Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện nhanh virus cúm gia cầm a h5n1 trong mẫu bệnh phẩm bằng kỹ thuật multiplex reverse transcription polymerase chain reaction

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - TRẦN THỊ TÌNH NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN NHANH VIRUS CÚM GIA CẦM A/H5N1 TRONG MẪU BỆNH PHẨM BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX REVERSE TRANSCRIPTION POLYMERASE CHAIN REACTION LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2011 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - TRẦN THỊ TÌNH NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN NHANH VIRUS CÚM GIA CẦM A/H5N1 TRONG MẪU BỆNH PHẨM BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX REVERSE TRANSCRIPTION POLYMERASE CHAIN REACTION Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS LƯƠNG XUÂN HIẾN Hà Nội – Năm 2011 MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 ĐẠI CƢƠNG VỀ VIRUS CÚM A/H5N1 .3 1.1.1 Phân loại học danh pháp 1.1.2 Hình thái cấu trúc virus cúm A/H5N1 1.1.3 Hệ gen protein virus A/H5N1 1.1.4 Chu trình tái virus cúm A/H5N1 1.1.5 Hiện tượng biến đổi kháng nguyên virus cúm A .11 1.1.6 Khả thích ứng vật chủ virus cúm A 12 1.1.7 Độc lực khả gây bệnh virus cúm A/H5N1 14 1.1.8 Sức đề kháng virus cúm A 15 1.2 CHẨN ĐỐN, ĐIỀU TRỊ VÀ DỰ PHỊNG BỆNH CÚM GIA CẦM A/H5N1 .16 1.2.1 Triệu chứng nhiễm cúm A/H5N1 16 1.2.2 Các phương pháp xét nghiệm chẩn đoán nhiễm cúm A/H5N1 17 1.2.3 Điều trị nhiễm cúm A/H5N1 người 23 1.2.4 Kiểm sốt lây nhiễm dự phịng .24 1.3 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VIRUS CÚM A/H5N1 Ở VIỆT NAM VÀ TRÊN THẾ GIỚI 25 Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .27 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 27 2.1.1 Mẫu vật 27 2.1.2 Hóa chất .27 2.1.3 Thiết bị .28 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.2.1 Chọn mẫu 28 2.2.2 Kỹ thuật lấy mẫu, bảo quản vận chuyển mẫu .28 2.2.3 Tách chiết RNA mẫu bệnh phẩm 29 2.2.4 Thiế t kế mồ i .30 2.2.5 Tối ưu phản ứng RT-PCR phát gen M, HA NA 32 2.2.6 Tối ưu phản ứng Multiplex RT-PCR phát virus A/H5N1 .38 73 2.2.7 Thử nghiệm phản ứng Multiplex RT-PCR mẫu bệnh phẩm 40 2.2.8 Điê ̣n di và phân tích kế t quả 41 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .43 3.1 Thiết kế mồi 43 3.1.1 Thiết kế mồi đặc hiệu cho gen M virus cúm A 43 3.1.2 Thiết kế mồi đặc hiệu cho gen HA virus cúm A/H5N1 44 3.1.3 Thiết kế mồi đặc hiệu cho gen NA virus cúm A/H5N1 .45 3.2 Tối ƣu phản ứng RT-PCR phát gen M, HA NA .47 3.2.1 Tối ưu nhiệt độ gắn mồi .47 3.2.2 Tối ưu nồng độ mồi 49 3.2.3 Tối ưu thời gian kéo dài chuỗi 50 3.2.4 Đánh giá độ nhạy phản ứng RT-PCR 51 3.2.5 Đánh giá độ đặc hiệu phản ứng RT-PCR 53 3.3 Tối ƣu phản ứng multiplex RT-PCR phát virus A/H5N1 56 3.3.1 Tối ưu nhiệt độ gắn mồi 56 3.3.2 Tối ưu nồng độ mồi 56 3.3.3 Tối ưu thời gian kéo dài chuỗi 57 3.3.4 Tối ưu số chu kỳ phản ứng 58 3.3.5 Đánh giá độ nhạy phản ứng multiplex RT-PCR 59 3.3.6 Đánh giá đô ̣ đă ̣c hiê ̣u của phản ứng multiplex RT-PCR 59 3.4 Ứng dụng kỹ thuật multiplex RT-PCR phát virus A/H5N1 mẫu bệnh phẩm 61 Kết luận .67 Kiến nghị 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO .68 74 CHỮ VIẾT TẮT bp: Base pair DEPC-treated water: Diethylpyrocarbonate treated water DNA: Deroxi ribonucleic acid dNTP: Deoxyribonucleotide triphosphate EDTA: Etilendiamin tetraaxetic acid HA (H): Haemagglutinin LB: Luria-Bertani media M: Matrix protein NA (N): Neuraminidase NP: Nucleoprotein NS: Non-structural protein PA: Polymerase A protein PB: Polymerase B protein RT-PCR: Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction RNA: Ribonucleic acid TBE: Tris Base, Acid Boric, EDTA vRNP: Viral ribonucleoprotein 77 DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ HÌNH VẼ Hình 1.1 Cấu trúc virus cúm A Hình 1.2 Các phân đoạn gen protein virus cúm A/H5N1 Hình 1.3 Chu trình tái virus cúm A… 10 Hình 1.4 Các vật chủ tự nhiên khả lây nhiễm loài vật