thực hiện tiêu bản mô động vật: thực quản, ruột non, ruột già, gan, dạ dày tuyến và dạ dày cơ

Tìm ra thứ tự thời gian cố định mẫu thích hợp cho từng loại tổ chức như sau: gan, thực quản, dạ dày tuyến thời gian cố định mẫu trong 24 giờ; ruột già, ruột non, dạ dày cơ thời gian cố đ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN THÚ Y

TRƯƠNG THỊ THANH MAI

THỰC HIỆN TIÊU BẢN MÔ ĐỘNG VẬT: THỰC QUẢN, RUỘT NON, RUỘT GIÀ, GAN, DẠ DÀY TUYẾN VÀ DẠ DÀY CƠ

Luận văn tốt nghiệp Ngành: THÚ Y

Cần Thơ, 2013

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

Cán bộ hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:

MSSV: 3092625 Lớp: Thú Y K35

Cần Thơ, 2013

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN THÚ Y

Đề tài: “Thực hiện tiêu bản mô động vật: thực quản, ruột non, ruột

già, gan, dạ dày tuyến và dạ dày cơ”

Sinh viên thực hiện: Trương Thị Thanh Mai, lớp Thú Y K35

Địa điểm: phòng thí nghiệm Mô Động Vật, Bộ môn Thú Y, khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, trường Đại học Cần Thơ

Thời gian thực hiện: từ tháng 9 năm 2013 đến tháng 11 năm 2013

Cần Thơ, ngày…tháng…năm 2013 Cần Thơ, ngày…tháng…năm 2013

Lê Hoàng Sĩ

Cần Thơ, ngày…tháng…năm 2013

Duyệt Khoa Nông Nghiệp & SHƯD

LỜI CẢM TẠ

Qua những năm tháng học tập, ngoài sự phấn đấu của bản thân tôi luôn nhận được sự động viên giúp đỡ của mọi người, giờ đây tôi đã hoàn thành luận văn tốt nghiệp Tôi xin:

Thành kính biết ơn!

Cha mẹ - người đã sinh thành, dưỡng dục, không quản ngại khó khăn nuôi tôi khôn lớn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cũng như động viên tôi trong suốt thời gian qua

Xin chân thành biết ơn!

Thầy Lê Hoàng Sĩ và thầy Trần Hiền Nhơn đã dành thời gian quý báu, tận tình dìu dắt, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm luận văn tốt nghiệp

Cô Nguyễn Thu Tâm, cố vấn học tập đã luôn nhắc nhở và động viên tôi trong suốt thời gian học tập tại trường

Quý Thầy, Cô Bộ môn Thú Y và Bộ môn Chăn Nuôi đã tận tình truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm vô cùng quý báu với tôi trong suốt thời gian qua Xin chân thành cảm ơn!

Tất cả bạn bè lớp Thú Y khóa 35 đã luôn bên tôi suốt những năm tháng trên giảng đường Đại học

Cuối cùng, tôi xin nói lời cảm ơn đến Hội Đồng đã dành thời gian đọc và xem xét đề tài tốt nghiệp này

