Xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella và một số đặc điểm của Salmonella trong thịt lợn tươi tại khu vực thành phố Thái Nguyên

Một trong những nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm là do vi sinh vật và các độc tố của chúng nhiễm trong thịt, trong đó có vi khuẩn Salmonella và độc tố đường ruột Enterotoxin là một tro

Tr-ờng đại học khoa học

đào thị thanh thủy

Xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn salmonella và một số đặc điểm của salmonella trong thịt lợn t-ơi tại khu vực thành phố thái nguyên

luận văn thạc sĩ công nghệ sinh học

thái nguyên – 2012

Tr-ờng đại học khoa học

đào thị thanh thủy

Xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn salmonella và một số đặc điểm của salmonella trong thịt lợn t-ơi tại khu vực thành phố thái nguyên

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Trong những năm gần đây vấn đề “Bảo đảm chất lượng và an toàn thực phẩm” đang là mối quan tâm đặc biệt ở nước ta và nhiều nơi trên thế giới Sự phát triển kinh tế mạnh mẽ, cùng với quá trình đô thị hoá ngày càng nhanh cũng như sự mở rộng giao lưu quốc tế đòi hỏi mỗi nước không những phải tăng số lượng sản phẩm mà còn phải đảm bảo chất lượng vệ sinh an toàn và giá trị dinh dưỡng của thực phẩm

Hiện nay ngộ độc thực phẩm đang là một vấn đề nghiêm trọng đối với sức khỏe con người Theo báo cáo của Bộ Y tế cho biết trong những năm gần đây vấn đề ngộ độc thực phẩm đã xảy ra khá phổ biến trên địa bàn cả nước, trong năm 2006 có 165 vụ ngộ độc thực phẩm với 7.000 người mắc và có 57 người tử vong

Thực tế hiện nay, thực phẩm có nguồn gốc từ động vật đặc biệt là thịt lợn bán ở một số chợ, cửa hàng lại không đảm bảo chất lượng (thịt bị nhiễm bụi bẩn, vi khuẩn do quá trình giết mổ, vận chuyển và bày bán ở chợ) Điều

đó cũng lý giải vì sao mà hàng năm có rất nhiều vụ ngộ độc thực phẩm xảy ra Một trong những nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm là do vi sinh vật

và các độc tố của chúng nhiễm trong thịt, trong đó có vi khuẩn Salmonella và

độc tố đường ruột Enterotoxin là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây ngộ độc thực phẩm

Khi đời sống của nhân dân ngày càng được nâng cao, vấn đề an toàn

thực phẩm trong đó có lợn và thịt lợn sạch bệnh, không bị nhiễm Salmonella

là một yêu cầu cấp thiết Có rất nhiều tác giả đã công bố rằng sự nhiễm

Salmonella vào thân thịt lợn trong quá trình giết mổ chủ yếu liên quan đến sự

nhiễm trùng Salmonella ở ruột [30], [32]

Theo Bryan (1988); Nielsen và Wegener (1997); Berends B.R., Van Knapen F., Mossel D.A.A., Burt S.A and Snij J.M.A (1998); Schwartz

(1999): Các đàn lợn bị nhiễm Salmonella không những gây thiệt hại kinh tế

cho người chăn nuôi mà còn là nguồn tàng trữ mầm bệnh gây hại đối với con người Bởi vậy mà mỗi biện pháp ngăn chặn có hiệu quả ở gia súc đều cần thiết và là điều kiện tiên quyết góp phần giảm thiểu dịch bệnh, tăng thu nhập cho người chăn nuôi, chống ô nhiễm môi trường và bảo vệ sức khoẻ cộng

đồng [31], [33], [35], [37]

Xuất phát từ những lí do trên và từ thực tế đời sống, chúng tôi đã tiến

hành thực hiện đề tài: “ Xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella và một

số đặc điểm của Salmonella trong thịt lợn tươi tại khu vực thành phố

Thái Nguyên ”

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella trên thịt lợn tươi

- Tìm hiểu một số đặc tính sinh hoá, đặc tính gây bệnh và serotype của

các chủng Salmonella phân lập được

3 Nội dung nghiên cứu

3.1 Khảo sát tình hình giết mổ và tiêu thụ thịt lợn trên địa bàn thành phố Thái Nguyên

3.2 Đánh giá tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella trên thịt lợn tươi:

- Lấy mẫu, phân lập vi khuẩn Salmonella

- Xác định chỉ tiêu tổng số vi khuẩn Salmonella trong thịt lợn tươi

- Biện pháp khống chế tình trạng thải trừ Salmonella trên thịt lợn, góp

phần bảo vệ sức khoẻ người tiêu dùng

3.3 Nghiên cứu đặc tính sinh học, hóa học:

- Nghiên cứu đặc tính sinh học, hóa học của vi khuẩn Salmonella phân

lập được

- Định type bằng kháng huyết thanh

3.4 Xác định độc tố đường ruột Enterotoxin:

- Xác định độc lực của chủng vi khuẩn Salmonella phân lập được

- Phân lập gen độc tố đường ruột Enterotoxin 3.5 Xác định tính mẫn cảm với một số loại kháng sinh và hóa dược của

