BÁO cáo (dược PHÂN TÍCH) định lượng melamine trong sữa bằng phương pháp HPLC

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CHĂN NUÔI – THÚ Y ĐỊNH LƯỢNG MELAMINE TRONG SỮA BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC GVHD: DANH SÁCH NHÓM: Tháng I Đặt vấn đề: Gần việc tìm thấy Melamine, chất có hại cho súc khỏe có sữa sản phẩm sữa nhu bánh, kẹo… gây nhiều lo lắng cho người dân nhà quản lý an toàn vệ sinh thực phẩm, loại thực phẩm phổ biến nhiều người sử dụng, trẻ em kiểm soát hàm lượng Melamine sữa sản phẩm từ sữa việc cần thiết để bảo vệ sức khỏe người dân Việc thêm Melamine vào sữa Trung Quốc thời gian gần với mục đích tăng “đạm “ gây ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khỏe người tiêu dùng Theo thông xã Pháp Beijing, gần 13.000 trẻ em nhập viện Trung Quốc sau uống sữa có chứa Melanine, có 104 trẻ em bệnh nặng có trẻ em bị tử vong Gần đây, việc nhập lượng sữa nguyên liệu sữa từ Trung Quốc nước khác vào tiêu thụ thị trường Việt Nam gây nhiều bất an cho người dân cho quan chức an toàn vệ sinh thực phẩm Melamine có tìm thấy cá loại sữa sản phẩm sữa tiêu thụ nước ta không ? vấn đề thật cần quan tâm Vì việc kiểm tra, giám sát Melamine nhiễm sữa sản phẩm sữa điều cần thiết phải thực nhằm bào vệ sức khỏe người tiêu dùng II Đối tượng phương pháp nghiên cứu: Đối tượng: Khảo sát hàm lượng Melanin mẫu sữa TP HCM Phương pháp nghiên cứu: 2.1 Tính chất lí hố Melanin: Melamine chất bột màu trắng, khối lượng riêng 1,57; theo tiếng đức melamine có nguồn gốc từ melam ( sản phẩm dẫn xuất sau chưng cất amoni thiocyanate) amin độ hịa tan nước khơng cao (3,1g/1 lit nước 20 0C), có khả giải phóng N gặp nhiệt độ cao sử dụng làm chất chống cháy Melamine có cơng thức C3H6N6 , hàm lượng N chiếm 66% phân tử: gấp 1,5 lần lượng N có ure 1,3,5-triazine-2,4,6-triamine tạo thành phân tử cyanamide Bột Melamine thị trường 2.2 Ứng dụng Melamin phản ứng với formaldehit tạo thành keo melamin Melamin sử dụng ngành cơng nghiệp phân bón Khi trộn lẫn với số nhựa, chúng tạo thành hỗn hợp có khả chống cháy cháy chúng giải phóng lượng khí nitơ 2.3 Ảnh hưởng Melanin tới sức khoẻ Những nghiên cứu trước cho melamine có độc tính thấp kết hợp  Gây độc cấp tính Số liệu thí nghiệm chuột cho thấy liều gây chết 50% chuột thí nghiệm (LD50) 3.000mg /kg khối lượng thể melamine đưa vào theo đường miệng LD50 thỏ làm thí nghiệm kích thích da lớn 100mg/kg Melamine gây kích thích da lớn 1000mg /kg Melamine gây kích thích cho da mắt Một nhóm nhà khoa học Liên Xô cũ cho muối tạo thành từ Melamine acid cyanuric (muối sử dụng chống cháy) có độc tính mạnh hai chất riêng rẽ Nếu đưa muối melamine trực tiếp vào dày chuột, LD50 4,1g/kg cho chuột, LD50 3,5g/kg Các số liệu tương ứng chuột nhắt 7,7g /kg 3,4g/kg Mèo ăn thức ăn chứa melamine có biểu hư thận  Gây độc mãn tính Nếu ăn thực phẩm chứa melamine dẫn đến tổn thương đường tiêu hóa, sỏi bàng quang, sỏi thận ung thư bàng quang Melamine tìm thấy mơ thận mèo chó cho ăn thức ăn chứa melamine Sự lắng đọng tinh thể muối melamine có khả gây bệnh tích thận heo cá tương tự acid uric gây sỏi thận người Thí nghiệm chó ăn thứ ăn chứa 3% melamine năm dẫn đến giảm tỉ lệ thành phần định tăng trưởng, tăng tiết nước tiểu, hình thành tinh thể melamine nước tiểu, tiểu máu Tinh thể melamine khó tan, di chuyển chậm đường tiết niệu (từ thận xuống nệu đạo) nên có khả gây triệu chứng độc cấp tính Trường hợp phẩn ứng với chất dẻo melamine formaldehyde người xảy với phụ nữ 28 tuổi công