Cần Thơ, ngày…tháng…năm 2013 Trương Thị Thanh Mai

MỤC LỤC

Trang duyệt i

Lời cảm tạ ii

Mục lục iii

Danh mục hình v

Tóm lược vi

Chương 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 2 CƠ SỞ LÝ LUẬN 2

2.1 Tổng quan về phương pháp thực hiện tiêu bản hiển vi 2

2.2 Cấu tạo vi thể chung của ống tiêu hóa 7

2.3 Cấu tạo vi thể thực quản, ruột non, ruột già và gan thỏ 8

2.3.1 Thực quản (Esophagus) 8

2.3.2 Ruột non (Small intestine) 9

2.3.3 Ruột già (Large intestine) 11

2.3.4 Gan (Liver) 11

2.4 Cấu tạo vi thể dạ dày của gia cầm và thủy cầm 14

2.4.1 Dạ dày tuyến (Proventriulus or Glandular Stomach) 14

2.4.2 Dạ dày cơ (Gizzard of Muscular Stomach) 15

Chương 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

3.1 Phương Pháp 16

3.1.1 Địa điểm thực hiện 16

3.1.2 Dụng cụ, trang thiết bị, hóa chất 16

3.2 Phương Pháp Tiến Hành 16

3.2.1 Lấy mẫu 16

3.2.2 Cố định mẫu 16

3.2.3 Lấy mẫu nhỏ 17

3.2.4 Rửa mẫu 17

3.2.5 Khử nước 18

3.2.6 Tẩm dung môi trung gian 18

3.2.7 Tẩm paraffin 18

3.2.8 Đúc khuôn 19

3.2.9 Cắt mẫu 20

3.2.10 Tải và hấp mẫu 21

3.2.11 Nhuộm mẫu 22

3.2.12 Dán lamelle và dán nhãn 23

3.3 Tiêu chuẩn đánh giá tiêu bản 24

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25

4.1 Thực quản 26

4.2 Ruột non 28

4.3 Ruột già 29

4.4 Gan 32

4.5 Dạ dày tuyến 34

4.6 Dạ dày cơ 35

4.7 Ưu điểm và khuyết điểm 37

4.7.1 Ưu điểm 37

4.7.2 Khuyết điểm 37

4.7.3 Khắc phục 37

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 39

5.1 Kết luận 39

5.2 Đề nghị 39

Tài liệu tham khảo 40

Phụ chương 41

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 Khuôn Leuckart 20

Hình 2 Máy cắt vi mẫu 20

Hình 3 Sơ đồ quy trình nhuộm mẫu 22

Hình 4 Tiêu bản vi thể của thực quản (X10) 25

Hình 5 Tiêu bản vi thể của thực quản (X40) 26

Hình 6 Tiêu bản vi thể của tá tràng (X10) 27

Hình 7 Tiêu bản vi thể của không-hồi tràng (X10) 28

Hình 8 Tiêu bản vi thể của không-hồi tràng (X40) 28

Hình 9 Tiêu bản vi thể của tá tràng (X40) 29

Hình 10 Tiêu bản vi thể của ruột già (X10) 30

Hình 11 Tiêu bản vi thể của ruột già (X40) 31

Hình 12 Tiêu bản vi thể của gan (X10) 31

Hình 13 Tiêu bản vi thể của gan (X40) 32

Hình 14 Tiêu bản vi thể của gan (X40) 32

Hình 15 Tiêu bản vi thể của dạ dày tuyến (X4) 33

Hình 16 Tiêu bản vi thể của dạ dày tuyến (X10) 34

Hình 17 Tiêu bản vi thể của dạ dày tuyến (X40) 34

Hình 18 Tiêu bản vi thể của dạ dày cơ (X10) 35

Hình 19 Tiêu bản vi thể của dạ dày cơ (X40) 36

TÓM LƯỢC

Với đề tài “thực hiện tiêu bản mô động vật: thực quản, ruột non, ruột già, gan, dạ dày tuyến và dạ dày cơ” nhằm tạo ra tiêu bản vi thể Những tiêu bản vi thể này có thể quan sát được ở mức tế bào Trong thời gian thực hiện từ tháng 9 đến tháng 11 năm 2013, tại phòng thí nghiệm mô động vật, khoa Nông Nghiệp & SHƯD, Đại học Cần Thơ, tôi đã thực hiện được 328 lame chọn ra 244 lame tiêu bản hoàn chỉnh Trong đó có 31 tiêu bản thực quản, 42 tiêu bản ruột già, 42 tiêu bản ruột non, 55 tiêu bản gan, 44 tiêu bản dạ dày tuyến và 30 tiêu bản dạ dày cơ Qua đó, tôi nắm được quy trình thực hiện và rút ra được một số đặc điểm riêng của từng mẫu so với quy trình chung Tìm ra thứ tự thời gian cố định mẫu thích hợp cho từng loại tổ chức như sau: gan, thực quản, dạ dày tuyến thời gian cố định mẫu trong 24 giờ; ruột già, ruột non, dạ dày cơ thời gian cố định mẫu lâu hơn khoảng 36-48 giờ

Chương 1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Sinh vật có thể hoạt động một cách linh hoạt là nhờ sự phối hợp nhịp

nhàng của các hệ cơ quan trong cơ thể Trong đó, mỗi hệ cơ quan trong cơ thể có cấu tạo và chức năng khác nhau nên mỗi cơ quan có cấu trúc khác nhau

Trong ngành Y nói chung cũng như ngành Thú Y nói riêng việc tìm hiểu mức độ gây hại bên trong cũng như những sinh lý bất thường trong cơ thể thì việc nghiên cứu ở mức độ cấp tế bào là rất quan trọng Để nghiên cứu sự bất thường của mô bệnh thì trước tiên phải nắm rõ được cấu trúc của mô bình thường

Xuất phát từ những lý do trên và được sự phân công của bộ môn Thú Y, khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, trường Đại học Cần Thơ, tôi tiến

hành thực hiện đề tài: “Thực hiện tiêu bản mô động vật: thực quản, ruột non,

ruột già, gan, dạ dày tuyến và dạ dày cơ”

Mục tiêu đề tài nhằm:

 Đọc và mô tả về mặt tổ chức học các tiêu bản đã thực hiện bao gồm: thực quản, ruột non, ruột già, gan trên ống tiêu hóa thỏ và dạ dày tuyến, dạ dày cơ của vịt

 Thực hiện những tiêu bản hiển vi có chất lượng phục vụ cho học tập, giảng dạy và nghiên cứu

Chương 2

CƠ SỞ LÝ LUẬN 2.1 Tổng quan về phương pháp thực hiện tiêu bản hiển vi

Muốn nghiên cứu về cấu trúc của tế bào và mô thì kính hiển vi không thể thiếu Muốn sử dụng kính hiển vi thì ta phải có những tiêu bản (thiết đồ hoặc

phiến đồ) có độ dày thích hợp cho phép quan sát dưới kính hiển vi

Có nhiều phương pháp làm tiêu bản để nghiên cứu trong đó phương pháp làm tiêu bản hiển vi cố định và nhuộm màu là phương pháp phổ biến dùng trong xét nghiệm mẫu bệnh so với mẫu đối chứng

Phương pháp làm tiêu bản cố định và nhuộm màu

Thực hiện tiêu bản hiển vi cố định bằng phương pháp tiêu bản cắt lát và nhuộm kép bằng Hematoxylin và Eosin Y Phương pháp này nhằm tạo được những mảnh cắt mỏng, trong suốt của mô ở cơ quan, cho phép quan sát được dưới kính hiển vi Thêm vào đó tiêu bản sẽ được nhuộm bằng các thuốc nhuộm đặc hiệu, các phần của tiêu bản có màu khác nhau giúp cho việc quan sát dễ dàng

Tiêu bản hiển vi cố định thực hiện theo phương pháp này phải qua nhiều giai đoạn Phải thực hiện tốt tất cả các giai đoạn mới đảm bảo thu được tiêu bản

có chất lượng, nếu một trong những giai đoạn nào đó thực hiện không tốt thì tiêu bản thu được sẽ không đạt chất lượng

Tóm lược quy trình thực hiện như sau:

