Xác định tỉ lệ nhiễm vi khuẩn mrsa (methicillin resistant staphylococcus aureus) ở lợn nuôi tại tỉnh bắc ninh

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGÔ THỊ THỦY XÁC ĐỊNH TỶ LỆ NHIỄM VI KHUẨN MRSA (METHICILLIN RESISTANT STAPHYLOCOCCUS AUREUS) Ở LỢN NUÔI TẠI TỈNH BẮC NINH Ngành: Thú y Mã số: 8640101 Người hướng dẫn khoa học: TS Đặng Thị Thanh Sơn PGS.TS Huỳnh Thị Mỹ Lệ NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan, số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa sử dụng để bảo vệ học vị Tôi xin cam đoan rằng, giúp đỡ cho việc thực luận văn cảm ơn thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Tác giả luận văn Ngô Thị Thuỷ i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn, tơi nhận hướng dẫn, bảo tận tình thầy cô giáo, giúp đỡ, động viên bạn bè, đồng nghiệp, gia đình Để hồn thành luận văn tốt nghiệp, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới TS Đặng Thị Thanh Sơn, Bộ môn Vệ sinh Thú y, Viện Thú y PGS.TS Huỳnh Thị Mỹ Lệ, môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm, Học viện Nông nghiệp Việt Nam ln tận tình hướng dẫn, dành nhiều cơng sức, thời gian tạo điều kiện cho suốt q trình học tập thực đề tài Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm, Khoa Thú y - Học viện Nơng nghiệp Việt Nam tận tình giúp đỡ tơi q trình học tập, thực đề tài hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện thú y, tập thể cán nhân viên công tác Bộ môn Vệ sinh thú y - Viện thú y giúp đỡ tạo điều kiện cho suốt trình thực đề tài Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ mặt, động viên khuyến khích tơi hồn thành luận văn Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Tác giả luận văn Ngô Thị Thuỷ ii MỤC LỤC Lời cam đoan I Lời cảm ơn II Mục lục III Danh mục chữ viết tắt V Danh mục bảng VI Danh mục hình, sơ đồ VII Trích yếu luận văn VIII Thesis abstract X Phần Mở đầu 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Hiểu biết chung vi khuẩn Staphylococcus aureus 2.1.1 Giới thiêụ chung 2.1.2 Đặc điểm hình thái, cấu trúc 2.1.3 Tính chất ni cấy 2.1.4 Các yếu tố độc lực 2.1.5 Đặc tính gây bệnh 2.2 Hiểu biết chung vi khuẩn Methicillin resisstant Staphylococcus aureus (MRSA) 10 2.3 Tính kháng kháng sinh vi khuẩn 11 2.3.1 Thuốc kháng sinh 11 2.3.2 Hiện tượng kháng thuốc 14 2.3.3 Sự kháng thuố c Staphylococcus aureus 18 2.3.4 Sự kháng thuốc Staphylococus aureus kháng Methicillin 19 2.3.5 Tình hình đề kháng kháng sinh Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus kháng Methicillin giới Việt Nam 20 2.3.6 Phương pháp xác định độ mẫn cảm vi khuẩn gây bệnh số thuốc kháng sinh 23 Phần Nội dung phƣơng pháp nghiên cứu 25 3.1 Thời gian nghiên cứu 25 iii 3.2 Địa điểm nghiên cứu 25 3.3 Nguyên vật liệu, đối tượng sử dụng nghiên cứu 25 3.3.1 Đối tượng, vật liệu 25 3.3.2 Môi trường hoá chất 25 3.3.3 Trang thiết bị, dụng cụ phịng thí nghiệm 27 3.4 Nội dung phương pháp nghiên cứu 27 3.4.1 Nội dung 27 3.4.2 Phương pháp nghiên cứu 27 Phần Kết thảo luận 34 4.1 Kết điều tra tình hình sử dụng kháng sinh cho lợn Bắc Ninh 34 4.2 Kết phân lập vi khuẩn Staphylococcus aureus vi khuẩn Staphylococcus aureus kháng Methicillin 39 4.2.1 Kết phân lập vi khuẩn Staphylococcus aureus 39 4.2.2 Kết phân lập vi khuẩn Staphylococcus aureus kháng Methicillin 42 4.3 Kết kiểm tra khả mẫn cảm kháng sinh vi khuẩn Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus kháng Methicillin 44 4.3.1 Kết kiểm tra khả mẫn cảm kháng sinh vi khuẩn Staphylococcus aureus 44 4.3.2 Kết kiểm tra khả mẫn cảm