nhân chế biến gỗ Phụ nữ xác định khơng có phản ứng dị ứng với formaldehyde Các triệu chứng quan sát vết eczecma mu bàn tay cổ tay Các nghiên cứu cho thấy phản ứng dị ứng gặp (so với phản ứng với formaldehyde Quy định sử dụng melamine Ngày 12/12/2008, tổ chức nông lương thới (FAO), tổ chức y tế giới (WHO), Bộ y tế Việt Nam thông báo chung mức giới hạn melamine nhiễm chéo thực phẩm: Trong thực phẩm cho trẻ em 36 tháng tuổi không 1mg/kg thực phẩm (<=1ppm) Các loại thực phẩm khác không vượt 2,5mg/kg thực phẩm (<=2,5ppm) Lượng ăn vào ngày chịu đựng melamine WHO thiết lập 0,2mg/kg trọng lượng thể Theo ngưỡng này, người nặng 50kg ăn 10mg melamine/ngày không bị ảnh hưởng đến sức khỏe Ngày 28/11/2008, Bộ nông nghiệp phát triển nông thôn định việc quản lý melamine chăn ni ni trồng thủy sản Theo ngưỡng melamine chấp nhận có thức ăn chăn nuôi 2,5mg/kg; vượt ngưỡng bị cấm nhập khẩu, sản xuất kinh doanh sử dụng ngành chăn nuôi, nuôi III Nội dung phương pháp nghiên cứu 1.Dụng cụ hóa chất: 1.1  Dụng cụ: Cân phân tích AUW220D ( 0,01 mg) hãng Shimadzu, Nhật Bản    Máy sắc ký lỏng hiệu cao Series 20A hãng Shimadzu, Nhật Bản Đầu dò UV, cột C18 ( 150mm x 3.2mm ID, kích thước hạt µm) Các thiết bị khác như, tủ sấy, máy lắc, máy cất nước hai lần, thiết bị lọc nước siêu  Các dụng cụ thủy tinh bình định mức loại, pipet vạch pipet bầu loại, cốc   mỏ Micropipet loại (0,5-10 L, 10-100 mL, 100-1000 mL,…) Syranh lọc mẫu; bình định mức loại, cốc có mỏ loại 1.2.Hệ thống sắc kí lỏng hiệu cao Hình: Hệ thống máy sắc ký lỏng cao áp HPLC a Bình chứa pha động : Máy HPLC thường có đường dung môi vào đầu bơm cao áp cho phép sử dụng bình chứa dung mơi lần để rửa giải theo tỉ lệ mong muốn tổng tỉ lệ đường 100% Tuy nhiên, theo kinh nghiệm, sử dụng đường dung môi lúc mà thường sử dụng đường hệ pha động pha trộn đồng hơn, hệ pha động đơn giản giúp ổn định trình rửa giải Lưu ý: Tất dung môi dùng cho HPLC phải dung môi tinh khiết sử dùng cho HPLC Tất hóa chất dùng để chuẩn bị mẫu pha hệ đệm phải hóa chất tích khiết dùng cho phân tích Việc sử dụng hóa chất tinh khiết nhằm tránh hỏng cột sắc ký hay nhiễu đường nền, tạo nên peak tạp q trình phân tích b Bộ khử khí Degases: Mục đích sử dụng khử khí nhằm lọai trừ bọt nhỏ cịn sót lại dung môi pha động, tránh xảy số tượng có sau: Tỷ lệ pha động đường dung môi không làm cho thời gian lưu peak thay đổi Trong trường hợp bọt q nhiều, khử khí khơng thể lọai trừ hết bơm cao áp khơng hút dung mơi, ảnh hưởng đến áp suất hoạt động hệ thống HPLC Trong trường hợp dẫn đến sai kết phân tích c Bơm cao áp Mục đích để bơm pha động vào cột thực trình chia tách sắc ký Bơm phải tạt áp suất cao khỏang 250-600bar tạo dòng liên tục Lưu lượng bơm từ 0.1 đến 10ml/phút d Bộ phận tiêm mẫu Để đưa mẫu vào cột phân tích theo với thể tích bơm thay đồi Có cách đưa mẫu vào cột: tiêm mẫu thủ công tiêm mẫu tự động (autosample) e Sắc ký Cột chứa pha tĩnh coi trái tim của hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao Cột pha tĩnh thông thường làm thép không rỉ, chiều dài cột thay đổi từ 5-25cm đường kính 1-10mm, hạt nhồi cỡ 0.3-5µm,… Chất nhồi cột phụ thuộc vào lọai cột kiểu sắc ký f Đầu dò  Là phận phát chất chúng khỏi cột cho tín hiệu ghi sắc ký đồ để định tính định lượng Tùy theo tính chất chất phân tích mà người ta lựa chọn lọai đầu dị phù hợp Tín hiệu đầu dị thu là: độ hấp thụ quang, cường độ phát xạ, cường độ điện thế, độ dẫn điện, độ dẫn nhiệt, chiết suất,… Trên sở đó, người ta sản xuất lọai đầu dò sau: - Đầu dò quang phổ tử ngọai 190-360nm để phát UV - Đầu dò quang phổ tử ngoại khả kiến (UV-VIS) (190-900nm) để phát chất hấp thụ quang Đây lọai đầu dị thơng dụng - Đầu dị hùynh quang (RF) để phát chất hữu chứa huỳnh quang tự nhiên dẫn suất có huỳnh quang - Đầu dị DAD (Detector Diod Array) có khả quét chồng phổ để định tính chất theo độ hấp thụ cực đại chất - Đầu dò khúc xạ (chiết suất vi sai) thường dùng loại đường - Đầu dị điện hóa: đo dịng, cực phổ, độ dẫn - Đầu dò đo độ dẫn nhiệt, hiệu ứng nhiệt,… g Bộ phận ghi nhận tín hiệu Bộ phận ghi tín hiệu đầu dị phát Đối với hệ thống HPLC đại, phần phần mềm hệ thống ghi nhận, lưu thông số, sắc ký đồ, thông số liên quan đến peak tính đối xứng, hệ số phân giải,… đồng thời tính tóan, xử lý thơng số liên quan đến kết phân tich h In liệu Sau phân tích xong, liệu in qua máy in kết nối với máy tính có cài phần mềm điều khiển 1.3.Hóa chất: Tất hóa chất loại tinh khiết phân tích Chuẩn Melamine ( Dr Ehrenstorfer GmbH) Pyridine Dung dịch N,O-bis (trimethylsilyl) trifluoacetamide (BSTFA) với 1% trimethylchlorosilane (TMCS) Acetonitril tinh khiết HPLC Nước cất lần 2,6 diamino-4-chlropyrimidine (DACP) 1.4.Dung dịch chuẩn - Dung mơi: mơi 50% methanol ( thể tích) chuẩn bị bàng cách pha thể tích methanol nước - Cân xác 100mg melamine vào bình định mức 100ml, hịa tan với Methanol 50% cách rung bể rung siêu âm 30 phút Lên thể tích 100ml thu dung dịch có nồng độ melamine 1000µgmL-1) Pha lỗng 5mL melamine (1000µgmL-1) 50ml 50% methanol để nồng độ melamine 100µgmL-1 Pha lỗng tiếp 5ml methanol 100µgmL-1 50ml methanol 50% để nồng độ melamine 10µgmL-1 1.5 Chuẩn bị mẫu Cho 10ml (mẫu dạng lỏng) 1g (mẫu khô) vào bình định mức 100ml Mẫu pha với 10ml dung dịch melamine 1000µgmL -1, pha lỗng với 50ml dung dịch methanol 50% rung siêu âm 30 phút Sau làm lạnh nhiệt độ phòng, lên thể tích 100ml dung dịch methanol 50% thu dung dịch hỗn hợp với nồng độ melamine 100µgmL-1 Cho dung dịch mẫu thu vào ống ly tâm ly tâm ( ≥ 3200rpm) lấy phần dung dịch phía ống (5ml) chuyển sang bình định mức 50ml, lên thể tích 50ml dung dịch methanol 50% Mẫu lọc qua lọc 0.45µm (màng Nylon) Nghiên cứu dịch lọc lọc hấp thụ melamine mức sau: 22% cho ml ban đầu), 10% (2ml), 0,999) quan sát thấy mẫu khác nhau, nồng độ từ 10% đến 400% Phương pháp cho hiệu suất thu hồi 97,2-101,2% khoảng nồng độ 5-40 µgmL -1 Trong ngày ngày tính lặp lại 1,0% R.S.D LOD LOQ 0.1 mLmin-1 0,2 mLmin-1, tương ứng Phương pháp phân tích cung cấp độ nhạy cảm tuyệt vời, khả tái lặp, xác cao VI Tài liệu tham khảo Bài giảng: PGS.TS Dương Thanh Liêm, Bộ môn Dinh dưỡng, Khoa Chăn nuôi Thú y Trường Đại học Nông Lâm, Tp HCM Gopalakrishnan Venkatasami, John R Sowa Jr ∗ Department of Chemistry and Biochemistry, Seton Hall University, 400 South Orange Ave., South Orange, NJ 07079, USA Angelika Gratzfeld-Hüsgen and Rainer Schuster: HPLC for Food Analysis ... II Đối tượng phương pháp nghiên cứu: Đối tượng: Khảo sát hàm lượng Melanin mẫu sữa TP HCM Phương pháp nghiên cứu: 2.1 Tính chất lí hố Melanin: Melamine chất bột màu trắng, khối lượng riêng 1,57;... giới hạn định lượng (LOQ) LOD xác định 0,1 µgmL-1 LOQ xác định 0,2 µgmL-1 Giá trị % R.S.D nghiên cứu xác mức độ LOQ khoảng 5% Khảo sát độ xác Độ xác phương pháp đánh giá nồng độ bốn mức độ melamine. .. phản ánh trung bình cộng sáu lần phân tích nồng độ báo cáo bảng Bảng 1: Kết phục hồi melamine trung bình lần phân tích nồng độ khác Melamine Độ xác đo độ ổn định tính lặp lại mẫu Việc sử dụng