chủ virus cúm A 13 Bảng 2.1: Các thành phần phản ứng RT-PCR 33 Bảng 2.2: Chu trình nhiệt phản ứng RT-PCR 33 Bảng 2.3: Thành phần phản ứng multiplex RT-PCR .37 Bảng 2.4: Chu trình nhiệt phản ứng multiplex RT-PCR 38 Bảng 3.1: Cặp mồi phát gen M virus cúm A 43 Hình 3.1: Đặc điểm cặp mồi phát gen M virus cúm A .43 Bảng 3.2: Cặp mồi phát gen HA virus cúm A/H5N1 44 Hình 3.2: Đặc điểm cặp mồi phát gen HA virus cúm A/H5 .45 Bảng 3.3: Cặp mồi phát gen NA virus cúm A/H5N1 46 Hình 3.3: Đặc điểm cặp mồi phát gen NA virus cúm A/N1 46 Bảng 3.4: Trình tự mồi lựa chọn để thực phản ứng RT-PCR… 47 Hình 3.4 Ảnh điện di kết tối ưu nhiệt độ gắn mồi cho phản ứng RT-PCR phát gen riêng biệt 49 Hình 3.5 Ảnh kết điện di tối ưu nồng độ mồi cho phản ứng RT-PCR .50 Hình 3.6 Ảnh điện di kết tối ưu thời gian kéo dài chuỗi 51 Bảng 3.5: Giá trị đo độ hấp thụ OD RNA gen M, HA NA 51 Hình 3.7 Ảnh điện di đánh giá độ nhạy phản ứng RT-PCR 52 Bảng 3.6: Thành phần phản ứng RT-PCR phát gen M 53 Bảng 3.7: Chu trình nhiệt phản ứng RT-PCR phát gen M .54 Bảng 3.8: Thành phần phản ứng RT-PCR phát gen H5 54 Bảng 3.9: Chu trình nhiệt phản ứng RT-PCR phát gen H5 54 Bảng 3.10: Thành phần phản ứng RT-PCR phát gen N1 55 75 Bảng 3.11: Chu trình nhiệt phản ứng RT-PCR phát gen N1 55 Hình 3.8: Ảnh điện di tố i ưu nhiệt độ gắn mồi cho phản ứng multiplex RT-PCR 56 Hình 3.9 Ảnh điện di tối ưu nồng độ mồi phản ứng multiplex RT-PCR 57 Hình 3.10: Ảnh điện di tối ưu thời gian kéo dài chuỗi phản ứng multiplex RT-PCR 58 Hình 3.11: Ảnh điện di tối ưu số chu kỳ phản ứng multiplex RT-PCR 59 Hình 3.12: Thử nghiê ̣m đánh giá độ nhạy của phản ứng multiplex RT-PCR… .59 Hình 3.13: Ảnh điện di đánh giá độ đặc hiệu phản ứng multiplexRT-PCR .60 Bảng 3.12: Thành phần phản ứng multiplex RT-PCR .60 Bảng 3.13: Chu trình nhiệt phản ứng multiplex RT-PCR ……………………….61 Hình 3.14: Kế t quả thử nghiê ̣m phản ứng multiplex RT-PCR mẫu bê ̣nh phẩm dương tính………………………………………………………………………………… 62 Hình 3.15: Kế t quả thử nghiê ̣m phản ứng multiplex RT-PCR phát virus cúm gia cầm A/H5N1 số mẫu bê ̣nh phẩm………………………………………….63 Hình 3.16: Kế t quả thử nghiê ̣m phản ứng RT-PCR phát virus cúm gia cầm A/H5N1 số mẫu bê ̣nh phẩm………………………………………………….…64 Bảng 3.14: So sánh kết xét nghiệm phản ứng RT-PCR multiplex RT-PCR mẫu bệnh phẩm……………………………………………………………………… 64 Bảng 3.15: So sánh thời gian chi phí hoá chất làm xét nghiệm phản ứng multiplex RT-PCR RT-PCR………………………………………………………………65 76 MỞ ĐẦU Trong năm gần đây, dịch cúm gia cầm virus A/H5N1 vấn đề quan tâm giới, đặc biệt nước châu Á Việt Nam, Indonesia, Thái Lan, Trung Quốc Kể từ cuối năm 2003 đến nay, dịch cúm A/H5N1 gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi gia cầm gây tử vong cho hàng trăm người Cả giới lo sợ trước nguy xảy đại dịch cúm người virus A/H5N1 giống vụ đại dịch cúm xảy kỷ 20 Các nước giới tiêu tốn hàng tỷ đô la cho việc chuẩn bị chống lại đại dịch cúm H5N1 xảy tương lai mua thuốc thiết bị y tế, nghiên cứu sản xuất vaccine, thực hành phương án phòng chống dịch, thực chiến lược nhằm kiểm soát chặt chẽ đường biên giới Ở Việt Nam, kể từ năm 2003 đến nay, dịch cúm gia cầm liên tục xảy hầu hết tỉnh thành tồn quốc Mỗi năm có hàng triệu gia cầm bị chết tiêu hủy Theo thống kê Tổ chức Y tế Thế giới, Việt Nam đứng thứ giới (sau Indonesia) số người nhiễm tử vong virus A/H5N1 Virus cúm A/H5N1 virus có khả biến đổi gen nhanh chóng hình thành nên chủng virus nên việc sử dụng vaccine để dự phịng thường khơng đạt hiệu cao Ở Việt Nam nay, dịch cúm A/H5N1 liên tục xảy gia cầm người, mức độ không trầm trọng giai đoạn trước khơng phát có biện pháp dập dịch kịp thời dịch trở nên bùng phát Khi có dịch cúm gia cầm, phương pháp chẩn đốn nhanh, nhạy xác cần thiết cho việc điều trị, kiểm soát ngăn chặn kịp thời tránh lây lan rộng cộng đồng Để phát virus cúm A/H5N1 mẫu bệnh phẩm người gia cầm, hầu hết phòng xét nghiệm áp dụng kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction) Đây kỹ thuật sinh học phân tử, cho