Paraffin không tan trong cồn. Để paraffin ngấm vào tổ chức hoàn toàn, ta sử dụng xylen làm dung dịch trung gian. Sử dụng xylen vừa loại được cồn trong mẫu, vừa làm tan paraffin ngấm vào trong mẫu dễ dàng. Đồng thời xylen còn làm trong mẫu và tan mỡ. Nó có thể làm cứng mẫu nếu ngâm lâu. Chuyển mẫu qua 2 lọ xylen, mỗi lọ ngâm trong 45 phút.
3.2.7. Tẩm paraffin
Chuyển mẫu từ lọ xylen cuối cùng vào các lọ có chứa paraffin đang lỏng đặt trong tủ sấy ở nhiệt độ 600C. Chuyển mẫu qua các lọ paraffin khác nhau, mỗi lọ tẩm trong 2 giờ.
Mục đích của việc tẩm paraffin là làm cho mẫu và paraffin liên kết với nhau thành một khối thống nhất. Nhờ vậy có thể cắt mẫu thành những lát mỏng theo mục đích nghiên cứu.
3.2.8. Đúc khuôn
3.2.8.1. Chuẩn bị
- Lau sạch thanh kim loại và bản kim loại.
- Dùng các thanh kim loại gãy góc xếp thành hình chữ nhật có kích thước tùy ý muốn.
- Đèn cồn, kẹp gắn mẫu.
3.2.8.2. Tiến hành
Lấy lọ paraffin lỏng đã lọc từ trước (paraffin tinh khiết), đổ vào khuôn bằng kim loại. Dùng kẹp hơi nóng trên ngọn đèn cồn, gấp mẫu vào khuôn và định vị cấu trúc không gian của mẫu theo ý muốn của mình. Sau 15 phút ta tách khối paraffin ra khỏi thanh kim loại và đúc mẫu khác.
16
Dán nhãn, ghi ký hiệu vào khối mẫu. Cần tránh làm lạnh ngay khi paraffin còn lỏng. Không được cắt mảnh ngay mà phải đợi đến 24 giờ sau.
3.2.9. Cắt mẫu
3.2.9.1. Chuẩn bị
- Dao cắt vi mẫu: phải sắc vì nếu dao không bén hay răng cưa, dơ bẩn,… đều gây hư tổn cho lát cắt, làm tổ chức bị rách nát, biến dạng,… Nên chuẩn bị dao mới hoặc dao đã được làm bén trước khi cắt.
- Gọt khối paraffin (chừa chừng 2–3mm paraffin quanh mẫu). - Tra dầu vào các bộ phận chuyển động của máy cắt mẫu.
Hình 2: Paraffin trong tủ sấy 600C
17
3.2.9.2. Tiến hành
- Trước khi cắt mẫu ta cần kiểm tra máy cắt. - Gắn mẫu lên trục mang mẫu, siết chặt ốc. - Gắn dao nghiêng khoảng 150 đến 200. - Điều chỉnh cho mẫu và lưỡi dao chạm nhau.
Định hướng khối và dao trên máy cắt mỏng cho thích hợp. Chú ý nếu muốn cắt mảnh cắt thành dãy thì phải làm cho hai mặt trên và dưới của mặt cắt song song nhau. Điều chỉnh ốc vi cấp của máy cắt, bắt đầu ở độ dày từ 10- 12µm. Sau khi dãy mẫu đã ổn định thì chỉnh lại độ dày khoảng 5-7µm. Nếu việc tẩm paraffin tốt, lưỡi dao sắc và nhiệt độ phòng cắt thích hợp các lát cắt sẽ dính vào nhau thành dãy băng.
Tốc độ của tay quay vừa phải, không quá nhanh cũng không quá chậm nhưng phải dứt khoát.
3.2.10. Tải, dán, hấp mẫu
3.2.10.1. Chuẩn bị
- Chậu nước đặt trên bếp tải mẫu được điều chỉnh ở nhiệt độ 400C. - Lame sạch.
18
3.2.10.2. Tiến hành
Dùng mũi giáo đỡ nguyên băng mẫu cho vào chậu ước ấm.
Khi paraffin đã căng, lấy lame sạch, nghiêng nhẹ trên mặt nước rồi vớt những mẫu đã chọn đúng vị trí giữa lame. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 5: Chậu nước ấm đặt trên bếp tải
19
Nghiêng lame cho ráo nước, cho vào tủ hấp mẫu ở 600C trong 30 phút.
3.2.11. Nhuộm mẫu