 Lấy mẫu

Trong phương pháp này, lấy mẫu là bước đầu tiên có mục đích là lấy tế bào, mô của cơ quan ở cơ thể sống hay đã chết Bước lấy mẫu này có ý nghĩa rất

to lớn Vì vậy khi thực hiện phải hết sức tuân thủ một số quy tắc sau:

- Mẫu phải tươi

- Động tác lấy mẫu phải nhẹ nhàng, tránh gây những biến đổi do tác nhân

- Khi cắt xong phải cố định ngay để tránh hiện tượng hoại tử sau khi chết của tế bào (Phạm Phan Địch và Trịnh Bình, 1998)

 Cố định mẫu

Mô được gọi là cố định tốt khi tế bào cấu tạo nên mô vẫn giữ nguyên hình dáng, đồng thời vẫn giữ được mối liên quan tương hỗ trong tế bào và trong mô giống như khi còn sống

Dung dịch cố định có tác dụng ngăn cản sự hoại tử sau khi tế bào đã chết, dung dịch cố định tốt là dung dịch có tác dụng nhanh mà ít gây sự thay đổi cấu trúc (Phạm Phan Địch và Trịnh Bình, 1998)

Mẫu sau khi lấy phải cố định ngay để tránh tình trạng bị thoái hóa, hoại tử hay biến dạng do một số phản ứng sinh hóa của những enzyme nội bào hay điều kiện bên ngoài tự nhiên tác động như vi sinh vật Có nhiều cách cố định mẫu: tác nhân vật lý (sức nóng, làm khô, đóng băng,…), tác nhân hóa học (formol, acid acetic, rượu,…)

Duboscq-Việc chọn thuốc cố định và phương pháp cố định phụ thuộc vào bản chất

mô cần cố định, mục đích cần nghiên cứu, tính chất thuốc cố định

Thời gian cố định phụ thuộc vào từng loại mô và từng loại thuốc cố định trên nguyên tắc kéo dài thời gian cố định tốt hơn là rút ngắn (trừ một số thuốc làm giòn mô)

Nguyên tắc cố định mẫu

- Mẫu phải được cố định ngay sau khi lấy

- Không được làm dập, nát mẫu

- Mẫu không được cắt quá dài

- Dung dịch dung để cố định phải đạt đúng nồng độ, thể tích dung dịch cố định gấp 30-60 lần thể tích mẫu

Việc rửa mô sau khi cố định là công việc rất quan trọng Trên nguyên tắc sau khi cố định phải làm cho mô mất chất cố định càng sớm càng tốt, vì những chất cố định có ảnh hưởng đến việc nhuộm và bảo quản tiêu bản Các chất cố định khác nhau có cách rửa mô khác nhau Có thể rửa ngang với thời gian cố định nếu rửa bằng nước Các dung dịch cố định có chrome rửa với hỗn hợp dung dịch cồn và Iod (Phạm Phan Địch và Trịnh Bình, 1998)

 Khử nước

Mục đích của việc khử nước là rút hết nước trong mẫu mà không làm mô hoặc tế bào bị thay đổi về cấu tạo và vị trí Mẫu sau khi cố định, rửa nước kỹ rồi chuyển sang ngâm trong lọ cồn 70°, tiếp tục ngâm trong các loại cồn có nồng độ cao dần đến cồn nguyên chất Thời gian khử nước tùy theo độ dày của mẫu

Muốn biết mẫu đã khử hết nước chưa, người ta cho xylen vào lọ đựng mẫu

đã rút cồn Nếu xylen vẫn trong, điều này chứng tỏ sự khử nước tốt, nếu xylen hơi

có vẩn đục (màu trắng sữa) thì phải khử nước lại bằng cồn tuyệt đối (Phạm Phan Địch và Trịnh Bình, 1998)

 Tẩm dung môi trung gian của paraffin

Mục đích là dùng một dung môi của paraffin để đẩy cồn trong mô sau khi rút hết nước ra (vì paraffin cũng không tan trong cồn) Dung dịch được sử dụng phải vừa hòa tan trong cồn vừa hòa tan được paraffin Các dung dịch thường dùng

là benzene, toluene, xylen, chloroform

 Tẩm paraffin

Mục đích công đoạn này giúp cắt mẫu thành những lát cắt mỏng, có thể quan sát được dưới kính hiển vi vì lát cắt càng mỏng thì số lớp tế bào càng ít giúp chúng ta quan sát cấu trúc tổ chức dễ dàng hơn Do đó, ta cần phải tẩm paraffin vì

sự cố định mẫu chỉ mới giết chết tế bào và giữ cho những thành phần của nó bất động trong tình trạng tĩnh Nếu mẫu cố định xong mang đi cắt mỏng ngay thì mối liên quan giữa những tế bào và tổ chức cũng như cơ cấu của tế bào cũng sẽ bị thay đổi biến dạng do tác động của lưỡi dao Vì vậy, cần phải có một chất làm nền cho mẫu, vừa như cái khuôn giữ vững mẫu vừa thâm nhập được vào các khoảng gian bào giữ cho thành phần tế bào cũng như tổ chức được yên vị trí khi

cắt mỏng

Trước hết cần chọn loại paraffin tốt và thích hợp Paraffin chỉ có thể ngấm vào mẫu và loại xylen ra khi nó ở trạng thái lỏng Người ta khử dung môi trung gian bằng cách chuyển mẫu lần lượt vào những lọ có paraffin tinh khiết

Thời gian tẩm lâu hay mau là tùy vào kích thước và tính chất của mẫu: nếu mẫu nhỏ và lỏng lẻo thì tẩm 2-3 giờ, nếu to và cứng thì tẩm 24-36 giờ