phép phát virus với độ xác cao, thời gian làm xét nghiệm khoảng 4-6 thực Realtime RT-PCR 12-24 thực RT- PCR điện di gel agarose Với RT-PCR thông thường, người ta phải thực ba phản ứng để chẩn đoán xác định virus cúm A/H5N1, bao gồm: phản ứng để xác định virus cúm A, phản ứng xác định subtype H5 phản ứng xác định subtype N1 Để đơn giản hóa q trình xét nghiệm, rút ngắn thời gian xét nghiệm tiết kiệm chi phí người ta ứng dụng kỹ thuật multiplex RT-PCR, cho phép chẩn đoán xác định cúm A/H5N1 với phản ứng RT-PCR thay phải làm ba phản ứng RT-PCR Tuy nhiên, việc nghiên cứu thiết kế xây dựng quy trình thực kỹ thuật multiplex RT-PCR phức tạp nên hầu hết phòng xét nghiệm nước chưa áp dụng kỹ thuật chẩn đốn cúm A/H5N1 Chính vậy, chúng tơi thực ”Nghiên cứu xây dựng quy trình phát nhanh virus cúm gia cầm A/H5N1 mẫu bệnh phẩm kỹ thuật Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction” Labo Trường Đại học Y Thái Bình với mục tiêu: Thiết kế lựa chọn mồi phù hợp để thực phản ứng multiplex RT-PCR phát virus cúm A/H5N1 Nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện phản ứng multiplex RT-PCR: nhiệt độ thời gian gắn mồi, nồng độ mồi, Thử nghiệm phản ứng multiplex RT-PCR phát A/H5N1 số mẫu bệnh phẩm thu thập từ người gia cầm Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 ĐẠI CƢƠNG VỀ VIRUS CÚM A/H5N1 1.1.1 Phân loại học danh pháp 1.1.1.1 Phân loại virus cúm Theo ủy ban Quốc tế phân loại virus (ICTV - International Committee on Taxonomy of Viruses), virus cúm thuộc nhóm V, họ Orthormyxoviridae, gồm type A, B C Chúng virus có vật liệu di truyền RNA sợi đơn âm [32] Sự phân biệt virus cúm A, B C dựa khác đặc tính kháng nguyên nucleoprotein (NP) protein M1 (matrix protein) Ngoài ra, hệ gen virus cúm A B có đoạn RNA cịn virus cúm C có đoạn RNA [36] Trong type type A virus có giới hạn vật chủ rộng, lưu hành phổ biến gia cầm số động vật có vú lợn, ngựa, chó, mèo, hải cẩu,… người [32] Virus cúm A loại có độc lực mạnh nhất, có khả biến đổi gen lớn nguyên nhân chủ yếu gây vụ đại dịch cúm kỷ qua Dựa vào khác biệt đặc tính kháng nguyên hai glycoprotein haemagglutinin (HA) neuraminidase (NA), virus cúm A chia thành 16 subtype HA (H1-H16) subtype NA (N1-N9) Sự tái tổ hợp subtype HA NA, mặt lý thuyết tạo nhiều subtype khác độc tính khả gây bệnh [2] Tất subtype HA NA diện chủng virus lưu hành loài thủy cầm hoang dã Tuy nhiên, có số subtype định thường xuyên lưu hành người H1N1, H1N2, H2N2, H3N2 [11] Cúm A/H5N1 subtype có khả gây nhiễm cao virus cúm Các chủng virus cúm gia cầm xâm nhiễm vào nhiều loại động vật khác chim, lợn, ngựa, hải cẩu, cá voi người Virus cúm B virus cúm C lưu hành chủ yếu người gây vụ dịch mức độ vừa nhỏ thành trình tổng hợp tất sản phẩm Kết điện di sản phẩm phản ứng thời gian kéo dài chuỗi 30 giây, 45 giây 60 giây (hình 3.10) cho thấy khơng có khác biệt nhiều lượng sản phẩm khuếch đại phản ứng Để góp phần rút ngắn thời gian làm xét nghiệm, lựa chọn thời gian kéo dài chuỗi thích hợp 30 giây Hình 3.10: Ảnh điện di tối ưu thời gian kéo dài chuỗi phản ứng multiplex RT-PCR M: Thang DNA chuẩn 100 bp; Thời gian kéo dài chuỗi (giây) ghi 3.3.4 Tối ƣu số chu kỳ phản ứng Để có số chu kỳ thích hợp cho phản ứng multiplex RT-PCR, kiểm tra số lượng chu kỳ 35, 40, 45 50 chu kỳ Kết điện di (hình 3.11) cho thấy 50 chu kỳ sản phẩm phản ứng không thay đổi nhiều so với 45 chu kỳ (các band sáng rõ nét) Còn phản ứng thực 35 40 chu kỳ cho band mờ nhiều Như vậy, số chu kỳ phản ứng thích hợp 45 đến 50 chu kỳ để rút ngắn thời gian làm xét nghiệm lựa chọn số chu kỳ chu trình nhiệt phản ứng multiplex RT-PCR 45 chu kỳ 58 Hình 3.11: Ảnh điện di tối ưu số chu kỳ phản ứng multiplex RT-PCR M: Thang DNA chuẩn 100 bp; NC: Chứng âm; Số chu kỳ phản ứng ghi 3.3.5 Đánh giá độ nhạy phản ứng multiplex RT-PCR Phản ứng th ực với mẫu chuẩn RNA cúm A /H5N1 có nồng độ khác từ 101 đến 1010 RNA /µl và sử du ̣ ng 10 µl để điê ̣n di gel agarose 2% Kế t quả điê ̣n di gel agarose 2%, nhuô ̣m ethidium bromide