kháng sinh vi khuẩn Staphylococcus aureus kháng Methicillin 46 Phần Kết kiến nghị 50 5.1 Kết luận 50 5.1.1 Kết điều tra tình hình sử dụng kháng sinh cho lợn Bắc Ninh 50 5.1.2 Kết phân lập vi khuẩn S aureus MRSA 50 5.1.3 Kết kiểm tra khả mẫn cảm S aureus MRSA 50 5.2 Kiến nghị 50 Tài liệu tham khảo 52 Phụ lục 56 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt BHI Brain Heart Infuction BP Baird Parker G- vi khuẩn gram - G+ vi khuẩn gram + LTA Lypoteichoid acid MRSA Methicillin resistant Staphylococcus aureus MSA Manitol salt agar PBP Penicillin bindingprotein PBW Pepton Buffer Water PCR Polymerase Chain Reaction PGN Peptidoglycan S.aureus Staphylococcus aureus SCCmec Staphylococcus cassette chromosome mec SEB Staphylococcal enterotoxin B TE Teichoid acid VRSA Vancomycin resistant Staphylococus aureus v DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Trình tự đoạn mồi sử dụng Multiplex - PCR 26 Bảng 3.2 Bảng đánh giá đường kính vịng vơ khuẩn số kháng sinh dùng nghiên cứu 32 Bảng 4.1 Kết tỷ lệ sử dụng thuốc kháng sinh điều trị bệnh cho lợn 34 Bảng 4.2 Các loại kháng sinh sử dụng thời gian điều tra 35 Bảng 4.3 Sự tuân thủ theo hướng dẫn sử dụng kháng sinh cho đàn lợn 36 Bảng 4.4 Kết phân lập S aureus môi trường thạch Baird Parker 39 Bảng 4.5 Kết kiểm tra đặc tính sinh học số chủng Staphylococcus spp phân lập 40 Bảng 4.6 Kết phân lập MRSA môi trường Chromagar MRSA 42 Bảng 4.7 Kết kiểm tra MRSA kỹ thuật Multiplex PCR 42 Bảng 4.8 Kết kiểm tra khả mẫn cảm kháng sinh chủng S aureus phân lập Bắc Ninh 44 Bảng 4.9 Kết kiểm tra khả mẫn cảm kháng sinh chủng MRSA phân lập Bắc Ninh 47 vi DANH MỤC HÌNH, SƠ ĐỒ Hình 2.1 Staphylococcus aureus kính hiển vi điện tử 20,000x Sơ đồ 3.1 Phân lập Staphylococcus aureus 29 Sơ đồ 3.2 Quy trình phân lập Staphylococcus aureus kháng Methicillin 31 Sơ đồ 3.3 Quy trình thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh 32 Hình 4.1 Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Staphylococcus aureus hộ chăn nuôi Bắc Ninh 40 Hình 4.2 Kết kiểm tra phản ứng multiplex PCR số chủng MRSA phân lập tỉnh Bắc Ninh 43 Hình 4.3 Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn MRSA hộ chăn nuôi Bắc Ninh 43 Hình 4.4 Kết kiểm tra khả mẫn cảm chủng S aureus phân lập Bắc Ninh 45 Hình 4.5 Kết kiểm tra khả mẫn cảm chủng MRSA phân lập Bắc Ninh 47 vii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Ngơ Thị Thuỷ Tên luận văn: Xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn MRSA (Methicillin Resistant Staphylococcus aureus) lợn nuôi tỉnh Bắc Ninh Chuyên ngành: Thú y Cơ sở đào tạo: Học viện Nơng nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu - Đánh giá thực trạng ô nhiễm vi khuẩn Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus kháng Methicillin lợn Bắc Ninh - Từng bước xây dựng hệ thống liệu kháng kháng sinh vi khuẩn S aureus MRSA theo tiêu chuẩn quốc tế kiểm soát vi khuẩn kháng thuốc Việt Nam Phƣơng pháp nghiên cứu - Khảo sát trạng sử dụng thuốc kháng sinh cho lợn theo sổ ghi chép nhật kí sử dụng kháng sinh hộ chăn ni lợn - Phương pháp lấy mẫu theo QCVN 01-83:2011/BNNPTNT - Phương pháp phân lập vi khuẩn Staphylococcus aureus theo tiêu chuẩn 6888-1:1999 - Phương pháp phân lập vi khuẩn Staphylococcus aureus kháng Methicillin nuôi cấ y cho ̣n lo ̣c môi trường đă ̣c hiê ̣u CHROMagar MRSA và kiể m tra xác nhâ ̣n vi khuẩ n bẳ ng kỹ thuật Multiplex PCR - Phương pháp kiểm tra tính mẫn cảm với kháng sinh chủng Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus kháng Methicillin