các chủng vi khuẩn khuẩn Salmonella phân lập được

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM DO VI KHUẨN SALMONELLA

1.1.1 Ngộ độc thực phẩm

Ngộ độc thực phẩm (Intoxincation) hay còn gọi là trúng độc thức ăn do

ăn phải những thức ăn có chứa chất độc, thường xảy ra một cách đột ngột hàng loạt (nhưng không phải là các bệnh dịch do nhiễm khuẩn), có những triệu chứng của một bệnh cấp tính, biểu hiện bằng nôn mửa, ỉa chảy (trừ nhiễm độc tố của vi khuẩn độc thịt thì lại bị táo bón) và các triệu chứng khác đặc hiệu cho mỗi loại ngộ độc Trong đó có ngộ độc thực phẩm do nhiễm vi

khuẩn Salmonella

1.1.2 Ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn Salmonella

Vi khuẩn Salmonella sống trong phủ tạng của gia cầm, gia súc và vấy

nhiễm vào thịt khi giết mổ Chúng cũng có mặt ở phân và dễ dàng xâm nhập

vào trứng gia cầm qua những lỗ nhỏ li ti ở vỏ Salmonella là một trong những

thủ phạm chính gây ngộ độc thực phẩm vào mùa hè

Những thức ăn giàu chất dinh dưỡng như thịt, cá, trứng, sữa rất dễ bị

nhiễm Salmonella trong quá trình chế biến, bảo quản, vận chuyển nếu không

bảo đảm vệ sinh Các thống kê dịch tễ học cho thấy, các ca ngộ độc do thức

ăn nhiễm khuẩn Salmonella xảy ra lẻ tẻ quanh năm và tăng mạnh từ tháng 6

đến tháng 9 hằng năm Đây là lúc tiết trời nóng bức, vi khuẩn sinh sôi nảy nở rất nhanh, ruồi nhặng, gián cũng hoạt động mạnh; sức đề kháng của cơ thể lại giảm sút, rất dễ nhiễm bệnh

Thông thường, 12-24 giờ sau khi ăn phải thực phẩm nhiễm khuẩn (có khi nhanh hoặc chậm hơn), bệnh nhân thấy đau bụng, buồn nôn, nôn mửa, đi

ngoài phân lỏng, nhức đầu, nôn nao, khó chịu, ra mồ hôi, mặt tái nhợt, sốt 38 -400 C trong 2- 4 ngày (có trường hợp sốt lâu hơn)

Những trường hợp nhẹ có thể tự khỏi sau khi nôn hết thức ăn hoặc sau vài ba lần tiêu chảy, chỉ cần bù nước và chất điện giải Đối với những trường hợp nặng (nhất là với các em nhỏ, các cụ già), cần dùng thêm kháng sinh theo chỉ dẫn của thầy thuốc Do nôn nhiều, tiêu chảy nhiều, bệnh nhân bị mất nước, mất muối nghiêm trọng nên có thể thấy mệt, mắt trũng, chân tay lạnh, vật vã, li bì, mê sảng Khi đó, cần nhanh chóng chuyển đến bệnh viện để điều trị

1.1.3 Tình hình ngộ độc thực phẩm do Salmonella trên thế giới

Năm 2003 tại Bỉ có tới 12.849 trường hợp ngộ độc do vi khuẩn

Salmonella và 6.556 trường hợp nhiễm vi khuẩn Campylobacter và một số vi

khuẩn khác mà nguyên nhân chủ yếu là chế biến thực phẩm chưa kỹ trong đó thịt nhiễm bẩn chiếm tới 20% (Bộ Y tế, 2005) Ngày 1/1/2006 tại Allanta đã

xảy ra một đợt truyền nhiễm, vi khuẩn Salmonella có liên quan tới thực phẩm

đã làm ngã bệnh 172 người ở 18 tiểu bang, 11 người phải vào bệnh viện và

không có ai chết Đối tượng bị tình nghi nhiễm Salmonella gồm: rau diếp và

cà chua ở các tiệm ăn và siêu thị [13] Ngày 26/12/2007 Ban kiểm dịch và an toàn thực phẩm của Bộ Nông nghiệp Mỹ (FSIS) phát hiện vi khuẩn

Salmonella trong thịt bò tươi ở các cửa hàng và các kho chứa tại các siêu thị ở

Arinoza, California, Hawaii, Nevada và New Mexico Đã làm 38 trường hợp

bị mắc bệnh [15]

Ngày 9/7/2008 tại Mỹ đã có trên 1.000 người bị ngã bệnh vì vi khuẩn

Salmonella, được xem là con số lớn nhất từ 10 năm qua tại Hoa Kỳ vì ngộ

độc thực phẩm Thủ phạm chính bị nghi ngờ là cà chua, ớt đỏ và ngò tươi

Tốc độ nhiễm trung bình là 25-40 ca mỗi ngày, lan tràn trong 41 tiểu bang Tại Canada cũng có 4 trường hợp [13]

1.1.4 Tình hình ngộ độc thực phẩm do Salmonella ở Việt Nam

Ở Việt Nam vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm là một vấn đề đã và đang được Đảng và Nhà nước quan tâm Tuy nhiên, vấn đề này trên thực tế lại không hoàn toàn dễ dàng trong quá trình thực hiện Tình trạng ngộ độc đã xảy

ra ở hầu hết các địa phương, nguyên nhân ngộ độc rất đa dạng: ngộ độc do thức

ăn bị nhiễm vi khuẩn, do hoa quả phun thuốc trừ sâu, bánh phở có hàn the Nhưng nguyên nhân do vi sinh vật chiếm tỷ lệ cao từ 32,8-55,8 %, đặc biệt là

vi khuẩn Salmonella đã gây ra nhiều vụ ngộ độc thực phẩm

Ngộ độc thức ăn ở Việt Nam từ năm 1983 -1989, trong tổng số 269 vụ ngộ độc theo dõi, có 5756 người mắc, tử vong 156 (2,7%) mà nguyên nhân

chủ yếu là do Salmonella (Cục quản lý chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm, 2002) Vụ ngộ độc thực phẩm do ăn nem thính có nhiễm Salmonella ở Thái Bình Vụ ngộ độc thực phẩm do ăn hủ tiếu nhiễm Salmonella enteritidis