cho thấ y phản ứng dương tính với cúm A/H5N1 tức quan sát đươ ̣c c ả băng DNA có kích thước 154 bp (M), 292 bp (NA) 371 bp (HA) mẫu có từ 10/µl RNA trở lên (hình 3.12) Hình 3.12: Thử nghiê ̣m đánh giá độ nhạy của phản ứng multiplex RT-PCR M: thang DNA 100 bp; NC: Chứng âm; Số lượng bản RNA mẫu thử được ghi chú ở phía 3.3.6 Đánh giá đô ̣ đă ̣c hiêụ của phản ƣ́ng multiplex RT-PCR Phản ứng tiến hành với RNA số virus cúm khác (cúm B; cúm A/H1N1; cúm A/H5 cúm A/H3 không phải subtype N1) để kiểm tra độ đặc hiệu 59 phản ứng Kế t quả điện di (hình 3.13) cho thấ y phản ứng multiplex RT-PCR phát đồng thời gen (154 bp - M, 292 bp - NA, 371 bp - HA) với RNA virus A/H5N1; phát gen (292 bp - NA, 154 bp - M) với RNA virus cúm A/H1N1; phát gen (371 bp - HA; 154 pb - M) với RNA virus cúm A/H5; phát gen (154 bp - M) với RNA virus cúm A/H3 không phát gen với RNA virus cúm B Ngoài ra, thực h iê ̣n phản ứng với vâ ̣t liê ̣u di truyề n của mô ̣t số loài khác (người, Escherichia coli, Mycobacteria tuberculosis, Chlamydia trachomatis, Neisseria gorrnorhea, Hepatitis B virus, Hepatitis C virus, Human immunodeficiency virus, Human Papillomavirus), phản ứng m ultiplex RT-PCR đề u cho kế t quả âm tiń h Điều chứng tỏ với cặp mồi thiết kế phản ứng multiplex RT-PCR tối ưu đặc hiệu với virus cúm A subtype H5 subtype N1, khơng có phản ứng chéo với RNA lồi khác Hình 3.13: Ảnh điện di đánh giá độ đặc hiê ̣u của phản ứng multiplexRT-PCR M: thang DNA chuẩn 100 bp; NC: Chứng âm; 1: cúm A/H5; 2: cúm A/H3; 3: cúm B; 4: cúm A/H5N1; 5: cúm A/H1N1 Như sau tối ưu, thành phần điều kiện chu trình nhiệt phản ứng multiplex RT-PCR chẩn đốn cúm A/H5N1 là: Thành phần phản ứng (bảng 3.12): Bảng 3.12: Thành phần phản ứng multiplex RT-PCR Thứ tự Sinh phẩ m RNase free water 20.75 Qiagen Onestep RT-PCR buffer 5X 10 Thể tích (l) 60 Nồng độ cuối 1X dNTP mix 10 mM each 0.4 mM each Diag MF 10 M 1.5 0.3 M Diag MR 10 M 1.5 0.3 M Diag H5F 10 M 2.5 0.5 M Diag H5R 10 M 2.5 0.5 M Diag N1F 10 M 0.4 M Diag N1R 10 M 0.4 M Qiagen Onestep RT-PCR Enzyme mix RNase Inhibitor 40 U/l 0.25 10 U RNA template pg – g Tở ng thể tích phản ứng 50 Chu trình nhiệt (bảng 3.13): Bảng 3.13: Chu trình nhiệt phản ứng multiplex RT-PCR Thứ tự Nhiê ̣t độ (oC) Thời gian Số chu kỳ 50 30 phút 95 15 phút 94 30 giây 57 30 giây 72 30 giây 72 phút 45 3.4 Ứng dụng kỹ thuật multiplex RT-PCR phát virus A/H5N1 mẫu bệnh phẩm 61 Các mẫu bệnh phẩm tiến hành xử lý tách chiết RNA sinh phẩm QIAamp viral RNA mini spin protocol Sản phẩm RNA tách chiết đo OD 260 nm 280 nm để xác định hàm lượng RNA xác định độ tinh RNA mẫu bệnh phẩm Kết đo OD cho thấy, tỷ lệ OD260/OD280 nằm khoảng 1.8-2.0, RNA tách chiết không lẫn protein Sau đó, RNA mẫu bệnh phẩm sử dụng để thực phản ứng multiplex RT-PCR phát gen M, HA NA virus cúm gia cầm A/H5N1 Đối với mẫu bệnh phẩm chưa biết chưa biết có nhiễm H5N1 hay khơng, chúng tơi thực phản ứng RT-PCR phát gen riêng rẽ để so sánh kiểm tra độ tin cậy phản ứng multiplex RT-PCR - Kết kỹ thuật multiplex RT-PCR đươ ̣c thử nghiê ̣m 14 mẫu dương tin ́ h với virus cúm A/H5N1 (2 mẫu từ ngan, mẫu từ vit,̣ mẫu từ gà, mẫu từ người) điện di (hình 3.14) cho thấy phản ứng multiplex RT-PCR đã phát hiê ̣n đươ ̣c virus cúm A/H5N1 14 mẫu bê ̣nh phẩ m Hình 3.14: Kế t quả thử nghiê ̣m phản ứng multiplex RT-PCR mẫu bê ̣nh phẩm dương tính M: thang DNA chuẩn 100 bp; NC: Chứng âm; md: muscovy duck; ck: chicken; d: duck 1, 2, 3; h: human 1, 2, 3, 4, 5, Qua kết cho thấy, kỹ thuật multiplex RT-PCR tối ưu hoá với cặp mồi thiết kế đặc hiệu nhạy Kỹ thuật áp dụng để xác định virus cúm A/H5N1 đối tượng vật chủ khác nhau: gia cầm, người - Kết thử nghiệm kỹ thuật multiplex RT-PCR tối ưu phát có mặt virus cúm gia cầm A/H5N1 30 mẫu bệnh phẩm thu thập từ gia cầm chết bị bệnh vụ dịch cúm: 62 Hình ảnh điện di sản phẩm phản ứng multiplex RT-PCR phát virus cúm A/H5N1 gel agarose 2% mẫu bệnh phẩm (hình 3.15) cho thấy mẫu chứng âm khơng bị nhiễm, mẫu dương tính (số 1, 3, 5, 6, 9) lên