theo phương pháp khoanh giấy kháng sinh Kirby - Bauer - Phương pháp xử lí số liệu phần mềm Microsoft excel Kết nghiên cứu Kết điều tra tình hình sử dụng kháng sinh cho lợn Bắc Ninh - Kết cho thấy 110 hộ khảo sát thời gian điều tra có 85 hộ chiếm 77.3% có lợn bị ốm số có 77 hộ chiếm 70% sử dụng thuốc kháng sinh để điều trị cho lợn ốm - 54,6% hộ chăn nuôi lợn điều tra sử dụng phối hợp nhiều loại kháng sinh để điều trị bệnh cho lợn, kháng sinh đơn sử dụng 53.6% hộ chăn nuôi viii dùng liều theo hướng dẫn nhà sản xuất, bên cạnh có 44.3% dùng tăng so với hướng dẫn chủ yếu tăng từ - lần (86.04%) Trong hộ mua thuốc kháng sinh sử dụng có tới 51.5% hộ khơng sử dụng hết lượng thuốc mua Kết phân lập vi khuẩn S aureus MRSA Vi khuẩn S aureus phát 11 tổng số 82 mẫu thu thập được, chiếm tỷ lệ 13,41% Vi khuẩn MRSA phát 5/82 mẫu, chiếm 6.1% Kết kiểm tra khả mẫn cảm S aureus MRSA Vi khuẩn S aureus phân lập mẫn cảm hoàn toàn (100%) với loại kháng sinh, bao gồm: Linezolid, Rifampin, Fusidic acid Tuy vậy, S aureus kháng với loại kháng sinh có tới loại kháng tuyệt đối (100%) bao gồm: Penicillin G, Erythromycin, Clindamycin Kanamycin loại kháng với tỷ lệ cao Norfoxacin (54,55%), Tetracyclin (81,82%) Trimethoprim - Sulfamethoxazole (72,73%) Vi khuẩn MRSA phân lập mẫn cảm hoàn toàn (100%) với kháng sinh: Linezolide, Rifampin Fusidic acid MRSA kháng tuyệt đối với: Penicillin, Erythromycin, Clindamycin Kanamycin Với kháng sinh cịn lại tỷ lệ kháng cao: Norflorxacin kháng 60%,Trimethoprim-Sulfamethoxazole kháng 60% với Tetracyclin tỷ lệ kháng lên đến 80% ix Kết cho thấy vi khuẩn MRSA mẫn cảm hoàn toàn với kháng sinh: Linezolide, Rifampin Fusidic acid MRSA kháng hoàn toàn với số kháng sinh: Penicillin, Erythromycin, Clindamycin Kanamycin.Với kháng sinh cịn lại tỷ lệ kháng cao: Norflorxacin kháng 60%, Trimethoprim-Sulfamethoxazole kháng 60% với Tetracyclin tỷ lệ kháng lên đến 80% Có nhiều nguyên nhân dẫn đến tượng kháng kháng sinh vi khuẩn MRSA Thực tế, phòng điều trị bệnh cho vật nuôi chủ hộ chăn ni thường làm theo kinh nghiệm mình, liệu trình sử dụng chăn ni khơng có lúc chưa hết liệu trình dừng lại có lúc kèo dài so với hướng dẫn nhà sản xuất Do tâm lí phần người chăn ni hàng sản xuất nước khơng có chất lượng tốt thuốc nhập tâm lí hàm lượng thành phần hoạt chất sản phẩm không đạt đủ nhãn mác công bố, thêm vào nhiều mua thuốc với quy cách lớn lượng ni nhỏ, lấy thuốc theo cảm tính ước lượng (g/kg thể trọng, ml/kg thể trọng) mà không theo hướng dẫn sử dụng dẫn đến việc tự ý dùng tăng liều lượng so với khuyến cáo lên nhiều lần Tại số địa phương, chủ hộ lạm dụng việc sử dụng kháng sinh phòng bệnh cho vật nuôi, bổ sung vào thức ăn chăn nuôi cho mục đích kích thích tăng trưởng, có mặt thường xun nhiều loại kháng sinh lúc bổ sung vào thức ăn nguyên nhân xảy tượng vi khuẩn quen với thuốc, tổng hợp gen kháng lại loại thuốc Tỷ lệ kháng kháng sinh vi khuẩn MRSA với Penicillin 79,3%; Kanamycin 69,7%; Clindamycin 77,2%; Erythromycin 82,6%; Trimethprime Sulfamethoxazole 70,3%; Rifampine 12,4% Fusidic acid 7,6% (Phan Nữ Đài Trang cs., 2016) So sánh kết nghiên cứu chúng tơi thấy nhìn chung với kháng sinh sử dụng chăn nuôi Penicillin, Kanamycin, Clindamycin Erythromycin kháng MRSA có tỷ lệ cao so với thuốc sử dụng điều trị bệnh người Với kháng sinh Rifampine Fusidic acid chưa sử dụng chăn ni nên tỷ lệ kháng thuốc chưa có người sử dụng loại thuốc điều trị xuất tỷ lệ kháng Tuy kháng sinh Trimethoprim - 48 Sulfamethoxazone tỷ lệ kháng MRSA người cao vi khuẩn MRSA phân lập