 Đúc khuôn

Người ta đổ paraffin lỏng đã lọc (paraffin tinh khiết) vào khuôn Nhúng ngay mẫu vào paraffin đang lỏng này Dùng kẹp đã được làm nóng để định hướng mẫu theo ý muốn Sau vài phút paraffin sẽ đông lại và giữ mẫu ở nguyên vị trí Khi lớp vỏ paraffin đã đủ cứng, làm ướt cả khuôn trong nước lạnh và chú ý đừng làm rạn vỡ màng mỏng paraffin bên trên Khoảng 20-30 phút sau paraffin sẽ cứng lại và thuần nhất toàn bộ Cần tránh làm lạnh ngay khi paraffin còn lỏng Không được cắt mảnh ngay mà phải đợi đến 24 giờ sau (Vũ Công Hòe, 1975)

 Cắt lát mỏng

Mục đích là cắt thành những lát thật mỏng để có thể quan sát dưới kính hiển vi

Quy trình cắt khối paraffin gồm các bước

Cắt khối mẫu sao cho chỉ còn lại khoảng 2-3 mm paraffin quanh mẫu Gọt khối mẫu sao cho hai cạnh trên và dưới song song nhau

Gắn khối mẫu đã gọt vào khối gỗ bằng cách làm nóng khối gỗ mang khối mẫu và đồng thời làm nóng phần đáy khối mẫu, gắn mặt đáy của khối mẫu và khối gỗ, chỉnh cho khối mẫu song song với khối gỗ

Đặt lưỡi dao vào máy, khóa thật chặc, chỉnh độ nghiêng của lưỡi dao khoảng 15-200 so với mặt của paraffin

Cắt mẫu: việc cắt mẫu có thể bắt đầu ở độ dày từ 10-12µm Sau khi dây mẫu đã ổn định thì chỉnh lại độ dày khoảng 6-7µm Nếu việc tẩm paraffin tốt,

lưỡi dao sắc và nhiệt độ phòng cắt thích hợp các lát cắt sẽ dính vào nhau thành những dải băng

Tốc độ của tay quay vừa phải, không quá nhanh cũng không quá chậm nhưng phải dứt khoát (Vũ Công Hòe, 1975)

 Tải tiêu bản lên lame

Để tải tiêu bản lên lame có thể dùng nhiều loại dung dịch: nước cất, dung dịch lòng trắng trứng pha với glycerin theo tỷ lệ 1:1 Trước khi dán tiêu bản lên lame phải làm tiêu bản dãn ra bằng cách đặt dải băng lên chậu nước nóng ấm khoảng 40°C Sau đó, đưa lame xuống phía dưới để vớt tiêu bản được chọn lên và mang đi hấp ở 60°C trong 30 phút (Phạm Phan Địch và Trịnh Bình, 1998)

 Nhuộm mẫu

Ở tế bào sống, các thành phần cấu tạo tế bào và mô có chỉ số chiết quang gần giống nhau nên khó phân biệt dưới kính hiển vi quang học Vì vậy, việc nhuộm màu làm cho các thành phần này bắt màu khác nhau, tạo được sự tương

Có nhiều phương pháp nhuộm màu

- Sự nhuộm màu tăng, giảm dần

Nhuộm màu tăng dần được tiến hành bằng cách ngâm tiêu bản trong dung dịch nhuộm màu cho đến lúc tiêu bản nhuộm bắt màu vừa đủ

Nhuộm màu giảm dần là nhuộm cho đến khi tế bào hoặc mô bắt màu thật thấm rồi sau đó tẩy màu ở tiêu bản cho đến khi màu vừa ý

- Sự nhuộm màu nối tiếp, đồng thời

Nhuộm màu nối tiếp là phương pháp nhuộm tiêu bản bằng cách chuyển tiêu bản qua các dung dịch thuốc nhuộm theo một trình tự

Nhuộm màu đồng thời được thực hiện bằng cách pha tất cả các thuốc cần nhuộm thành một dung dịch và nhuộm màu một lần (chú ý: các thuốc sử dụng phải phù hợp với nhau, không chống nhau Những thuốc tham gia vào dung dịch phải có tác dụng với bào tương và nhân cùng một thời gian)

- Nhuộm màu trực tiếp, gián tiếp

Nhuộm màu trực tiếp là phương pháp nhuộm được tiến hành khi thuốc nhuộm có khả năng trực tiếp nhuộm vào tế bào và mô, không cần phải qua khâu làm ăn màu

Nhuộm màu gián tiếp được tiến hành bằng cách trước khi nhuộm phải ngâm tiêu bản vào dung dịch làm ăn màu, sau đó ngâm vào dung dịch thuốc nhuộm

- Nhuộm màu khác: một số thuốc nhuộm khi bắt vào tế bào và mô có màu khác với màu của dung dịch thuốc nhuộm như Toluidin có màu xanh lơ, khi nhuộm chất này sẽ có màu đỏ còn cấu trúc có màu xanh lơ (Phạm Phan Địch và Trịnh Bình, 1998)

2.2 Cấu tạo vi thể chung của ống tiêu hóa

Về mặt đại thể, hệ thống ống tiêu hóa bao gồm các thành phần: miệng, hầu, thực quản, dạ dày, ruột non, ruột già và hậu môn Đoạn ống từ thực quản xuống ruột già gọi là ống tiêu hóa chính thức, ống tiêu hóa chính thức gồm nhiều đoạn, mỗi đoạn có một chức năng riêng Vì vậy mỗi đoạn có một cấu trúc rất đặc biệt phù hợp với chức năng của nó Ngoài những cấu trúc đặc biệt riêng của mỗi đoạn, toàn bộ đoạn ống tiêu hóa chính thức có cấu trúc cơ bản giống nhau