band (371 bp- HA, 292 bp- NA, 154 bp- M) tương đương với band chứng dương Các mẫu âm tính (số 2, 4, 10) khơng xuất band Hình 3.15: Kế t quả thử nghiê ̣m phản ứng multiplex RT-PCR phát virus cúm gia cầm A/H5N1 số mẫu bê ̣nh phẩm M: Thang DNA chuẩn 100 bp; NC: Chứng âm; PC: Chứng dương; 1-10: Mẫu bệnh phẩm Kết điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR phát gen M, HA NA mẫu bệnh phẩm (hình 3.16) cho thấy: Các mẫu âm tính (khơng xuất band nào) mẫu dương tính (xuất band phản ứng RT-PCR với cặp mồi hình 3.16 A, B, C) mẫu âm tính dương tính phản ứng multiplex RT-PCR chẩn đoán Như vậy, khẳng định kết phản ứng multiplex RT-PCR hoàn toàn đáng tin cậy Và khẳng định độ nhạy độ đặc hiệu phản ứng không đổi kết hợp mồi phản ứng (A) 63 (B) (C) Hình 3.16: Kế t quả thử nghiê ̣m phản ứng RT-PCR phát virus cúm gia cầm A/H5N1 số mẫu bê ̣nh phẩm A: RT-PCR phát gen M; B: RT-PCR phát gen HA; C: RT-PCR phát gen NA M: Thang DNA chuẩn 100 bp; NC: Chứng âm; PC: Chứng dương; 1- 10: Mẫu bệnh phẩm Trong 30 mẫu bệnh phẩm thử nghiệm, kỹ thuật multiplex RT-PCR RT-PCR phát mẫu dương tính (30%) với virus cúm gia cầm A/H5N1, 21 mẫu âm tính (70%) với virus cúm gia cầm (bảng 3.14) Kết kỹ thuật multiplex RT-PCR phát đồng thời gen có độ nhạy độ đặc hiệu khơng thay đổi so với phản ứng RT-PCR phát gen riêng biệt Độ đặc hiệu phản ứng 100%, độ nhạy cao, phát phản ứng có từ 10 virus trở lên Bảng 3.14: So sánh kết xét nghiệm phản ứng RT-PCR multiplex RTPCR mẫu bệnh phẩm Kỹ thuât xét nghiệm Dương tính Âm tính Tổng Multiplex RT-PCR 21 30 RT-PCR 21 30 Tỷ lệ 30% 70% 100% 64 So sánh thời gian chi phí làm xét nghiệm kỹ thuật multiplex RTPCR RT-PCR phát virus cúm A/H5N1 (bảng 3.15) cho thấy: thời gian hoàn thành xét nghiệm với phản ứng RT-PCR khoảng 9.5 giờ, chi phí hết 600 ngàn đồng; thời gian hoàn thành xét nghiệm với phản ứng multiplex RT-PCR khoảng 6.5 giờ, chi phí hết 320 ngàn đồng Như vậy, phản ứng multiplex RT-PCR rút ngắn thời gian làm xét nghiệm tích kiệm chi phí hố chất đến nửa so với phản ứng RT-PCR Bảng 3.15: So sánh thời gian chi phí hố chất làm xét nghiệm phản ứng multiplex RT-PCR RT-PCR Xét nghiệm Các bƣớc làm xét nghiệm RT-PCR Xử lý mẫu tách chiết RNA Thực phản ứng Qiagen Onestep RT-PCR Điện di gel agarose, nhuộm, quan sát Tổng Xử lý mẫu tách chiết RNA Thực phản ứng Qiagen Onestep RT-PCR Điện di gel agarose, nhuộm, quan sát Tổng Multiplex RT-PCR Thời gian (giờ) Chi phí (ngàn đồng) 150 420 1.5 9.5 30 600 150 140 1.5 6.5 30 320 Thảo luận Trong những năm gầ n đây, dịch cúm gia cầ m virus cúm A/H5N1 đã xảy ở nhiề u nước, đă ̣c biê ̣t là các nước khu vực Đông Nam A.́ Không chỉ gây bê ̣nh gia cầ m, virus cúm A/H5N1 lây nhiễm gây bệnh người với tỉ lệ tử vong cao Theo Tổ chức Y tế Thế giới, Viê ̣t Nam là nước có số người tử vong cúm A/H5N1 đứng thứ thế giới, sau Indonesia Ở nước ta, dịch cúm gia cầm A/H5N1 vẫn xảy và có thể bùng phát bấ t cứ lúc nào Khi dịch cúm gia cầm A/H5N1 bùng phát, việc điều trị, kiểm soát ngăn chặn khẩn cấp dịch cúm lan rộng vô quan trọng Do đó, viê ̣c xây dựng mô ̣t kỹ thuâ ̣t chẩ n đoán nh anh, nhạy xác virus cúm A/H5N1 cấp thiế t để sàng lọc số lượng lớn loại virus Trong kỹ thuật phân tử chẩn đoán virus cúm, phản ứng multiplex RT-PCR xem tốt cho kết nhanh, nhạy xác tiết kiệm chi phí hoá chất cho 65 xét nghiệm (Ellis et al., 1997; Fan et al., 1998; Osiowy, 1998; Grondahl et al., 1999; Liolios et al., 2001; Xie et al., 2006; Bellau-Pojul et al., 2005 and Thontiravong et al., 2007) Trong nghiên cứu chúng tôi, kỹ thuật multiplex RT-PCR với că ̣p mồ i cho phép phát hiê ̣n đồ ng thời cả trình tự đặc hiệu vir us cúm A (trên gen M ), subtype H (trên gen HA ) subtype N1 (trên gen NA) đã đươ ̣c xây dựng thành công Kỹ thuật multiplex RT-PCR thực theo phương pháp bước (phản ứng phiên mã ngược phản ứng khuếch đại thực tube phản ứng) nên giảm thiểu tối đa nguy ngoại nhiễm Mặt khác, thời gian làm xét nghiệm giảm đáng kể so với phương pháp hai bước (phản ứng RT PCR thực tube riêng