Ngày 16/5/2005 vụ ngộ độc kem Tràng Tiền làm 13 người gia đình chị Ngô Mai Lan phải vào viện Bạch Mai Nguyên nhân chính là do trong kem nhiễm

vi khuẩn Salmonella [15]

Ngày 9/5/2008 theo ông Trần Đáng - Cục trưởng Cục an toàn vệ sinh thực phẩm (Bộ Y tế) vừa thông báo qua kiểm tra 100 nhà hàng, quán ăn, cơ quan chức năng đã đóng cửa, tạm đình chỉ hoạt động 60 cơ sở vi phạm vệ sinh an toàn thực phẩm, trong đó có 23 quán thịt chó Qua xét nghiệm mẫu

thớt và mẫu dồi chó chín đã phát hiện vi khuẩn thương hàn (Salmonella) Có

vi khuẩn tả trong mẫu rau diếp cá và trong thớt ở một số nhà hàng trên phố Cầu Giấy, Trường Chinh Đã gây ra dịch tiêu chảy cấp tại địa bàn thành phố

Hà Nội

1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VI KHUẨN SALMONELLA TRÊN

THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM

1.2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới:

Năm 1885, Daniel E Salmon nhà bác học thú y ở Mỹ lần đầu tiên phát

hiện Salmonella từ ruột của một con lợn và đặt tên là Salmonella cholerae

suis Vi khuẩn Salmonella sau này mới được biết là nguyên nhân gây bệnh ở

người [38]

Năm 1933, Hội nghị các nhà vi sinh vật học quốc tế chính thức đặt tên

cho vi khuẩn là Salmonella Vào năm 1934, hai nhà khoa học đã thiết lập

bảng cấu trúc kháng nguyên đầu tiên đặt tên là bảng phân loại Kauffmann -

White Từ đó đến nay bảng cấu trúc kháng nguyên của Salmonella luôn được

bổ su ng Ngày nay, các nhà khoa học đã xác định được khoảng trên 2.500

serotype Salmonella và chia làm 67 nhóm huyết thanh dựa vào cấu trúc kháng

nguyên O [25]

Những năm gần đây, hai serotype Salmonella typhimurium và

Salmonella enteritidis được quan tâm nhất ở Mỹ, do Salmonella kháng lại

thuốc kháng sinh thông thường khi điều trị bệnh cho người và gia súc

Ngày nay, để định danh vi khuẩn Salmonella, người ta sử dụng sơ đồ của

Kauffmann - White do White thiết lập, sau đó được Kauffmann bổ sung và phát triển Trên hệ thống phân loại của Ewing, dựa vào khả năng gây bệnh và

thích nghi với vật chủ là người hay động vật mà Salmonella có thể chia ra làm

3 nhóm chính:

Nhóm 1: Salmonella gây bệnh cho người gồm Salmonella typhi và

Salmonella paratyphi A, B và C Chúng có thể lây nhiễm trực tiếp hoặc gián

tiếp qua thức ăn, nước uống, từ người này sang người khác [25]

Nhóm 2: Gây bệnh trên động vật, như Salmonella dublin ở trâu bò,

Salmonella cholerae suis ở lợn

Nhóm 3: Gây bệnh cho nhiều loài động vật, là nguyên nhân gây nên những vụ ngộ độc nghiêm trọng ở người và động vật, trong đó điển hình là

Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium, Salmonella spp là tác nhân

gây ngộ độc thực phẩm trên phạm vi toàn thế giới, bệnh do chúng gây ra đang

đe dọa sức kh ỏe cộng đồng ở hầu hết các quốc gia phát triể n và đang phát triển

Theo Laval (2000) thì nguy cơ bệnh do Salmonella ở lợn luôn đe dọa

trong thời kỳ vỗ béo đến khi giết mổ Lò mổ cũng là nơi tàng trữ và lây lan mầm bệnh quan trọng cho các trang trại chăn nuôi cũng như người tiêu dùng

Salmonella typhimurium gây bệnh viêm ruộ t ỉa chảy mạn tính ở lợn , chỉ cần

1 con lợn trong đàn lợn 100 con bị ỉa chảy do Salmonella, 24 giờ sau cả đàn

sẽ bị lây nhiễm Điều đáng chú ý là phương thức lây truyền ngang của loài vi khuẩn này từ lợn này sang lợn khác trong đàn sau khi chúng được bà i thải ra ngoài môi trường [1]

1.2.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam

Đây là những nghiên cứu có liên quan đến đề tài và gần đây nhất:

Lê văn Tạo và cộng sự (1994) khi tiến hành phân lập, xác định serotype

của vi khuẩn Salmonella gây bệnh ở lợn cho biết: 50% là Salmonella

cholerae suis; 12,5% Salmonella enteritidis; 6,5% Salmonella typhimurium

và còn lại là các serotype khác[18]

Trần Xuân Hạnh (1995) khi nghiên cứu trên lợn 2-4 tháng tuổi đã xác

định được 6 serotype Salmonella với tỷ lệ nhiễm như sau: Salmonella

cholerae suis 35,9%, S derby 17,9, Salmonella typhimurium và Salmonella london 10,2 và thấp nhất là Salmonella newport 7,6% [5]