lợn nuôi Một lần câu hỏi đặt liệu có liên quan việc lây lan kháng kháng sinh động vật người Điều nguy hiểm việc sử dụng thuốc kháng sinh chăn ni cịn chưa quản lí chặt chẽ, người chăn ni dễ dàng mua thuốc kháng sinh sử dụng mà không cần kê đơn, bắt bệnh Việc cần phải thay đổi, cần tay quan quyền kết hợp nâng cao nhận thức cho người chăn nuôi việc sử dụng thuốc kháng sinh cho hiệu an tồn Trước thực trạng có nhiều loại kháng sinh khơng cịn tác dụng điều trị với vi khuẩn MRSA, cần phải thực thử tính mẫn cảm kháng sinh vi khuẩn trước lựa chọn loại kháng sinh mẫn cảm phù hợp để điều trị bệnh cho vật nuôi để giảm thiểu thiệt hại/ gây tốn dùng kháng sinh không mẫn cảm Cần giám sát chặt chẽ việc mua bán sử dụng kháng, tăng cường tập huấn, tuyên truyền để người dân thay điều bị gia súc ốm kinh nghiệm, phác đồ có sẵn để lựa chọn kháng sinh điều trị để giảm thiểu khả kháng thuốc vi khuẩn 49 PHẦN KẾT QUẢ VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN 5.1.1 Kết điều tra tình hình sử dụng kháng sinh cho lợn Bắc Ninh - Kết cho thấy 110 hộ khảo sát thời gian điều tra có 85 hộ chiếm 77.3% có lợn bị ốm số có 77 hộ chiếm 70% sử dụng thuốc kháng sinh để điều trị cho lợn ốm - 54,6% hộ chăn nuôi lợn điều tra sử dụng phối hợp nhiều loại kháng sinh để điều trị bệnh cho lợn, kháng sinh đơn sử dụng 53.6% hộ chăn ni dùng liều theo hướng dẫn nhà sản xuất, bên cạnh có 44.3% dùng tăng so với hướng dẫn chủ yếu tăng từ - lần (86.04%) Trong hộ mua thuốc kháng sinh sử dụng có tới 51.5% hộ khơng sử dụng hết lượng thuốc mua 5.1.2 Kết phân lập vi khuẩn S aureus MRSA Vi khuẩn S aureus phát 11 tổng số 82 mẫu thu thập được, chiếm tỷ lệ 13,41% Vi khuẩn MRSA phát 5/82 mẫu, chiếm 6.1% 5.1.3 Kết kiểm tra khả mẫn cảm S aureus MRSA Vi khuẩn S aureus phân lập mẫn cảm hoàn toàn (100%) với loại kháng sinh, bao gồm: Linezolid, Rifampin, Fusidic acid Tuy vậy, S aureus kháng với loại kháng sinh có tới loại kháng tuyệt đối (100%) bao gồm: Penicillin G, Erythromycin, Clindamycin Kanamycin loại kháng với tỷ lệ cao Norfoxacin (54,55%), Tetracyclin (81,82%) Trimethoprim Sulfamethoxazole (72,73%) Vi khuẩn MRSA phân lập mẫn cảm hoàn toàn (100%) với kháng sinh: Linezolide, Rifampin Fusidic acid MRSA kháng tuyệt đối với: Penicillin, Erythromycin, Clindamycin Kanamycin Với kháng sinh cịn lại tỷ lệ kháng cao: Norflorxacin kháng 60%,TrimethoprimSulfamethoxazole kháng 60% với Tetracyclin tỷ lệ kháng lên đến 80% 5.2 KIẾN NGHỊ Cần tăng cường hướng dẫn, tập huấn cho người chăn nuôi hiểu rõ mức độ nguy hiểm việc kháng kháng sinh để dẫn đến hạn chế điều trị bệnh 50 theo kinh nghiệm, nên xác định độ mẫn cảm mầm bệnh với kháng sinh sử dụng địa bàn để sử dụng thuốc kháng sinh cho hiệu Cần giám sát chặt chẽ việc mua, bán sử dụng thuốc kháng sinh điều trị bệnh cho vật nuôi bổ sung vào thức ăn chăn nuôi, không sử dụng kháng sinh cấm, không rõ nguồn gốc, sử dụng đúng, đủ liệu trình thuốc tránh lãng phí, gây nhiễm môi trường chăn nuôi Cần thực nghiên cứu sâu S aureus MRSA xác định tỉ lệ nhiễm, tỷ lệ kháng kháng sinh vi khuẩn mối liên hệ chúng với tỷ lệ nhiễm kháng kháng sinh người đặc biệt người trực tiếp chăn nuôi lợn 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu tiếng Việt: Bùi Thị Tho (2003) Thuốc kháng sinh nguyên tắc sử dụng chăn nuôi thú y NXB Nông nghiệp, Hà Nội Dương Thị Toan Nguyễn Văn Lưu (2015) Tình hình sử dụng kháng sinh chăn nuôi lợn thịt, gà thịt số trại chăn nuôi địa bàn tỉnh Bắc Giang Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam(5).tr.717 Euge'nie