biệt) kỹ thuật RT-PCR phát gen riêng biệt Kết thử nghiê ̣m cho thấ y kỹ thuâ ̣t multiplex RT-PCR chỉ đă ̣c hiê ̣u với virus cúm A/H5N1 có độ nhạy cao , có khả phát mẫuthử có từ 10 virus trở lên So với kỹ thuật RT-PCR phát gen riêng biệt, đô nhạy độ đặc hiệu phản ứng multiplex không bị giảm Thử nghiê ̣m 14 mẫu bê ̣nh phẩ m dương tính với virus cúm A /H5N1 (8 mẫu thu thâ ̣p từ gia cầ m và mẫu từ người), phản ứng m ultiplex RT-PCR đề u khuế ch đa ̣i thành công gen H 5, N1 M củ a virus Như vâ ̣y , kỹ thuật ứng dụng để phát nhiễm cúm A/H5N1 cả người và gia cầ m Các cặp mồi thiết kế đặc hiệu với gen M, HA NA chủng virus cúm phân lập từ vật chủ khác nên kỹ thuật multiplex RT-PCR cịn dùng để phát nhiễm cúm A/H5N1 số động vật có vú khác Kỹ thuật multiplex RT-PCR đươ ̣c thiế t kế với că ̣p mồ i có những ưu điể m vươ ̣t trô ̣i như: đơn giản hóa các bước quá trin ̀ h xét nghiê ̣m , giảm thời gian m xét nghiê ̣m và tiế t kiê ̣m đươ ̣c khoảng 50% chi phí hóa chấ t phu ̣c vu ̣ cho xét nghiê ̣m Tuy phản ứng multiplex realtime RT-PCR cho kết nhanh, nhạy xác u cầu có máy móc đại chi phí tốn Do vậy, kỹ thuật multiplex RT-PCR xây dựng thuận tiện cho nhiều phịng thí nghiệm nước ta 66 Kết luận Đã thiết kế cặp mồi đặc hiệu với gen M, HA NA dùng để phát virus cúm gia cầm A/H5N1 mẫu bệnh phẩm phản ứng mutiplex RT-PCR Đã xây dựng thành công kỹ thuâ ̣t m ultiplex RT-PCR cho phép phát hiê ̣n nhanh virus cúm A/H5N1 với đô ̣ nha ̣y và đô ̣ đă ̣c hiê ̣u cao và có thể áp du ̣ng để phát hiê ̣n nhiễm cúm A/H5N1 gia cầm người Kỹ thuật m ultiplex RT-PCR chỉ đă ̣c hiê ̣u với virus cúm A /H5N1, không có phản ứng chéo với loài khác Kỹ thuật có khả phát mẫ u thử có từ 10 RNA trở lên Kiến nghị Để tiếp tục phát triển kết nghiên cứu vào xét nghiệm cúm A/H5N1 mẫu bệnh phẩm gia cầm người, đề xuất kiến nghị sau: Tiếp tục nghiên cứu ứng dụng quy trình phản ứng multiplex RT-PCR vào phát virus cúm A/H5N1 số lượng lớn mẫu bệnh phẩm thu thập từ gia cầm người bị bệnh vụ dịch cúm Ứng dụng quy trình multiplex RT-PCR phát virus cúm A/H5N1 mẫu thu thập từ gia cầm khoẻ mạnh môi trường nơi có dịch cúm xảy để đánh giá lưu hành virus cúm gia cầm 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bùi Quang Anh (2006), Báo cáo tình hình cúm gia cầm Việt Nam, Hội nghị phịng chống dịch cúm gia cầm Bộ Nơng nghiệp phát triển Nơng thơn Lê Thanh Hịa, Đinh Duy Kháng, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải, Trương Nam Hải, Lê Trần Bình (2004), “Virus cúm A gia cầm mối quan hệ lây nhiễm động vật sang người”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 2(1): 1-18 Lê Văn Năm (2004), “Bệnh cúm gà”, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, 11(1): 81-86 Tô Long Thành (2004), “Bệnh cúm lồi chim”, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, 11(2): 53-58 Tiếng Anh Abdel-Ghafar AN, Chotpitayasunondh T, Gao Z, Hayden FG, Nguyen DH, et al, 2008, “Update on avian influenza A (H5N1) virus infection in humans”, N Engl J Med, 358, pp 261-73 Apisarnthanarak A, Kitphati R, Thongphubeth K, Patoomanunt P, et al, 2004, “Atypical avian influenza (H5N1)”, Emerg Infect Dis, 10, pp 1321- Baigent SJ, McCauley JW (2001), “Glycosylation of haemagglutinin and stalklength of neuraminidase combine to regulate the growth of avian influenza viruses in tissue culture” Virus Res, 79(1-2): 177-185 Beare AS and Webster RG (1991), “Replication of avian influenza viruses in humans”, Arch Virol., 119, pp 37-42 Beigel JH, Farrar J, Han AM, Hayden FG, Hyer R, de Jong MD, Lochindarat S, Nguyen TK, Nguyen TH, Tran TH, Nicoll A, Touch S, Yuen KY (2005), “Avian influenza A (H5N1) infection in humans”, N Engl J Med, 353, pp 1374- 85 10 Bloomberg News articles (2006), Two Bird Flu Gene Mutations Might Lead to Faster Human Spread, Published 11 Butler D (2006), “Alarms ring over bird flu mutations”, Nature, 439, pp 248-9 12 CDC (2009), Interim guidance on the planning for the use of surgical masks and respirators in health care