Vũ Bình Minh, Cù Hữu Phú (1999) đã phân lập được Salmonella ở 80%

các trường hợp lợn bị tiêu chảy [19]

Võ Thị Trà An và cs (2006) cho biết tại các tỉnh phía Nam: phân heo

nhiễm Salmonella chiếm tỷ lệ 49,3 %, tỷ lệ mẫu phân mang Salmonella thu

thập từ cơ sở giết mổ luôn cao hơn mẫu phân thu thập từ cơ sở chăn nuôi,

mẫu vải gạc lau thân thịt heo nhiễm Salmonella với tỷ lệ 55,9 % [29] Nguyễn

Thị Nguyệt Quế (2006) khảo sát hiện trạng hoạt động giết mổ, một số chỉ tiêu

vi khuẩn sinh vật ô nhiễm trong thịt lợn nơi giết mổ và bày bán tại chợ trên địa bàn quận Long Biên – thành phố Hà Nội , cho thấy hiện trạng mất vệ sinh tại các điểm giết mổ và dẫn tới sự ô nhiễm vi sinh vật vào thân thịt [17]

Đỗ Văn Hiệp (2007) khảo sát 148 điểm giết mổ lợn và trâu bò tại huyện Quốc Oai - Hà Tây , cho biết : 100% hộ thực hiện giết mổ trên sàn , bằng phương thức thủ công với các dụng cụ thô sơ, 89,2% (58/65) hộ giết mổ dùng nước giếng khoan không qua xử lý , 100% số hộ giết mổ không quan tâm đến việc khử trùng tiêu độc nơi giết mổ và dụng cụ giết mổ Hoạt động giết mổ như vậy đã gây ô nhiễm vi sinh vật trầm trọng vào thân thịt với 36,5%

(31/86) mẫu nhiễm Salmonella [6]

Nguyễn Thị Thanh Thủy (2007) khảo sát hiện trạng hoạt động giết mổ

và ô nhiễm vi khuẩn sinh vật trong thịt lợn tại một số cơ sở giết mổ trên địa bàn huyện Gia Lâm – thành phố Hà Nội, cũng cho thấy một hiện trạng mất vệ sinh tại các điểm giết mổ dẫn đến ô nhiễm vi khuẩn vào thân thịt [16]

Ngô Văn Bắc (2007) cũng cho biết hầu hết các điểm giết mổ phục vụ cho tiêu dùng nội địa nằm xen kẽ trong khu dân cư , qui mô nhỏ lẻ , thiết kế xây dựng không đạt tiêu chuẩn, hầu hết các điểm giết mổ không có giấy phép kinh doanh, không có hệ thống xử lý chất thải [2]

1.2.3 Nguyên nhân nhiễm khuẩn trên thịt

Thịt là môi trường thuận lợi cho một số vi khuẩn tồn tại và phát triển, nguyên nhân lây nhiễm vi khuẩn vào thịt từ nhiều nguồn khác nhau Nhiễm khuẩn thịt có thể từ các nguyên nhân sau:

- Nhiễm khuẩn từ các nguồn tự nhiên

Thành phần hóa học của thịt rất khác nhau, phụ thuộc vào các yếu tố giống, loài, lứa tuổi, độ béo gầy và điều kiện chăm sóc, nuôi dưỡng Nhưng nhìn chung thành phần hóa học của thịt bao gồm:

Đánh giá cảm quan đối với thịt tươi, Nguyễn Vĩnh Phước (1976) và trung tâm kiểm tra vệ sinh thú y Trung ương I - Cục thú y (1998) [23], [24] cho biết trong bảng 1.1, bảng 1.2 :

Bảng 1.1 Đánh giá kết quả cảm quan thịt (Nguyễn Vĩnh Phước (1976), Trung tâm kiểm tra vệ sinh thú y Trung ương I-Cục thú y (1998)

ra không để lại vết

Hơi nhão, nhão, ấn ngón tay vào để lại vết nhẹ (thịt kém tươi), vết hằn sâu, không mất (thịt ôi)

4 Mỡ

Màu sáng, độ rắn và mùi vị tự nhiên của thịt tươi, không có mùi

6 Tuỷ Tuỷ trong, bám chặt vào thành

Theo phương pháp sinh hóa học, thịt tươi được đánh giá bằng các phản ứng sinh hóa học dựa theo các tiêu chuẩn sau:

Bảng 1.2 Tiêu chuẩn đánh giá thịt tươi bằng các phản ứng sinh hóa học

(Nguyễn Vĩnh Phước (1976), Trung tâm kiểm tra vệ sinh thú y

Trung ương I-Cục thú y (1998)

pH của nước thịt ngâm 5,4 - 6,4 6,5 - 6,7 Trên 6,7

Hàm lượng NH3 (mg) Dưới 1,26 1,27 - 1,68 Trên 1,68 Phản ứng CuSO4 làm

sa lắng protit

Nước thịt trong hoặc hơi đục

Nước thịt vẩn đục hoặc có hạt

Nước thịt đục có cặn sánh như keo

Phản ứng tìm

peroxydaza (thử

benzidin)

Nước thịt ngâm, lọc có màu xanh lá

mạ, sau mấy phút chuyển màu nâu

Nước thịt ngâm, lọc không có hoặc lâu mới có màu xanh lá mạ

Nước thịt ngâm, lọc không biến đổi màu sắc

Phản ứng Nestler tìm

NH3

Nước thịt ngâm, lọc không màu

Nước thịt ngâm, lọc có màu vàng

nhạt

Nước thịt ngâm, lọc có màu vàng

vỏ chanh Phản ứng tìm H2S

(dùng axetat chì)