Thành ống tiêu hóa đi từ trong ra ngoài có 3 lớp áo: lớp áo trong, lớp áo giữa, lớp áo ngoài

Lớp áo trong (Tunica mucosa)

Lót trong lòng ống tiêu hóa là niêm mạc có nhiều tế bào tiết chất nhờn, đi

từ trong ra ngoài gồm có 4 lớp:

- Lớp biểu mô: do tổ chức biểu mô hình thành Biểu mô lợp bề mặt niêm mạc thay đổi tùy thuộc chức năng của từng đoạn: biểu mô phủ kép lát không sừng hóa ở miệng, thực quản và hậu môn; biểu mô đơn trụ ở dạ dày và ruột

- Lớp đệm: là tổ chức liên kết nằm dưới biểu mô Ở vài đoạn ống tiêu hóa lớp đệm bị chia thành hai phần bởi cơ niêm Trong lớp đệm có chứa tuyến như tuyến dạ dày, tuyến ruột,…

- Lớp cơ niêm: là tổ chức cơ trơn, khi co bóp làm niêm mạc gấp lại Cấu tạo chung gồm hai lớp cơ trơn: cơ vòng phía trong và cơ dọc phía ngoài Riêng thực quản chỉ có lớp cơ trơn họp lại thành bó và chạy theo chiều dọc

- Lớp hạ niêm mạc: là tổ chức liên kết, lớp này rất phát triển Đây là nơi cư trú của mạch quản có nhiều đám rối thần kinh để điều tiết mạch quản cũng như biểu mô Ngoài ra, lớp hạ niêm mạc còn chứa tuyến như: tuyến nhờn thực quản, tuyến tá tràng,…

Lớp áo giữa (Tunica muscularie)

Do tổ chức cơ hình thành gọi là lớp áo cơ Đoạn từ dạ dày trở về miệng đa

số là cơ vân, còn từ dạ dày trở xuống đa số là cơ trơn Áo này được chia làm hai lớp: lớp cơ vòng phía trong và cơ dọc phía ngoài

Lớp áo ngoài (Tunica serosa)

Là một màng bọc tạo bởi mô liên kết thưa

2.3 Cấu tạo vi thể thực quản, ruột non, ruột già và gan thỏ

2.3.1 Thực quản (Esophagus)

Thực quản là ống thông từ yết hầu tới dạ dày Chia làm 3 phần:

- Phần cổ là phần từ yết hầu tới cửa vào lồng ngực Đoạn trước nằm trên khí quản đến khoảng 1/3 phía sau lệch dần sang bên trái của khí quản

- Phần ngực là phần từ cửa lồng ngực đến cơ hoành, nằm chen giữa hai lá phổi

- Phần bụng là phần từ cơ hoành đến dạ dày, đoạn này ngắn và chạy ngang qua khuyết thực quản của gan

Thực quản có nhiệm vụ chuyển thức ăn từ miệng xuống dạ dày Ở đó không có quá trình tiêu hóa thức ăn vì không có tuyến tiêu hóa

Cấu trúc bên trong của thực quản từ trong ra ngoài thành thực quản gồm 4 lớp áo đồng tâm: lớp niêm mạc, lớp hạ niêm mạc, lớp cơ và lớp vỏ ngoài

Lớp niêm mạc

Lớp niêm mạc thực quản có độ dày 500-800 µm, được chia thành 3 lớp:

- Lớp biểu mô: biểu mô thực quản là biểu mô phủ kép lát không sừng hóa

- Lớp đệm: là một lớp được tạo thành bởi mô liên kết thưa trong đó có những sợi keo nhỏ, lưới sợi chun mỏng, những tế bào liên kết Trong lớp đệm còn

có những tuyến thực quản-vị Tuyến thực quản-vị là những tuyến ngoại tiết kiểu ống phân nhánh, cong queo

- Lớp cơ niêm: được cấu tạo bởi những sợi cơ trơn dài, nằm riêng rẽ, tới gần dạ dày thì những bó đó mới sát lại nhau (Nguyễn Xuân Hoạt và Phạm Đức Lộ,1980)

Lớp hạ niêm mạc

Được tạo bởi mô liên kết lỏng lẻo, trong tầng dưới niêm mạc ở thực quản có nhiều tuyến thực quản chính thức Tuyến thực quản chính thức là những tuyến giống với tuyến nước bọt nhỏ và nhầy (Trương Đình Kiệt và Phan Chiến Thắng, 1991)

2.3.2 Ruột non (Small intestine)

Ruột non giữ vai trò quan trọng trong việc tiêu hóa thức ăn Đồng thời là nơi hấp thu chủ yếu các chất dinh dưỡng từ thức ăn đưa vào Những chức năng này phản ánh rõ trên cấu tạo của ruột non Nó có tuyến tiết dịch tiêu hóa và các phần hấp thu đặc biệt như nếp gấp, lông nhung và riềm hút

Lông nhung là những cấu trúc nhỏ hình ngón tay và lồi lên khỏi mặt niêm mạc Số lượng lông nhung ở tá tràng nhiều hơn so với không tràng và hồi tràng Lông nhung làm tăng diện tích bề mặt của ruột non lên 10 lần và cách nhau bởi những rãnh hẹp

Vi nhung là sự biến đổi phần đỉnh của màng nguyên chất của tế bào biểu

mô phủ trên bề mặt lông nhung, chúng giúp gia tăng diện tích hấp thu của ruột non lên 20 lần

nhung dài 1-1.5 µm và có đường kính 0.1 µm

- Tế bào đài: nằm xen giữa những tế bào mâm khía Đây là những tế bào phần giữa phình to, hai đầu thon lại