settings during an influenza pandemic 68 13 Chan PK (2002), “Outbreak of avian influenza A (H5N1) virus infection in Hong Kong in 1997”, Clin Infect Dis, 34(suppl 2):S58- S64 14 Chen H, Smith GJ, Li KS, Wang J, Fan XH, et al (2006), “Establishment of multiple sublineages of H5N1 influenza virus in Asia: implications for pandemic control”, Proc Natl Acad Sci USA, 103, pp 2845- 50 15 Chen, H., G Deng, Z Li, G Tian, Y Li, and P Jiao (2004), “The evolution of H5N1 influenza viruses in ducks in southern China”, Proc Natl Acad Sci USA, 101: p 10452-10457 16 Chotpitayasunondh T, Ungchusak K, Hanshaoworakul W, et al (2005), “Human disease from influenza A (H5N1)” Emerg Infect Dis, 11, pp 201- 17 Conenello G, Zamarin D, Perrone L, Tumpey T and Palese P (2007), “A Single Mutation in the PB1-F2 of H5N1 (HK/97) and 1918 Influenza A Viruses Contributes to Increased Virulence”, PLoS Pathog, 3(10), pp 1414-21 18 De Jong MD, Bach VC, Phan TQ, Vo MH, Tran TT, Nguyen BH, Beld M, Le TP, Truong HK, Nguyen VV, Tran TH, Do QH, Farrar J (2005), “Fatal avian influenza A (H5N1) in a child presenting with diarrhea followed by coma”, N Engl J Med, 352, pp 686-91 19 De Jong MD, Simmons CP, Thanh TT, Hien VM, Smith GJ, Chau TN, Hoang DM, Chau NV, Khanh TH, Dong VC, Qui PT, Cam BV, Ha DQ, Guan Y, Peiris JS, Chinh NT, Hien TT, Farrar J (2006), “Fatal outcome of human influenza A (H5N1) is associated with high viral load and hypercytokinemia”, Nat Med, 12, pp 1203- 07 20 De Jong MD, Tran TT, Truong HK, Vo MH, Smith GJ, Nguyen VC, Bach VC, Phan TQ, Do QH, Guan Y, Peiris JS, Tran TH, Farrar J (2005), “Oseltamivir resistance during treatment of influenza A (H5N1) infection”, N Engl J Med, 353, pp 2667-72 21 Drake J W (1993), “Rate of spontaneous mutation among RNA viruses”, Proc Natl Acad Sci U S A, 90(9): 4171-4175 22 Duan L, Bahl J, Smith G, et al (2008), “The development and genetic diversity of H5N1 influenza virus in China, 1996-2006”, Virology, 380, pp 243-54 23 Gambaryan A, Tuzikov A, Pazynina G, et al (2006), “Evolution of the receptor binding phenotype of influenza A (H5) viruses”, Virology; 344:432-438 69 24 Greninger A (2004), The Definition and Measurement of Dangerous Research 25 Guan Y, et al (2004), “H5N1 influenza: A protean pandemic threat”, PNAS, 101(21), pp 8156-61 26 Guan Y, et al (2002), “Emergence of multiple genotypes of H5N1 avian influenza viruses in Hong Kong SAR”, Proc Natl Acad Sci USA, 99, pp 8950–5 27 Hamada S., Suzuki Y., Suzuki T., et al (2006), “Haemagglutinin mutations responsible for the binding of H5N1 influenza A virus to human-type receptors”, Nature, 444(7117), pp.378-82 28 Harder T C and Werner O (2006), “Avian Influenza”, Influenza, Report 2006 29 Hatta M., et al (2007), Growth of H5N1 Influenza A Viruses in the Upper Respiratory Tracts of Mice, PLoS Pathog 30 Hoa, L.T., D.D Khang, P.V Chi, N.V Hai, T.N Hai, N.T.B Nga, and L.T Binh (2006), “Molecular characterization of the H5 gene for the highly pathogenic A/H5N1 strains isolated in Vietnam during 2004 – 2006”, Proceedings of International Workshop on Biotechnology in Agriculture, p 68-71 31 Hui DS (2008), “Review of clinical symptoms and spectrum in humans with influenza A/H5N1 infection”, Respirology, 13(suppl 1):S10-S13 32 International Committee on Taxonomy of Viruses Index of Viruses (2009), Orthomyxoviridae, In: ICTVdB - The Universal Virus Database, version B#chen-Osmond, C (Ed), Columbia University, New York, USA 33 Julkunen I, Pyhala R, Hovi T, 1985, Enzyme immunoassay, complement fixation and hemagglutination inhibition tests in the diagnosis of influenza A and B virus infections”, Purified hemagglutinin in subtype-specific diagnosis, J Vir.Methods 10, 75-84 34 Kandun IN, Wibisono H, Sedyaningsih ER, Yusharmen, Hadisoedarsuno W, et al (2006), “Three Indonesian clusters of H5N1 virus infection in 2005” N Engl J Med, 355, pp 2186-94 70 35 Katz JM, Lim W, et al (1999), “Antibody response in individuals