Bergogne-Berezin and Pierre Dellamonica (2004) Kháng sinh trị liệu thực hành lâm sàng Eugénie Bergogne-Bérézin and Pierre Dellamonica (2004) Kháng sinh trị liệu thực hành lâm sàng Nhà xuất Y học, Hà Nội Susceptible Staphylococcus aureus in a Patient during Antibiotic Therapy, PLoS ONE 5(7): e11841 Kiều Khắc Đôn Nguyễn Lệ Phi (1999) Giáo trình Vi sinh học, Trường đại học Dược Hà Nội Nguyễn Đỗ Phúc (2013) Staphylococcus aureus Nguyễn Minh Trí (2000) Khảo sát nồng độ ức chế tối thiểu kháng sinh thường dùng loại vi khuẩn gây nhiễm trùng cộng đồng bệnh viên Chợ Rẫy , Luận văn thạc sĩ y học, Ðại học Y dược TP HCM Nguyễn Như Thanh, Nguyễn Bá Hiên Trần Thị Lan Hương (1997) Giáo trình vi sinh vật thú y NXB Nơng nghiệp, Hà Nội Nguyễn Vĩnh Phước (1978) Giáo trình bệnh truyền nhiễm gia súc NXB Nông nghiệp, Hà Nội 10 Nguyễn Xuân Thành, Vũ Hoàn, Nguyễn Thị Minh Hoàng Hải (2005) Giáo trình thực tập vi sinh vật NXB Nông nghiệp, Hà Nội 11 Phan Nữ Đài Trang, Vũ Lê Ngọc Lan, Uông Nguyễn Đức Ninh Cao Hữu Nghĩa (2016) Khảo sát tỉ lệ kháng kháng sinh gen quy định độc tố exfoliative toxins chủng Staphylococcus aureus phân lập Viện Pasteur TP HCM Tạp chí Phát triển Khoa học Cơng nghệ 19(3T).tr 15-23 12 Văn Tần (2005) Những tiến nhiễm khuẩn ngoại khoa Bệnh viện Bình Dân (2000-2004) Tạp chí Y học Thực hành Hội thảo khoa học chống nhiễm khuẩn tháng 8(2005).tr 71-81 52 13 Vũ Thị Kim Cương (2007) Khảo sát tình hình kháng kháng sinh vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện bệnh viện Thống Nhất từ 15/10/2004 đến 30/6/2005, Luận văn thạc sĩ y học, Đại học Y dược TP.HCM II Tài liệu tiếng Anh: 14 Aj D.N., M.V.D Broek, E Spalburg, M.V.S Verheuvel, W.D Deisz, H Boshuizen, A.V.D Giessen, E V Duijkeren and X.W Huijsdens (2007) High prevalence of methicillin resistant Staphylococcus aureus in pigs Veterinary microbiology 122(3-4): 366-372 15 Ám S., P.S Andersen, A Kearns, B Pichon, M Holmes, G Edwards, F Laurent, C Teale, R Skov and A.R Larsen (2012) Rapid detection, differentiation and typing of methicillin‐resistant Staphylococcus aureus harbouring either mecA or the new mecA homologue mecALGA251 Clinical Microbiology and Infection 18(4): 395-400 16 Andreas V., F.Loeffen, J.Bakker, C.Klaassen and M Wulf (2005) Methicillin-resistant Staphylococcus aureus in pig farming Emerging infectious diseases 11(12): 1965 17 Annalisa P., S Andrea and M Monaco (2007) Mechanisms of antibiotic resistance in Staphylococcus aureus 18 Berger-Bächi B (1999) Genetic basis of methicillin resistance in Staphylococcus aureus Cellular and Molecular Life Sciences CMLS 56(9-10): 764-770 19 Chambers H F (2001) Methicillin-resistant Staphylococcus aureus Mechanisms of resistance and implications for treatment Postgrad Med 109(2 Suppl): 43-50 20 Chambers H.F (2001) Methicillin-resistant Staphylococcus aureus Mechanisms of resistance and implications for treatment Postgraduate medicine 109(2 Suppl): 43-50 21 Christiane C., L Franziska, S Birgit and W Wolfgang (2011) Rare occurrence of methicillin-resistant Staphylococcus aureus CC130 with a novel mecA homologue in humans in Germany PloS one 6(9): e24360 22 Collins C.H (1995) Page 110 in Collins and Lyne's Microbiological Methods, Butterworth-Heinemann, UK 23 Deurenberg R.H., V Cornelis, C Driessen, B Michèle, L Nancy, J Etienne and E E Stobberingh (2004) Rapid detection of Panton-Valentine leukocidin from clinical isolates of Staphylococcus aureus strains by real-time PCR FEMS microbiology letters 240(2): 225-228 53 24 Duarte C O