Giấy lọc giữ nguyên màu

Giấy lọc có màu nâu nhạt

Giấy lọc có màu nâu sẫm hoặc đen

 Các dạng hư hỏng của thịt

Thịt trong quá trình bảo quản có thể bị biến chất và hư hỏng Sau khi giết mổ, thịt mới chưa bị biến chất Nhưng giữ thịt lâu chưa kịp tiêu thụ hoặc cất giữ dùng dần ở những điều kiện không thích hợp sẽ bị biến chất bởi các enzyme có sẵn trong thịt và vi sinh vật dẫn đến ôi thiu, hư hỏng về trạng thái cảm quan, hình thành những chất có hại

Những hiện tượng hư hỏng của thịt thường gặp là: Thịt nhớt, thối rữa, lên men chua, có các chấm màu trên bề mặt thịt, thịt mốc…[7]

Tuy nhiên trong thịt bảo quản lạnh vẫn có các vi sinh vật ưa lạnh như: Nhóm Pseudomonas, Achrmobacter, Flavobacterium, Alcaligenes, Aerobacterium và một số loại cầu khuẩn thuộc nhóm Pseudomonas như Pseudomonas fragi, Pseudomonas fluoresceus, Pseudomonas geniculata,

ngoài ra còn có nấm men, nấm mốc vẫn phát triển Thịt có mùi đất là do xạ khuẩn mọc Thịt muối vẫn tồn tại vi sinh vật ưa mặn và làm hỏng thịt [7]

1.3 VI KHUẨN SALMONELLA

1.3.1.Lịch sử phát hiện

Salmonella được lấy tên từ nhà khoa học người Mỹ, Daniel Elmer

Salmon - một nhà nghiên cứu bệnh lý động vật Năm 1885 Torrey Smith đã

phát hiện ra vi khuẩn Salmonella từ thịt [38]

Giống: Salmonella lignieres 1900

Loài: S bongori và S Enterica

Lúc đầu, các loài Salmonella được đặt tên theo hội chứng lâm sàng của chúng như S typhi hay S paratyphi A, B, C ( typhoid = bệnh thương hàn, para = phó ), hoặc theo vật chủ như S typhimurium gây bệnh ở chuột (murine

= chuột), về sau người ta thấy rằng một loài Salmonella có thể gây ra nhiều

hội chứng và có thể phân lập được ở nhiều loài khác nhau Vì những lý do đó

mà các chủng Salmonella mới phát hiện được đặt tên theo nơi mà nó được phân lập như S teheran, S congo, S london

1.3.2 Đặc điểm hình thái

Salmonella spp là trực khuẩn Gram âm, kị khí tuỳ nghi, không có nha

bào, có khả năng di động (trừ S gallinarum và S pullorum), có kích thước 0,4 – 0,6 x 1 – 3 µm Salmonella dễ dàng nuôi cấy ở 37oC trên môi trường nuôi cấy bình thường, chúng phát triển các khuẩn lạc có đường kính 2 – 4

mm, trơn, sáng và đồng nhất (Hình 1.1) [38]

Hình 1.1 Vi khuẩn Salmlonella spp

Kháng nguyên O: có hơn 60 loại được ký hiệu bằng số 1, 2, …12, được bao bọc bởi bề mặt của vi khuẩn tạo thành một lớp không đều Chia kháng nguyên O thành 34 nhóm A, B, C1, C2, C3, D1, D2, E1, E2, E3, E4, F, G1, G2, H, I, J, L, M, N, O, P, Q, R, S, T,U, V, W, X, Y, Z, 49, 50 Mỗi nhóm huyết thanh gồm một số loại vi khuẩn có kháng nguyên O cấu tạo bởi một thành phần nhất định Kháng nguyên O gồm chuỗi lipoplysaccharide-protein trên bề mặt tế bào Loại kháng nguyên này được coi là nội độc tố của vi khuẩn, nó có đặc tính ổn định đối với nhiệt 100oC trong 2 giờ, alcol Ngoài ra kháng nguyên O còn có tác dụng ngăn cản bạch huyết cầu đi qua mao mạch làm thay đổi tạm thời sự thẩm thấu của mao quản Kháng nguyên H: có bản chất là protein, rất kém bền vững so với kháng nguyên O Là loại protein không bền nhiệt, bị diệt ở 70oC hay dưới tác dụng của cồn, các enzyme tiêu hủy protein, nhưng chịu được formol Kháng nguyên H gắn liền với roi của vi khuẩn nên kháng nguyên này chỉ hiện diện trên các chủng có tiêm mao Kháng nguyên tiêm mao H có thành phần khác nhau tùy vào kiểu huyết thanh Kháng nguyên H có chứa 2 pha:

Pha 1 là pha đặc hiệu do chất kháng nguyên đặc hiệu của loài vi khuẩn tạo thành, bao gồm 28 loại kháng nguyên tiêm mao, biểu thị bằng chữ La tinh: a, b, c, g, m…

Pha 2 là pha không đặc hiệu: nhiều loại Salmonella chứa pha này, gồm

hơn 6 loại biểu thị bằng số Ả rập 1, 2, 3, 4, 5, 6 hay chữ La tinh e, n, x… Đến

nay người ta có khuynh hướng không đặt tên các chủng Salmonella nữa, mà

chỉ biểu thị bằng công thức kháng nguyên O và kháng nguyên H, ví dụ S 6, 8: r – 1, 5

