn vào tổ chức, chưa loại hết cồn và xylen
Tẩm lại paraffin lâu hơn, hoặc loại bỏ mẫu đó nếu có mẫu dự trữ
Bảng 2. Trở ngại, nguyên nhân và cách khắc phục khi cắt mẫu
Trở ngại Nguyên nhân Khắc phục
Các mảnh cắt có độ dài không bằng nhau
Điều chỉnh máy cắt với tốc độ không thích hợp
Tăng hoặc giảm tốc độ quay máy cắt. Điều chỉnh độ dày, mỏng của máy cắt và độ nghiêng lưỡi dao Mảnh cắt bị
cuộn lại không xếp thành băng
Mặt trên, dưới của khuôn mẫu và lưỡi dao không song song nhau
Điều chỉnh khuôn mẫu cho mặt cắt song song lưỡi dao
Mảnh cắt bị rách, thủng
Dao cắt bị lục, mẻ, dơ Lau sạch lưỡi dao hoặc thay lưỡi dao mới
Mẫu bị nứt, vụn nát
Mẫu còn nước, nhiệt độ paraffin lúc tẩm quá cao, tốc độ tay quay không phù hợp
Chú ý nồng độ và thời gian ngâm cồn và nhiệt độ tủ sấy lúc tẩm paraffin Mảnh cắt bị vết răng cưa và dính vào dao Paraffin mềm, nhiệt độ phòng quá nóng
Cắt dày hơn, điều chỉnh nhiệt độ của máy lạnh xuống
41
Bảng 3. Trở ngại, nguyên nhân và cách khắc phục khi tải, hấp và nhuộm mẫu
Trở ngại Nguyên nhân Khắc phục
Mẫu bị gấp nếp Nước trong chậu tải không đủ nóng
Tăng nhiệt độ trong chậu
tải
Mẫu bị rách Nhiệt độ nước quá cao Giảm nhiệt độ chậu tải bằng cách thêm nước lạnh vào
Bị tuột mẫu trong lúc nhuộm
Mạnh tay trong lúc nhuộm
Thao tác nhuộm phải chậm, nhẹ nhàng
Công thức pha Formol trung tính 10%
Formalin (37–40%) 100 ml
Nước cất 900ml
Sodium phosphate monobasie 4g Sodium phosphate dibasie 6,5g
Thuốc nhuộm Hematoxylin
Tinh thể Hematoxylin 5g
Cồn tuyệt đối 50ml
Phèn chua 100g
Nước cất 1000ml
Moreuride oxide 2.5g
- Hòa tan Hematoxylin trong cồn và phèn chua trong nước cất đun sôi, mang ra khỏi bếp và trộn hai dung dịch này lại.
- Đun sôi nhanh không quá một phút luôn khuấy đều, tắt lửa rồi cho Moreuride oxide vào từ từ, khuấy đều, đun nhỏ lửa cho đến khi dung dịch có màu tím đậm.
- Mang ra khỏi bếp cho vào nước lạnh để làm lạnh nhanh, khi dung dịch nguội lại thì lọc trước khi dùng.
Lưu ý: Hematoxylin biến chất (có cặn, nâu đỏ) sẽ kết tủa màu nâu đen bên ngoài tế bào khi nhuộm. Để kiểm tra dung dịch Hematoxylin có bị loãng và biến chất hay không bằng cách nhỏ vài giọt Hematoxylin vào nước ấm, nếu thấy giọt phẩm nhuộm có màu đỏ một lúc sau mới thấy chuyển sang màu tím xanh là phẩm nhuộm đã loãng và biến chất phải loại bỏ. Nếu phẩm nhuộm có màu tím xanh ngay thì sử dụng được.
42
Thuốc nhuộm Eosin Y
Eosin dự trữ:
Eosin 1g
Nước cất 20ml
Hòa tan và thêm cồn 95% 80ml Eosin nhuộm:
Eosin dự trữ 1 phần
Cồn 800 2 phần
Hòa tan vào nhau và cho thêm 0.5ml acid acetic đậm đặc cho 100ml dung dịch trước khi dùng.