and H.D Lencastre (2002) Multiplex PCR strategy for rapid identification of structural types and variants of the mec element in methicillin-resistant Staphylococcus aureus Antimicrobial agents and chemotherapy 46(7).pp 2155-2161 25 En Iso (1999) 6888-1 (1999): Microbiology of food and animal feeding stuffs Horizontal method for the enumeration of coagulase-positive staphylococci (Staphylococcus aureus and other species) Part 1: Technique using Baird-Parker agar medium International Organization for Standardization, Geneva 26 Enright M C., D A Robinson, G Randle, E J Feil, H Grundmann and B G Spratt (2002) The evolutionary history of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) Proc Natl Acad Sci U S A 99(11): 7687-7692 27 Franklin D L (2003) Antimicrobial resistance: the example of Staphylococcus aureus The Journal of clinical investigation 111(9): 1265-1273 28 Harmsen D., H Claus, W Witte, J Rothgänger, H Claus, D Turnwald and U Vogel (2003) Typing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in a university hospital setting by using novel software for spa repeat determination and database management Journal of clinical microbiology 41(12): 5442-5448 29 Jennifer D B , J.A Hindler, H.S Gold and B Limbago (2014) Rationale for eliminating Staphylococcus breakpoints for β-lactam agents other than penicillin, oxacillin or cefoxitin, and ceftaroline Clinical infectious diseases 58(9): 1287-1296 30 Jensen S O and B R Lyon (2009) Genetics of antimicrobial resistance in Staphylococcus aureus Future Microbiol 4(5).pp 565-582 31 Kenneth T (2005) Todar’s online textbook of bacteriology University of Wisconsin-Madison Department of Bacteriology 32 Khanna T., R Friendship, C Dewey and J Weese (2008) Methicillin resistant Staphylococcus aureus colonization in pigs and pig farmers Veterinary microbiology 128(3-4): 298-303 33 Lowy F D (2003) Antimicrobial resistance: the example of Staphylococcus aureus J Clin Invest 111(9): 1265-1273 34 Luca G., M Stegger and S Robert (2007) Retrospective detection of methicillin resistant and susceptible Staphylococcus aureus ST398 in Danish slaughter pigs Veterinary microbiology 122(3-4): 384-386 35 Mark C E., D A Robinson, G Randle, E.J Feil, H Grundmann and B.G Spratt (2002) The evolutionary history of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) Proceedings of the National Academy of Sciences 99(11): 7687-7692 54 36 Mary K S and L M John (2002) Virulence and recovery of Staphylococcus aureus relevant to the food industry using improvements on traditional approaches Food Control 15(1): 5-10 37 Muhannad F A K (2007) Jawetz, Melnick & Adelberg’s Medical Microbiology 24th Edition Sultan Qaboos University Medical Journal [SQUMJ] 7(3): 273-275 38 Normanno G., A Firinu, S Virgilio, G Mula, A Dambrosio, A Poggiu, L Decastelli, R Mioni, S Scuota and G Bolzoni (2005) Coagulase-positive Staphylococci and Staphylococcus aureus in food products marketed in Italy International journal of food microbiology 98(1): 73-79 39 Pantosti A., A Sanchini and M Monaco (2007) Mechanisms of antibiotic resistance in Staphylococcus aureus Future Microbiol 2(3): 323-334 40 Rijen M V., P V Keulen and J Kluytmans (2007) Increase of pig-and calf-related Mrsa in a Dutch hospital: P1591 Clinical Microbiology & Infection 13: S446-S447 41 Sahebnasagh R., H Saderi and P Owlia (2011) Detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains from clinical samples in Tehran by detection of the mecA and nuc genes The First Iranian International Congress of Medical Bacteriology 42 Schenck L P., M G Surette and D M Bowdish (2016) Composition and immunological significance of the upper respiratory tract microbiota FEBS Lett 590(21): 3705-3720 43 Uwe Wollina (2017) Microbiome in atopic dermatitis Clinical, cosmetic and investigational dermatology 10: 51 44 Weese J S., M Archambault, B Willey, H Dick, P Hearn, B Kreiswirth, B Said-Salim, A Mcgeer, Y Likhoshvay and J.F Prescott (2005) Methicillinresistant Staphylococcus aureus in horses and horse personnel, 2000-2002 Emerging infectious diseases 11(3).pp 430 45 Edine W Tiemersma, Stef Lam Bronzwaer, Outi Lyytikäinen, John E Degener, Paul Schrijnemakers, Nienke Bruinsma, Jos Monen, Wolfgang Witte, Hajo Grundmann and European Antimicrobial Resistance Surveillance System Participants (2004) "Methicillin-resistant Staphylococcus aureus in Europe, 1999-2002." Emerging infectious diseases 10(9): 1627 55 PHỤ LỤC LỊCH TRÌNH SỬ DỤNG KHÁNG SINH CHO LỢN (Nhật kí chăn ni dùng để thu thập thông tin đàn lợn tham gia nghiên cứu VIDA-PIG) Ngày bắt đầu theo dõi: [ / _/ _] Tổng đàn lợn: Số lợn nái: Số lợn con: Số lợn thịt: Người chăn ni cập nhật thơng tin ngày tuần Nhưng chúng tơi khuyến khích người chăn ni tổng hợp thơng tin tuần vào ngày thứ hai tuần Nghĩa tuần thứ hai kết thúc hết ngày chủ nhật Sổ thiết kế để theo dõi đàn lợn vòng tuần Nếu anh/chị cần thêm sổ, vui lòng liên hệ nhân viên thú y dự án để hỗ trợ Thông tin thu thập hữu ích việc đánh giá hiệu việc chăn nuôi trang trại dùng để so sánh với trại khác tham gia nghiên cứu Các thông tin cần lưu trữ bao gồm: Thông tin loại vắc xin sử dụng q trình phịng bệnh cho đàn lợn Các thông tin bệnh, triệu chứng, tỉ lệ bệnh, chết … Thông tin việc sử dụng kháng sinh phịng điều trị bệnh cho đàn lợn Thơng tin loại thuốc khác chất bổ trợ sử dụng q trình chăn ni lợn Các anh/ chị vui lịng ghi riêng biệt thơng tin của:  Thuốc kháng sinh loại thuốc khác Các anh chị hỏi người bán thuốc bác sỹ thú y để ghi nhận xác  Thức ăn công nghiệp loại thức ăn bổ sung khác Số lợn bệnh chết: Anh chị vui lịng đánh dấu vào có dấu hiệu bệnh Và ghi số lượng lợn bị bệnh, lợn bị chết bị bệnh lợn chết đột ngột Ngày lợn bị bệnh Số lợn bệnh Số lợn chết bệnh Số lợn chết đột ngột (khơng có dấu hiệu bệnh) Dấu hiệu bệnh ( đánh nhiều cột có nhiều loại bệnh khác nhau) Ho Tiêu Nôn Bỏ Dấu hiệu chảy ăn khác Miêu tả dấu hiệu khác có: Thuốc kháng sinh: Anh/chị vui lịng ghi lại thơng tin thuốc kháng sinh dùng để phòng trị bệnh tuần Anh/chị vui lòng hỏi rõ người bán thuốc thú 56 y thuốc thuốc kháng sinh giá loại thuốc Tên Hàm thuốc kháng lƣơ ̣ng sinh (mỗi (ghi loại thuốc ghi dòng) bao bi)̀ Số thuốc mua (vd: bịch/1 lọ) Liều lƣợng thuốc sử dụng/ lầ n Trọng lƣơ ̣ng lơ ̣n đƣơ ̣c điề u tri ̣ Số lầ n sƣ̉ dụng/ ngày Số ngày sử dụng Số thuốc sử dụng (vd: nửa gói) Từ: / đến: / Các thuốc khác chất bổ trợ: Anh/chị vui lịng ghi lại thơng tin thuốc khác tất các chất dùng để phòng trị bệnh cho lợn tuần Tên thuốc khác/chất bổ trợ/thức ăn công nghiệp (mỗi loại thuốc ghi dịng) Hàm lƣơ ̣ng (ghi bao bì) Số thuốc mua (vd: bịch/1 lọ) Liều lƣợng thuốc sử dụng/ lầ n Trọng lƣơ ̣ng lơ ̣n đƣơ ̣c điề u tri ̣ Số lầ n sƣ̉ dụng/ ngày Sử dụng thuốc ngày Từ: / Đến 57 Số thuốc sử dụng (vd: nửa gói) PHỤ LỤC GIÁM ĐỊNH ĐẶC TÍNH SINH HỐ VI KHUẨN STAPHYLOCOCUS AUREUS Phản ứng catalase Dùng que cấy lấy khuẩn lạc từ môi trường thạch đặt lên điểm phiến kính Nhỏ giọt dung dịch H2O3 Phản ứng dương tính thấy có tượng sủi bọt sau vài giây Phản ứng