Kháng thể kháng kháng nguyên H ngưng kết vi khuẩn bởi các roi của chúng Sự ngưng kết này sẽ tạo thành những mảng kết tụ, chúng có thể bị tách bởi các yếu tố có khả năng cắt roi của vi khuẩn Kháng nguyên H không có tác dụng gây bệnh, không gây miễn dịch, nó đặc hiệu cho các loài vi khuẩn dựa vào kháng nguyên H để phân loại bằng phương pháp huyết thanh

Kháng nguyên Vi: là kháng nguyên nằm ngoài kháng nguyên O và là nơi biểu hiện độc tố, được cấu tạo bởi polysaccharide của vỏ ngoài vách tế bào, thường kết hợp với tính gây độc chuyên biệt cho vật chủ Nó ức chế sự biểu hiện của kháng nguyên O khi nó phát triển nhiều, ổn định với nhiệt độ,

cồn và HCl Kháng nguyên này chỉ được xác định trên 3 kiểu huyết thanh: S

typhi, S paratyphi và S dublin Kháng nguyên Vi của một số chủng S typhi

đặc biệt có sức đề kháng tốt đối với nhiệt độ cao hơn các chủng Salmonella thông thường khác Khi kháng nguyên Vi bị mất thì ngay lập tức S typhi

cũng chết

Tất cả 3 loại kháng nguyên này đều được sử dụng để chuẩn đoán bệnh thương hàn trong phòng xét nghiệm cận lâm sàng

Kháng nguyên O biểu hiện chủ yếu lúc bệnh mới khởi phát

Kháng nguyên H biểu hiện mạnh lúc bệnh sắp kết thúc

Kháng nguyên Vi biểu hiện mạnh ở những người mang vi khuẩn mãn tính

1.3.4 Đặc tính sinh hóa

Salmonella có những đặc tính sinh hóa chủ yếu mà dựa vào đó người ta

có thể định hướng phân biệt với các vi khuẩn đường ruột khác Các chủng

Salmonella sinh acid do lên men glucose, mannitol, dulcitol nhưng không lên

men lactose (trừ S arizona) và sucrose, không có khả năng tách amine từ

trytophan Chúng không sinh indol hoặc acetoin và phân giải urea Phần lớn

các chủng sinh hydrogen sulfide (H2S) và tách carboxyl (de-carboxylate) từ ornithine và lysine Chúng kém chịu nhiệt nhưng chịu đuợc một số hóa chất như brilliant green, sodium lauryl sulfite, selenite, sodium tetrathionate Những chất này được dùng để chọn lọc chúng từ mẫu thực phẩm và nước

Để phân biệt các chủng Salmonella người ta dựa vào sự khác nhau về

đặc tính sinh hóa của chúng theo bảng 1.3:

Bảng 1.3 Đặc tính sinh hóa của một số loài Salmonella

Loài vi khuẩn Xyloz Arabinoz Trehaloz Inositon Mantoz Sinh

1.3.5 Triệu chứng gây bệnh

Triệu chứng bệnh do Salmonella biểu hiện phụ thuộc vào số lượng và tỉ

lệ vi khuẩn nhiễm vào thực phẩm Thời gian ủ bệnh khoảng 12 – 24 giờ, có khi vài giờ nhưng cũng có khi vài ngày Các dấu hiệu đầu tiên là bệnh nhân thấy nhức đầu, chán ăn, mặt tái nhạt, toát mồ hôi, nôn mửa, đau bụng và tiêu chảy Thân nhiệt tăng lên 38 –40oC trong vòng 2 – 4 ngày sau khi phát bệnh

và tùy thuộc mức độ nặng nhẹ mà kéo dài 3 – 7 ngày Bệnh nặng gây ra viêm

dạ dày , ruột Vi khuẩn tồn tại trong ống tiêu hóa từ 6 – 8 tháng và tiếp tục bài thải ra môi trường bên ngoài Vi khuẩn thải giảm 50% ở tuần thứ hai và còn 15% vào tuần thứ 4

1.3.6 Độc tố và cơ chế gây bệnh

Vi khuẩn vào ruột rồi phát triển tại đó, sau đó theo hệ thống bạch huyết và tuần hoàn gây nên tình trạng nhiễm trùng huyết Do đó trong thời kỳ đầu, lấy máu người bệnh truyền cấy sẽ phát hiện vi khuẩn Vi khuẩn gây viêm ruột, phá hỏng tế bào niêm mạc ruột, tiết ra độc tố Độc tố này thấm qua thành ruột vào máu Ngoài

ra, vi khuẩn trong hệ tuần hoàn cũng tiết ra nội độc tố Nội độc tố chủ yếu tác động trên hệ thần kinh vận động của huyết quản, làm giảm độ bền của thành mao quản và giảm chức năng điều tiết thân nhiệt của cơ thể