- Tế bào ưa crôm và ưa bạc: có dạng một cái chai, đáy nằm trên đáy của biểu mô Thường gặp tế bào này ở phần đỉnh lông nhung

Lớp đệm: được cấu tạo bởi tổ chức liên kết có nhiều lưới sợi, đại thực bào, lâm ba cầu Ngoài ra, trong lớp đệm còn có nang kín lâm ba chiếm cả chiều cao niêm mạc và xuống cả phần dưới niêm mạc Một vài nơi nang kín lâm ba tập họp lại thành mảng rộng gọi là mảng Payer

Lớp cơ niêm: cấu tạo bởi tổ chức cơ trơn gồm lớp cơ vòng bên trong và lớp

cơ dọc bên ngoài

ở tất cả các đoạn ruột và nằm trong niêm mạc Tuyến Brunner thì chỉ thấy ở tá tràng và ở đó nó có cả ở tầng niêm mạc và tầng dưới niêm mạc (Trương Đình Kiệt và Phan Chiến Thắng, 1991)

Lớp áo cơ

Cấu tạo lớp áo cơ là tổ chức cơ trơn Lớp cơ vòng phía trong dày, lớp cơ dọc phía ngoài mỏng Giữa hai lớp có tổ chức liên kết thần kinh và mạch quản

Lớp áo ngoài

Lớp áo ngoài là tổ chức liên kết

2.3.3 Ruột già (Large intestine)

Ruột già chia thành các phần: manh tràng, kết tràng, trực tràng Chức năng chủ yếu của ruột già là hấp thu nước và thu nhận những chất cặn bã hoặc không tiêu hóa được chuyển tới từ ruột non Sau đó những chất này kết lại thành phân để thải ra ngoài

Chức năng ruột già thay đổi tùy loài gia súc Đối với loài ăn thịt, sự tiêu hóa xảy ra chủ yếu ở ruột non do đó ruột già chỉ hấp thu nước và hình thành phân Ruột già có khả năng hấp thu rất kém vì nhung mao kém phát triển hoặc không phát triển, trừ ở thú non Đối với ngựa, thỏ, chuột lang thì manh tràng thay dạ cỏ

để tiêu hóa cellulose Ngoài ra ruột già còn lên men sinh acid béo thấp và các khí

CO2, CH4, H2S… Ở ruột già còn nhiều loại vi khuẩn, có loại vi khuẩn tổng hợp được vitamin B, K…(Nguyễn Xuân Hoạt và Phạm Đức Lộ, 1980)

Ruột già có cấu tạo khác ruột non ở một số điểm như sau:

- Ruột già không có tuyến Brunner, có tuyến ruột nhưng tuyến ruột không

có tế bào Paneth, các tuyến này chủ yếu hấp thụ nước và tiết ra một số men không đáng kể

- Lông nhung chỉ có ở thời kỳ phôi thai, còn thời kỳ trưởng thành thì không có

- Có tuyến tế bào hình đài, nhất là ở tuyến ruột và nang kín lâm ba

- Áo cơ là lớp cơ trơn gồm hai lớp cơ vòng bên trong và cơ dọc bên ngoài Nhưng lớp cơ dọc ngoài sợi cơ tập trung thành từng bó chạy theo chiều dọc, tương đối dày, còn các chỗ khác chỉ còn lại một số ít sợi rải rác Ở thỏ, lớp cơ vòng thường thắt lại từng đoạn

- Các mạch quản và thần kinh thì đơn giản vì ruột già không có lông nhung, tuyến ruột thẳng (Nguyễn Xuân Hoạt và Phạm Đức Lộ, 1980)

Nội tiết: gan tiết chất heparin chống đông máu, dự trữ sắt cho quá trình tạo máu, sản sinh ure tham gia vào chức năng bài tiết,…

Gan được bao bọc bởi một màng liên kết, màng này phân vách vào gan chia gan thành nhiều thùy và tiểu thùy

Mỗi tiểu thùy gan là một khối hình đa diện, những tiểu thùy ngăn cách nhau bởi vách liên kết mỏng gọi là khoảng Kiernan Mô liên kết này càng dày thì làm cho ranh giới giữa các tiểu thùy càng rõ (ở heo) Tiểu thùy khó thấy ở ngựa,

bò, mèo, thỏ Trong mỗi tiểu thùy các tế bào gan xếp thành dãy tế bào gọi là bè Remark Các bè lại đan chéo với nhau tạo thành lưới Giữa các mắc lưới của tiểu thùy là những mao mạch chạy khúc khuỷu, những mao mạch này sẽ tập trung lại

đổ vào một tĩnh mạch nằm giữa tiểu thùy gọi là tĩnh mạch trung tâm hay tĩnh mạch cửa tiểu thùy Đây là một nhánh của tĩnh mạch trên gan Ngoài ra, giữa mặt bên của hai tế bào gan nằm sát nhau có một khe tròn gọi là vi quản mật Các vi quản mật không có vách Mật do các tế bào tiết ra đổ vào các ống dẫn mật nằm ở vách liên kết rồi tích trữ ở túi mật (ngoại trừ ngựa, chuột, bồ câu không có túi mật) (Lâm Thị Thu Hương, 2005)

Tế bào gan

Hình đa diện 6-8 mặt, đường kính 20-30µ Hai mặt tiếp xúc mao mạch đối

diện nhau Những mặt còn lại tiếp xúc với tế bào khác Có 1-2 nhân nằm giữa tế

bào, đường kính 9-12µ, có thể thấy rõ hạt nhân thường nằm giữa tế bào Hình thái

của tế bào thay đổi tùy theo trạng thái cơ năng như sau: khi tiếp nhận thức ăn thì

nó lớn lên trở thành tròn, bào tương xuất hiện các hạt glycogen to, nhỏ Các hạt này sau đó bị phân giải đưa sang hệ thống máu Nếu thức ăn không tiếp tục thì sau một vài ngày, nhất là khi có hoạt động cơ vân mạnh sẽ thấy glycogen biến hết

