Ứng dụng real time pcr khảo sát đột biến jak2v617f để chẩn đoán bệnh đa hồng cầu nguyên phát tại cần thơ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH BỘ Y TẾ NGUYỄN PHÚC ĐỨC ỨNG DỤNG REAL-TIME PCR KHẢO SÁT ĐỘT BIẾN JAK2V617F ĐỂ CHẨN ĐOÁN BỆNH ĐA HỒNG CẦU NGUYÊN PHÁT TẠI CẦN THƠ Ngành: Kỹ thuật xét nghiệm y học Mã số: 8720601 LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Y HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS LÊ HUY HÒA PGS.TS PHAN THỊ XINH THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2018 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu kết hoàn toàn trung thực chưa công bố công trình nghiên cứu khác Tác giả luận văn NGUYỄN PHÚC ĐỨC ii LỜI CẢM ƠN Trong trình thực hồn thành luận văn tơi nhận nhiều quan tâm, động viên giúp đỡ tận tình từ thầy cơ, gia đình, bạn bè Nhân đây, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến: TS Lê Huy Hòa - hội viên Hội nghiên cứu Ung thư lâm sàng Hoa Kỳ (ASCO), cố vấn Đơn vị Hóa trị ung thưBệnh viện Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh; PGS.TS Phan Thị Xinh - Trưởng khoa Di truyền học - Phân tử, Bệnh viện Truyền Máu Huyết Học TP Hồ Chí Minh, giảng viên Bộ môn Huyết học, khoa Y, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh thầy, trực tiếp hướng dẫn, bảo tận tình, tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn Ban Giám hiệu toàn thể cán Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh, đặc biệt PGS.TS Vũ Quang Huy - Trưởng Bộ môn Xét nghiệm, Khoa Điều dưỡng - Kỹ thuật y học, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh; ThS Nguyễn Tuấn Anh - giảng viên Bộ môn Xét nghiệm, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh, tạo điều kiện để tơi lĩnh hội kiến thức q giá ngành kỹ thuật xét nghiệm y học thời gian học tập, nghiên cứu trường Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Bệnh viện Huyết học Truyền máu Cần Thơ, Bệnh viện Đại học Y Dược Cần Thơ hỗ trợ, tạo điều kiện thuận lợi để tơi thu thập mẫu thơng tin bệnh nhân; Tôi xin gửi lời cảm ơn Khoa Di Truyền Học Phân Tử - bệnh viện Truyền Máu Huyết Học TP Hồ Chí Minh giúp đỡ tơi hồn thành luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến bệnh nhân tham nghiên cứu này; xin cảm ơn gia đình, bạn bè động viên, giúp đỡ tơi hồn thành luận văn Xin chân thành cảm ơn! TP Hồ Chí Minh, ngày tháng Học viên NGUYỄN PHÚC ĐỨC năm 2018 iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH viii ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Rối loạn tăng sinh tủy 1.2 Đa hồng cầu nguyên phát 1.2.1 Định nghĩa 1.2.2 Dịch tễ 1.2.3 Sinh bệnh học 1.2.4 Lâm sàng 1.2.5 Cận lâm sàng 1.2.6 Chẩn đoán 1.2.7 Điều trị 1.2.8 Diễn tiến tiên lượng 1.3 Janus kinase (Jaks) 10 1.3.1 Janus kinase (JAK2) 11 1.3.2 Đột biến JAK2V617F 12 1.3.3 Đột biến JAK2 exon 12 15 1.4 Các phương pháp khảo sát đột biến JAK2V617F 15 1.4.1 Đại cương phản ứng chuỗi polymerase 15 1.4.2 