Ngoài yếu tố gây bệnh giúp vi khuẩn Salmonella bám dính, xâm nhập tế bào Đối với vi khuẩn Salmonella chúng sản sinh ra ít nhất 3 loại độc tố chính đó

là độc tố đường ruột (Enterotoxin), nội độc tố (Endotoxin) và độc tố tế bào (Cytotoxin) Trong đó độc tố đường ruột (Enterotoxin) có vai trò trong ngộ độc

thực phẩm

1.3.7 Đặc điểm nuôi cấy

Salmonella vừa hiếu khí vừa kị khí không bắt buộc, dễ nuôi cấy, nhiệt

độ thích hợp là 370C, nhưng có thể phát triển được từ 6 - 420C, pH thích hợp là

7,6; phát triển được từ pH 6 - 9 Salmonella gây bệnh ở gia súc, sinh trưởng tốt

trong điều kiện hiếu khí, kém hơn trong điều kiện kỵ khí

Môi trường nước thịt: Cấy sau vài giờ thấy đục nhẹ, sau 18h đục đều, nuôi lâu

ở đáy ống nghiệm xuất hiện cặn, trên mặt môi trường có màng mỏng

Môi trường thạch thường: nuôi cấy trên thạch thường vi khuẩn mọc thành các khuẩn lạc tròn, trong sáng hoặc xám, nhẵn bóng, hơi lồi lên ở giữa,

nhỏ và trắng hơn khuẩn lạc của E coli (đường kính = 1 - 1,5mm)

Ở một số loài như Salmonella paratyphi B, Salmonella cholerae suis

cấy trên thạch pepton dày, sau 1 - 2 ngày khuẩn lạc hình thành một bờ chất dính, chất keo bao bọc

Trên thạch thỉnh thoảng thấy có khuẩn lạc dạng R nhám, mặt trong mờ

Salmonella abortus equi nuôi cấy từ cơ thể động vật sang thạch thường lần

đầu tiên hình thành khuẩn lạc khô, hình hạt lỗ chỗ

Trên môi trường thạch sắt 3 đường TSI (Triple - Sugar - Iron- Agar):

Salmonella làm biến đổi mầu của môi trường; đáy của môi trường có màu

vàng, mặt thạch nghiêng có mầu đỏ và khi sản sinh H2S làm môi trường có mầu đen

Trên môi trường XLD hoăc XLT4 nuôi cấy ở tủ ấm 370C sau 18-24h, khuẩn lạc có màu đen do sinh H2S

Trên môi trường thạch Rambach nuôi cấy ở tủ ấm 370

C sau 18-24h khuẩn lạc có màu tròn, gọn và có màu hồng

Trên môi trường thạch Kligler: Salmonella làm biến đổi màu của môi

trường, đáy của môi trường có màu vàng, mặt thạch nghiêng có màu hồng đỏ và khi sản sinh H2S làm môi trường có màu đen và có khí đẩy thạch ở đáy

Ngoài yếu tố gây bệnh giúp vi khuẩn Salmonella bám dính, xâm nhập tế bào Đối với vi khuẩn Salmonella chúng sản sinh ra ít nhất 3 loại độc tố chính

đó là độc tố đường ruột (Enterotoxin), nội độc tố (Endotoxin) và độc tố tế bào (Cytotoxin) Trong đó độc tố đường ruột (Enterotoxin) có vai trò trong ngộ độc

thực phẩm

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Vi khuẩn Salmonella phân lập được trong thịt lợn tươi tại khu vực thành

phố Thái Nguyên

2.2 Vật liệu, hóa chất và dụng cụ nghiên cứu

- Các mẫu thịt lợn tươi lấy tại các chợ trung tâm trên địa bàn Thành phố Thái Nguyên

- Môi trường thông thường và đặc hiệu để nuôi cấy, phân lập và giám định

vi khuẩn Salmonella trong thịt lợn tươi

- Thiết bị, máy móc, dụng cụ hoá chất dùng trong thí nghiệm

2.2.1 Môi trường cần thiết trong quá trình nghiên cứu

- Môi trường tăng sinh Pepton Water Buffered (hãng Merck, Germany)

- Môi trường tăng sinh chọn lọc: MRSV (Modified Semisolid Rappaport Vassiliadis), Mueller Kauffmann Tetrathionat Novobiocin (hãng Merck, Germany)

- Môi trường thạch: Rambach agar, XLD ( Lysine Deoxycholate) agar (hãng Merck, Germany)

- Thạch nghiêng: Kligler Iron Agar (hãng Difco Laboratories, USA)

- Các môi trường làm phản ứng sinh hóa:

+ Lysin decarboxylase broth (hãng Himedia Laboratories, India) + Simons citrat agar (hãng Merck, Germany)

+ Ure broth (hãng Merck, Germany)

2.2.2 Thiết bị, máy móc, dụng cụ hoá chất dùng trong thí nghiệm

- Thiết bị: Tủ ấm, nồi hấp sạch, bẩn, tủ lạnh, buồng cấy vô trùng, cân, tủ mát, buồng cấy vô trùng, kính hiển vi

- Máy đồng nhất mẫu (Stomacher)

- Dụng cụ hoá chất cần thiết: Gạc, túi đựng mẫu, ống nghiệm, pipet, chai

lọ các loại, que cấy, đĩa Pertri, kéo, các hóa chất cần thiết cho phòng vệ sinh gia súc

- Bộ định type kháng huyết thanh O-H (Diagnostics Pasteur, Paris, Pháp)

Tất cả dụng cụ hóa chất, môi trường nuôi cấy, phân lập, giám định đều phải vô trùng tuyệt đối trước khi dùng

Stn- F Stn- R

5’- CTTTGGTCGTAAATAAGGCG- 3’

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp điều tra

- Điều tra bổ sung bằng phương pháp phỏng vấn trực tiếp và lấy mẫu xét nghiệm

- Sử dụng phương pháp thống kê chuyên môn

- Lập phiếu điều tra, thiết lập bảng biểu thu thập số liệu về thực trạng hoạt động giết mổ nội địa

2.4.2 Phương pháp lấy mẫu

Lấy mẫu theo tiêu chuẩn TCVN 4833-2002 [28]