âm tính khơng có tượng sủi bọt Phản ứng đơng vón huyết tƣơng Phản ứng đơng vón huyết tương ống nghiệm: lấy 0,5ml huyết tương thỏ cho vào ống nghiệm, cấy khuẩn lạc nghi ngờ vào ống để vào tủ ấm 37 0C Phản ứng dương tính xuất sau 2h đến 18h, huyết tương đơng vón hồn toàn dạng bán cố thể Lên men đƣờng manitol - Chuẩn bị môi trường Pha canh thang pepton theo hướng dẫn Chuẩn bị thị màu: nghiền fuchsin, hoà vào nước cho tan hết, cho từ từ dung dịch NaOH 1N, vừa cho vừa lắc đến chuyển màu từ đỏ tươi sang đỏ nâu, đến vàng úa, vàng thẫm dừng (thường từ 12ml đến 17ml) Để lắng 1h đến 2h, lọc qua giấy lọc Hấp 1200C 15 phút Cho 1ml thị màu Andrate vào 100ml môi trường canh thang peptone, chia ống (mỗi ống 4ml) Hấp 1200C 30 phút Chuẩn bị đường: loại đường pha thành dung dịch10% hấp 1100C 15 phút đến 20 phút lọc qua màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,45µm Cho đường vào ống môi trường: ống 4ml cho 0,3ml dung dịch đường 10% - Phương pháp kiểm tra đọc kết Cấy vi khuẩn nuôi cấy khiết vào ống canh thang peptone có đường, để tủ ấm 370C sau 24h đọc hết Phản ứng âm tính: mơi trường khơng thay đổi màu Phản ứng dương tính: mơi trường chuyển màu đỏ 58 CÁCH PHA CHẾ MỘT SỐ MƠI TRƢỜNG Chuẩn bị mơi trƣờng Baird - Parker Hồ tan 58.0 g mơi trường (BK 055) 950ml nước cất Đun sôi từ từ, khuấy liên tục đến tan hoàn toàn Cho vào lọ 95ml/lọ Tiệt trùng nồi hấp 1210C 15 phút Làm lạnh trì 44 - 470C Bằng kĩ thuật vô trùng thêm 5ml Egg Yolk Tellurite Enrichment (BS060) flash Trộn nhanh triệt để Đổ vào đĩa petri vô trùng Làm khô đĩa tủ ấm vô trùng Chuẩn bị thạch CHROMagar - Chuẩn bị mơi trường Hồ tan chậm 82,5g bột khô CHROMagar MRSA base 1L nước cất Khuấy cho đêns agar nở Gia nhiệt đun sơi 1000C Làm nguội đến 45-500C Xốy khuấy nhẹ - Chuẩn bị Supplement Pha chất bổ sung CHROMagar MRSA Supplement với 20ml nước cất vô trùng Lắc nhẹ, thêm 1ml chất bổ sung CHROMagar MRSA Supplement vào môi trường CHROMagar MRSA chuẩn bị - Đổ đĩa Đổ đĩa thạch để môi trường nhiệt độ phịng 20 phút Để mơi trường đơng lại khô Chuẩn bị đĩa thạch Mueller - Hinton Pha 36g thạch Mueller - Hinton vào lít nước lắc cho tan hết Đun sơi để hồ tan hoàn toàn thạch Hấp tiệt trùng 1210C/15 phút, để nguội môi trường đến 500C Đổ đĩa thạch (15 - 20ml/đĩa) 59 PHỤ LỤC Một số hình ảnh thực nghiên cứu Hình Thu thập thơng tin sử dụng thuốc kháng sinh hộ chăn nuôi Hình Mẫu tăm bơng ngốy mũi lợn tăng sinh mơi trƣờng BPW 60 Hình Khuẩn lạc vi khuẩn S.aureus mơi trƣờng Baird Parker Hình Thử phản ứng Catalase S.aureus Hình Vi khuẩn S.aureus mơi trƣờng Mannitol Hình Kiểm tra kết nhuộm Gram vi khuẩn S.aureus kính hiển vi 61 Hình Khuẩn lạc MRSA mơi trƣờng Chrom agar Hình Chuẩn bị mẫu cho phản ứng PCR multiplex xác định vi khuẩn MRSA Hình Kết thử kháng sinh đồ đĩa thạch Muller - Hilton Hình 10 Thực đo đng kính vịng vơ khuẩn đĩa thạch Muller Hilton phịng thí nghiệm 62 ... chung chủ yếu bệnh vi? ??n dành ngành y tế Chính tơi tiến hành nghiên cứu để tài: ? ?Xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn MRSA (Methicillin Resistant Staphylococcus aureus) lợn nuôi tỉnh Bắc Ninh? ?? 1.2 MỤC TIÊU... khuẩn MRSA (Methicillin Resistant Staphylococcus aureus) lợn nuôi tỉnh Bắc Ninh Chuyên ngành: Thú y Cơ sở đào tạo: Học vi? ??n Nông nghiệp Vi? ??t Nam Mục đích nghiên cứu - Đánh giá thực trạng ô nhiễm vi. .. hộ chăn nuôi Bắc Ninh 40 Hình 4.2 Kết kiểm tra phản ứng multiplex PCR số chủng MRSA phân lập tỉnh Bắc Ninh 43 Hình 4.3 Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn MRSA hộ chăn ni Bắc Ninh