đi

Tế bào Kupffer

Tế bào có dạng hình sao, nhân tròn, bầu dục hay hình thoi Bào tương chứa

ít tiểu vật, lưới nội bào có hạt lysosome và ferritin

Bám vào nội mạc mao quản bởi các nhánh của tế bào Xuất hiện nhiều ở những nơi mao quản chia nhánh

Có nhiệm vụ thực bào và có khả năng kích thích các tế bào nội mạc biến thành đại thực bào

Mao quản gan

Mao quản máu: là khe hở giữa bè Remark, chạy khúc khuỷu trong tiểu thùy Thành mao mạch mỏng trong suốt, bên trong lòng mao mạch có tế bào Kupffer

Mao quản mật: nằm giữa hai mặt tế bào sát nhau, là một khe tròn không có thành Dịch mật chảy ra chu vi của tiểu thùy và sau đó đổ vào ống dẫn mật gan thùy có thành ống

Mạch quản ở gan

Gan tiếp nhận máu từ tĩnh mạch cửa và động mạch gan Tĩnh mạch cửa mang máu từ dạ dày, ruột về tim; động mạch gan mang máu nhiều oxy đến cung cấp cho các hoạt động của tổ chức gan Mao quản sinh ra do sự phân nhánh của mạch quản hợp lại với nhau làm thành lưới chung Máu ở gan ra theo tĩnh mạch gan

Tĩnh mạch gian thùy và tĩnh mạch giữa tiểu thùy: tĩnh mạch cửa xuyên vào trong gan, qua rốn gan phân nhánh đi về các tiểu thùy hình thành các tĩnh mạch gian thùy Tĩnh mạch gian thùy phân nhiều mao mạch nhỏ đi vào trong tiểu thùy tạo thành một lưới mao mạch nhỏ Lưới này lại đổ chung vào tĩnh mạch giữa tiểu thùy Như vậy, ở tiểu thùy máu chảy từ chu vi vào trung tâm Máu ở tĩnh mạch giữa tiểu thùy chảy về đáy của tiểu thùy rồi qua tĩnh mạch tập hợp lại Sau đó, máu đổ về tĩnh mạch gan

Động mạch gian thùy: động mạch gan đi đến rốn gan rồi vào trong chia nhánh như tĩnh mạch cửa, hình thành các động mạch gian thùy lớn nhỏ Động mạch gian thùy lại phát nhánh đi vào tiểu thùy để nối với các mao quản Như vây, máu của động mạch gan và tĩnh mạch cửa đến lưới mao mạch thì hòa chung với nhau

Ống dẫn mật và túi mật

Ống dẫn mật

Ống dẫn mật có cấu tạo ba lớp: lớp niêm mạc, lớp cơ và lớp ngoài

- Niêm mạc: có nhiều nếp gấp cấu tạo nên tế bào biểu mô phủ đơn trụ Xen

kẽ có tế bào hình đài đối với loài nhai lại; lớp đệm có nhiều sợi chun chứa tuyến ống tiết chất nhờn và một ít nước

- Lớp cơ: là cơ trơn gồm cơ vòng nằm phía trong, cơ dọc nằm phía ngoài

2.4 Cấu tạo vi thể dạ dày của gia cầm và thủy cầm

Có hai phần: dạ dày tuyến và dạ dày cơ

2.4.1 Dạ dày tuyến (Proventriulus or Glandular Stomach)

Thon nhỏ, to hơn thực quản một ít, nằm bên trái của mặt phẳng giữa, là một túi hình bầu dục dài

Thành dạ dày tuyến tương đối dày, niêm mạc lót trong của dạ dày tuyến có nhiều tuyến tiết dịch tiêu hóa Khi thức ăn đi qua đây được tẩm dịch tiêu hóa rồi xuống dạ dày cơ

Chức năng: tiết dịch vị chứa mem tiêu hóa để thấm vào thức ăn

Cấu trúc dạ dày tuyến từ trong ra ngoài gồm 3 lớp áo: lớp áo trong, lớp áo giữa, lớp áo ngoài

Lớp áo trong

Màng nhầy được nâng lên thành những nếp gấp và được che phủ bởi lớp biểu mô phủ đơn trụ chứa những tế bào hình đài

Biểu mô phủ đơn trụ bao gồm những tế bào biểu mô tiết chất nhờn, biểu

mô này lõm sâu xuống để tạo thành lỗ đổ ra vào lòng túi tuyến Dưới biểu mô xen với ống tuyến là tổ chức liên kết có nang kín lâm ba (Nguyễn Xuân Hoạt và Phạm Đức Lộ, 1980)

Lớp đệm: chứa tuyến dạ dày hình ống trong đó có những tế bào hình hộp

mà bào tương có nhiều hạt tiết

Cơ niêm: mỏng có cấu tạo bằng cơ trơn

Lớp hạ niêm mạc: lớp này hoàn toàn chứa đầy mô tuyến và mô liên kết Những túi tuyến đơn tập hợp lại thành những thùy tuyến Các thùy tuyến này làm cho thành của dạ dày tuyến dày lên Các thùy tuyến có những ống dẫn đến bề mặt của biểu mô phủ đơn trụ