infected with avian influenza A (H5N1) viruses and detection of anti-H5 antibody among household and social contacts”, J Infect Dis, 180, pp 1763-70 36 Lamb RA and Krug RM (2001), “Orthomyxoviridae: The Viruses and Their Replication”, Fields Virology, 4th Edition, (D.M Knipe and P.M Howley, eds), pp 1487-1531 37 Lamb RA (1989), Genes and proteins of the influenza viruses In: Krug R M, editor The influenza viruses 1st ed New York, N.Y: Plenum Press 38 Le, Q., M Kiso, K Someya, Y Sakai, T Nguyen, K Nguyen, N Pham, H Nguyen, S Yamada, Y Muramoto, T Horimoto, A Takada, H Goto, T Suzuki, Y Suzuki, and Y Kawaoka (2005), “Avian flu: isolation of drugresistant H5N1 virus” Nature, 437(7062): p 1108 39 Lee C W., Suarez D., Tumpey T., et al (2005), “Characterization of Highly Pathogenic H5N1 Avian Influenza A Viruses Isolated from South Korea”, Journal of Virology, 79(6), pp 3692-3702 40 Luong, G and P Palese (1992), “Genetic analysis of influenza virus”, Curr Opinion Gen Develop, 2: p 77-81 41 Ng EK, Cheng PK, Ng AY, Hoang TL, and Lim WW (2005), “Influenza A H5N1 detection”, Emerg Infect Dis., 11, pp 1303-5 42 Rowe T, Abernathy RA, Hu-Primmer J, et al (1999), Detection of Antibody to Avian Influenza A (H5N1) Virus in Human Serum by Using a Combination of Serologic Assays, J Clin Microbiol, 37(4), pp 937- 43 43 Sastre A (2006), Antiviral Response in Pandemic Influenza Viruse, CDC, vol 12 number 44 Senne, DA, Panigrahy, B, Kawaoka, Y, Pearson, JE, Suss, J, Lipkind, M, Kida, H and Webster, RG (1996), “Survey of the hemagglutinin (HA) cleavage site sequence of H5 and H7 avian influenza viruses: amino acid sequence at the HA cleavage site as a marker of pathogenicity potential”, Avian Diseases, 40: 425-437 71 45 Swayne DE and Halverson DA (2007), Diseases of Poultry: Influenza, 12th edn Ames, IA: Blackwell Publishing Professional 46 Takano R, Nidom CA, Kiso M, Muramoto Y, Yamada S, Sakai-Tagawa Y, Macken C, Kawaoka Y (2009), “Phylogenetic characterization of H5N1 avian influenza viruses isolated in Indonesia from 2003-2007”, Virology, 390, pp 13-21 47 Tran TH, Nguyen TL, Nguyen TD, Luong TS, Pham PM, et al (2004), “Avian influenza A (H5N1) in 10 patients in Vietnam”, N Engl J Med, 350, pp 1179-88 48 Uiprasertkul, M., R Kitphati, P Puthavathana, R Kriwong, A Kongchanagul, K Ungchusak, S Angkasekwinai, K Chokephaibulkit, K Srisook, N Vanprapar, and P Auewarakul (2007), “Apoptosis and pathogenesis of avian influenza A (H5N1) virus in humans”, Emerg Infect Dis, 13(5): p 708-712 49 WHO inter-country-consultation, influenza A/H5N1 in humans in Asia: Manila, Philippines, 6-7 May 2005 50 World Health Organization (2009), Continuing progress towards a unified nomenclature system for the highly pathogenic H5N1 avian influenza viruses 51 Xu C, Dong L, Xin L, Lan Y, Chen Y, Yang L, Shu Y (2009), “Human avian influenza A (H5N1) virus infection in China”, Science, 52, pp 407–11 52 Yamada S, Suzuki Y, Suzuki T, Le MQ, Nidom CA, Sakai-Tagawa Y, Muramoto Y, Ito M, Kiso M, Horimoto T, Shinya K, Sawada T, Kiso M, Usui T, Murata T, Lin Y, Hay A, Haire LF, Stevens DJ, Russell RJ, Gamblin SJ, Skehel JJ, Kawaoka Y (2006), “Haemagglutinin mutations responsible for the binding of H5N1 influenza A viruses human-type receptors”, Nature, 444(7117): 378-382 72 ... chúng tơi thực ? ?Nghiên cứu xây dựng quy trình phát nhanh virus cúm gia cầm A/ H5N1 mẫu bệnh phẩm kỹ thuật Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction? ?? Labo Trường Đại học Y Thái Bình... QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - TRẦN THỊ TÌNH NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN NHANH VIRUS CÚM GIA CẦM A/ H5N1 TRONG MẪU BỆNH PHẨM BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX REVERSE. .. cúm A/ H5N1, chúng tơi sử dụng trình tự gen M, HA NA virus cúm gia cầm công bố Ngân hàng gen (GenBank) - Để nghiên cứu tối ưu h? ?a phản ứng multiplex RT-PCR phát cúm A/ H5N1, sử dụng RNA virus cúm