Real-time PCR 19 1.4.3 Allele-Specific Oligonucleotide PCR (ASO PCR) 23 iv 1.4.4 Phương pháp đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn (Restriction Fragment Length Polymorphisms: RFLP) 25 1.4.5 Phương pháp giải trình tự nucleotide 26 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.1 Đối tượng nghiên cứu 29 2.1.1 Dân số nghiên cứu 29 2.1.2 Tiêu chuẩn chọn mẫu 29 2.1.3 Tiêu chuẩn loại trừ 30 2.1.4 Địa điểm nghiên cứu 30 2.2 Phương pháp nghiên cứu 30 2.3 Đạo đức nghiên cứu 31 2.4 Phương pháp tiến hành 31 2.4.1 Phương tiện nghiên cứu 31 2.4.2 Nội dung nghiên cứu 33 CHƯƠNG KẾT QUẢ 38 3.1 Tối ưu hoá phản ứng real-time PCR khảo sát đột biến JAK2V617F 38 3.1.1 Khảo sát khả hoạt động mồi 38 3.1.2 Khảo sát khả hoạt động đoạn dò 39 3.1.3 Tối ưu nồng độ mồi F1, R1 41 3.1.4 Tối ưu nồng độ đoạn dò P1, P2 42 3.1.5 Thử nghiệm khảo sát nhiệt độ lai 43 3.1.6 Thử nghiệm bổ sung nồng độ MgCl2 45 3.1.7 Thử nghiệm xác định cut-off phản ứng 46 3.2 Xây dựng cơng thức tính số đột biến JAK2V617F 48 3.3 Phân tích mẫu lâm sàng để so sánh khả phát đột biến JAK2V617F phương pháp ASO PCR real-time PCR 50 CHƯƠNG BÀN LUẬN 53 v 4.1 Tối ưu hóa phản ứng real-time PCR để khảo sát đột biến JAK2V617F 53 4.2 Xây dựng đường chuẩn định lượng số lượng đột biến JAK2V617F 58 4.3 So sánh khả phát đột biến JAK2V617F phương pháp realtime PCR phương pháp ASO PCR 60 KẾT LUẬN 63 KIẾN NGHỊ 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ADN: Acid deoxyribonucleic ARN: Acid ribonucleic Ct: Cycle threshold (Chu kỳ ngưỡng) ĐHCNP: Đa hồng cầu nguyên phát dNTPs: Desoxynucleotide triphosphate EPO-R: Erythropoietin receptor (Thụ thể erythropoietin) EPO: Erythropoietin JAK: Janus kinase PCR: Polymerase chains reation (Phản ứng chuỗi polymerase) Ph: Nhiễm sắc thể Philadelphia RLTST: Rối loạn tăng sinh tuỷ RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphisms (Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn) SNP: Single nucleotide polymorphism (điểm đa hình nucleotide) STAT: Signal transducer and activator of transcription protein (Protein chuyển đổi tín hiệu kích hoạt phiên mã) Ta: Annealing temperatures (nhiệt độ lai hóa) TTCNP: Tăng tiểu cầu nguyên phát WHO: World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới) XTNP: Xơ tủy nguyên phát vii DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1 Tổng hợp số thông tin JAK2V617F 13 Bảng 2.1 Thông tin mồi đoạn dò 32 Bảng 2.2 Dãy nồng độ pha loãng nồng độ ADN amplicon JAK2V617F dung dịch điệm TE 36 Bảng 3.1 Kết thử nghiệm hoạt động đoạn dò 40 Bảng 3.2 Kết Ct tối ưu nồng độ mồi 41 Bảng 3.3 Kết Ct tối ưu nồng độ đoạn dò 43 Bảng 3.4 Kết Ct tối ưu nhiệt độ lai 44 Bảng 3.5 Kết Ct tối ưu nồng độ MgCl2 bổ sung 46 Bảng 3.6 Kết real-time PCR ASO PCR 50 Bảng 3.7 Kết ASO PCR real-time PCR 33 mẫu bệnh nhân 52 viii DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1 Sơ đồ cấu trúc Janus kinase 10 Hình 1.2 Sơ đồ đường truyền tín hiệu JAK/STAT 12 Hình 1.3 Cấu trúc chế hoạt hố JAK2 bình thường đột biến 14 Hình 1.4 Tỷ lệ đột biến bệnh nhân RLTST có NST Ph âm tính 15 Hình 1.5 Bốn pha phản ứng PCR 20 Hình 1.6 Hoạt động đoạn dò TaqMan 22 Hình 1.7 Kết ASO PCR khảo sát đột biến JAK2V617F 24 Hình 1.8 RFLP-PCR khảo sát đột biến JAK2V617F 26 Hình 1.9 Kết giải trình tự gen c.1849G"T (JAK2V617F) đột biến exon 14 gen JAK2 28 Hình 3.1 Kết điện di sản phẩm PCR 38 Hình 3.2 Kết giải trình tự mẫu JK.99 mẫu JK.05 39 Hình 3.3 Tối ưu nồng độ MgCl2 bổ sung thêm, mẫu JK.99, màu HEX 46 Hình 3.4 Kết thử nghiệm real-time PCR xác định cut-off 47 Hình 3.5 Kết real-time PCR thử nghiệm dựng đường chuẩn 49 ĐẶT VẤN ĐỀ Rối loạn tăng sinh tuỷ bệnh lý tế bào gốc tạo máu đặc tình trạng tăng sinh nhiều dòng tế bào máu Rối loạn tăng sinh tuỷ (RLTST) thường gắn với trưởng thành bình thường tế bào máu tạo máu hiệu RLTST chia thành nhóm lớn: nhóm nhiễm sắc thể Philadelphia dương tính (bệnh bạch cầu mạn dịng tuỷ) nhóm nhiễm sắc thể Philadelphia âm tính (bệnh đa hồng cầu nguyên phát, tăng tiểu cầu nguyên phát xơ tuỷ nguyên phát) [51] Đa hồng cầu nguyên phát (ĐHCNP) rối loạn tăng sinh tuỷ mạn tính đặc trưng tăng q mức dịng hồng cầu, thường kèm theo tăng bạch cầu, tiểu cầu lách to Bệnh nhân khơng có triệu chứng, phát bệnh tình cờ Mệt mỏi, nhức đầu, chóng mặt, rối loạn thị giác triệu chứng thường gặp Về triệu chứng thực thể thường gặp da niêm đỏ, tăng huyết áp, gan to, lách to, xuất huyết tiêu hoá đặc biệt huyết khối gây 30 - 40% trường hợp tử vong bệnh nhân ĐHCNP [51] Theo nghiên cứu công bố năm 2014 Châu Âu tỷ lệ mắc ĐHCNP 0,49/100.000 49,88/100.000 tỷ suất mắc hàng năm 0,01/100.000 - 2,61/100.000 [12] Năm 2005, đột biến JAK2V617F lần đ ầu tiên đư ợc mô tả nhóm nghiên cứu khác [14], [28], [34], [39] tiêu chuẩn chẩn đoán quan trọng ĐHCNP vùng Janus kinase (JAK2) JAK2 tyrosine kinase quan trọng đường truyền tín hiệu JAK/STAT chịu trách nhiệm truyền tín hiệu cho thụ thể erythropoietin (EPO-R) Đột biến JAK2V617F gặp 95% bệnh nhân ĐHCNP, 60% bệnh nhân tăng tiểu cầu nguyên phát xơ tuỷ nguyên phát [49] Năm 2008 WHO cập nhật tiêu chuẩn chẩn đoán ĐHCNP với số điểm đáng ý hemoglobin >18,5 g/dL nam; >16,5 g/dL nữ đặc biệt xuất tiêu chuẩn đột biến JAK2V617F JAK2 có chức Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn ... cứu: ? ?Ứng dụng real- time PCR khảo sát đột biến JAK2V617F để chẩn đoán đa hồng cầu nguyên phát Cần Thơ? ?? CÂU HỎI NGHIÊN CỨU Có khác biệt khả phát đột biến JAK2V617F kỹ thuật ASO PCR real- time PCR. .. PCR [41] Real- time PCR sử dụng đoạn dò TaqMan để khảo sát đột biến JAK2V617F phát triển với độ nhạy phân tích 0,01-0,05% [24], [35], nhiên kỹ thuật chưa ứng dụng để khảo sát đột biến JAK2V617F. .. mẫu lâm sàng để so sánh khả phát đột biến JAK2V617F phương pháp ASO PCR real- time PCR 50 CHƯƠNG BÀN LUẬN 53 v 4.1 Tối ưu hóa phản ứng real- time PCR để khảo sát đột biến JAK2V617F 53