Tổ chức liên kết: có 2 dạng là dạng phân bố lỏng lẻo giữa các thùy tuyến

và dạng khác là rắn chắc gần như bao trùm các thùy tuyến

Lớp áo giữa

Lớp áo giữa do cơ trơn tạo thành gồm: lớp cơ dọc ở trong, lớp cơ vòng ở giữa, lớp cơ dọc ở ngoài

Lớp áo ngoài

Lớp áo ngoài là tổ chức liên kết

2.4.2 Dạ dày cơ (Gizzard of Muscular Stomach)

Dạ dày cơ nối với dạ dày tuyến bởi một eo hẹp, nằm giữa vùng bụng Dạ dày cơ nằm giữa hai thùy của gan và một phần bên cạnh thùy trái của gan

Dạ dày cơ giống như một khối cầu dẹp, được bao quanh giống như hai kính lồi, lớp cơ màu đỏ nâu, dày, chắc, khỏe Bề mặt được che phủ bởi một lớp gân chắc, sáng bóng Gân dày ở trung tâm và gân mỏng tại mép của dạ dày cơ Bên ngoài thường có lớp mỡ bao bọc

Dạ dày cơ là nơi nghiền thức ăn nhờ cấu tạo bởi lớp cơ dày Mặt trong có lớp niêm mạc hóa sừng Ngoài ra còn có sự hỗ trợ của một số ít sạn thường xuyên

có trong dạ dày cơ

Cấu trúc vi thể dạ dày cơ từ trong ra ngoài gồm các lớp sau:

Lớp niêm mạc: là lớp biểu mô sừng hóa Lớp này rất dày do biểu mô tuyến nhô lên trên bề mặt làm thành Lớp biểu mô tuyến ở dưới lớp hóa sừng gồm những ống tuyến thẳng đứng tiết ra chất nhờn, giới hạn các ống tuyến là tổ chức liên kết Dưới các tuyến ống là một lớp riêng biệt có cơ trơn, tổ chức liên kết Lớp cuối cùng của niêm mạc là lớp gân chắc

Lớp áo cơ: cấu tạo bằng cơ trơn dày, xen kẽ với các bó cơ trơn là các chồi gân đâm vào

Lớp áo ngoài: hầu như không có (Nguyễn Xuân Hoạt và Phạm Đức Lộ,

1980)

Chương 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Phương Pháp

3.1.1 Địa điểm thực hiện

Đề tài được thực hiện tại phòng Mô học, Bộ môn Thú Y, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Đại học Cần Thơ

Thời gian: từ tháng 9 đến tháng 11 năm 2013

3.1.2 Dụng cụ, trang thiết bị, hóa chất

Dụng cụ: chai, lọ, phễu, lame, lamelle, dao lam, kéo, kẹp

Máy cắt vi mẫu, kính hiển vi, tủ hấp, tủ sấy, bếp tải, bản đúc và thanh đúc mẫu, máy ảnh kỹ thuật số

Đối với vịt: chọn vịt khỏe mạnh, không nhiễm bệnh, nặng khoảng 2kg, cho vịt nhịn ăn từ 24-48 giờ, chỉ cho uống nước Sau đó giết thỏ bằng cách hủy tủy Dùng kéo giải phẫu mổ xoang bụng Lấy các mẫu gồm: dạ dày tuyến, dạ dày cơ

3.2.2 Cố định mẫu

Cố định mẫu bằng dung dịch Formol 10% Vì formol có những đặc tính:

- Vận tốc xuyên thấm và cố định mẫu nhanh

- Không làm co mẫu, không làm mẫu cứng lại

- Bảo quản tốt cấu trúc tế bào

- Làm tăng sự kiềm tính của cấu trúc khi nhuộm

Giai đoạn đầu ta ngâm nguyên các phần trên trong dung dịch formol 10% trong 15 phút để ổn định tổ chức cho dễ cắt Kế tiếp là vớt ra dung lưỡi lam sạch

cắt các phần mỡ, màng treo ruột

3.2.3 Lấy mẫu nhỏ

Cách lấy mẫu như sau

Mẫu trên ống tiêu hóa thỏ:

- Thực quản: lấy một đọan thực quản sau đó cắt thành từng đoạn nhỏ khoảng 1cm

- Ruột non: lấy một đọan ruột non sau đó cắt thành từng đoạn nhỏ khoảng 1cm

- Ruột già: lấy một đoạn ruột già sau đó cắt thành từng đoạn nhỏ khoảng 1cm

- Gan: cắt mẫu gan với kích thước 0.5cm x 0.5cm x 1cm, cắt ở trung tâm của gan để thấy được tĩnh mạch gan và ống dẫn mật

Mẫu dạ dày vịt:

- Dạ dày tuyến: lấy ở đoạn giữa dạ dày tuyến 1cm

- Dạ dày cơ: lấy ở nơi có cơ nhiều, chia thành hai phần cơ và phần hóa sừng với kích thước 0.5cm x 0.5cm x 1cm

Tiếp tục cố định mẫu trong formol 10%, thời gian cố định khoảng 24 giờ nhưng thời gian này còn tùy thuộc vận tốc xuyên thấm, vận tốc cố định của dung dịch, nhiệt độ môi trường, độ dày và cấu trúc mẫu…

3.2.4 Rửa mẫu

Mẫu sau khi cố định xong phải được rửa lại bằng nước sạch Bằng cách cho mẫu vào trong chậu nước đặt dưới vòi nước chảy nhẹ liên tục trong 2 giờ, nhằm mục đích loại trừ tất cả formol thừa trong mẫu ra vì nếu formol sót lại sẽ kết hợp với Hematoxyline khi nhuộm sẽ tạo ra kết tủa màu đen sậm bên ngoài tế

bào làm phai màu, mẫu không được giữ lâu