2.4.3 Phương pháp xác định chỉ tiêu Salmonella

Bước 1: Tăng sinh

Đối với các loại mẫu thông thường, tiến hành cân 25g mẫu vào túi PE

vô trùng, bổ sung 225ml dung dịch BPW và đồng nhất mẫu trong 15 hoặc 30 giây Ủ ở 370

C trong 18 – 24 giờ Đối với một số loại mẫu có chứa các chất

gây độc hoặc ức chế sự phát triển của Salmonella cần tiến hành quy trình đặc

Một số môi trường tăng sinh chọn lọc khác cũng được sử dụng, mỗi loại môi trường chỉ có tác dụng chọn lọc dựa trên một đặc điểm phát triển của

Salmonella, một số dòng chỉ có thể tăng trưởng trong môi trường này mà

không thể tăng trưởng trong môi trường khác Do vậy, để tăng khả năng phát

hiện tất cả các dòng Salmonella hiện diện trong thực phẩm cần phải dùng ít

nhất hai loại tăng sinh chọn lọc khác nhau cho cùng một mẫu Ngoài ra mỗi môi trường cần được ủ ở các nhiệt độ khác nhau

Bước 3: Phân lập và nhận diện

Dùng que cấy vòng thực hiện kỹ thuật cấy phân lập khuẩn lạc đơn với giống từ dịch tăng sinh chọn lọc trên đĩa môi trường phân lập đặc trưng cho

Salmonella như XLD, HE, BS… Cường độ chọn lọc và mức độ phân biệt thể

hiện ở hình thái của khuẩn lạc Salmonella trên từng môi trường cũng khác nhau Để chọn lọc và nhận dạng tất cả các dòng Salmonella cần sử dụng ít

nhất hai loại môi trường chọn lọc phân biệt khác nhau cho cùng một mẫu Các

biểu hiện của Salmonella trên từng môi trường khác nhau như sau

Môi trường XLD: khuẩn lạc tròn, lồi, trong suốt, có hay không có tâm đen, đôi khi tâm đen quá lớn bao trùm khuẩn lạc, môi trường xung quanh chuyển sang màu hồng

Môi trường HE: khuẩn lạc có màu thay đổi từ xanh dương đến xanh lục, có hay không có tâm đen, đôi khi tâm đén quá lớn bao trùm khuẩn lạc

Môi trường BS: khuẩn lạc có màu nâu xám hay màu đen, thỉnh thoảng

có ánh kim tím, môi trường chuyển thành màu nâu và sau đó chuyển sang màu đen nếu kéo dài thời gian ủ

Bước 4: Khẳng định bằng các phản ứng sinh hóa

Từ mỗi môi trường phân lập cấy chuyển ít nhất 5 khuẩn lạc đặc trưng qua môi trường không chọn lọc như TSI Ủ ở 370

C trong 18 – 24 giờ Các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường này được sử dụng cho các test sinh hóa

và huyết thanh

Các thử nghiệm sinh hóa chính cần thực hiện cho Salmonella là: lên

men glucose, urea, mannitol, indol, H2S, VP, ODC, LDC, saccharose,

sorbitol Các chủng Salmonella cho kết quả thử nghiệm như sau

Thử nghiệm H2S (KIA hay TSI): Salmonella chỉ lên men được đường

glucose trong môi trường, vì vậy phần nghiêng của môi trường có màu đỏ,

phần sâu có màu vàng Đa số các chủng Salmonella đều có khả năng sinh H2S nên có các vạch màu đen trong môi trường Có thể quan sát thấy hiện tượng sinh hơi qua hiện tượng làm vỡ thạch hoặc môi trường bị đẩy lên để lại một khoảng hở dưới đáy ống nghiệm

Thử nghiệm LDC ( + ): sau khi nuôi cấy, môi trường bị kiềm hóa, màu không đổi ( màu tím hay xanh )

Thử nghiệm urea ( - ): Salmonella không phân giải urea nên không làm

thay đổi pH của môi trường, sau khi nuôi cấy môi trường vẫn giữ nguyên màu

Lên men mannitol, sorbitol ( + ): môi trường sau khi nuôi cấy bị acid hóa chuyển sang màu vàng

Thử nghiệm indol và VP (-)

Bước 5: Các thử nghiệm kháng nguyên

Cần được thử nghiệm song song với mẫu đối chứng bằng nước muối sinh lý để tránh hiện tượng ngưng kết giả Hai loại huyết thanh đa giá cần

dùng là Salmonella Polyvalent O và Salmonella Polyvalent H Phản ứng (+)

khi chủng thử nghiệm ngưng kết kháng huyết thanh nhưng không ngưng kết với nước muối sinh lý

2.4.4 Phương pháp xác định gen độc tố đường ruột Enterotoxin của chủng Salmonella phân lập được:

*Phương pháp tách DNA tổng số

Nguyên lý:

Để thu nhận DNA tinh sạch cần loại bỏ những thành phần tạp nhiễm,

mà quan trọng nhất là protein Sự tách chiết DNA dựa theo nguyên tắc hòa tan khác nhau của các phân tử khác nhau (nucleic acid/protein) trong hai pha không hòa tan (phenol, chloroform/nước) Mục đích là thu được các phân tử nucleic acid ở trạng thái nguyên vẹn tối đa, không bị phân hủy bởi các tác nhân cơ học hay hóa học Các nucleic acid cần được tách chiết trong điều kiện nhiệt độ thấp để ức chế hoạt động của các enzyme nội bào (DNase và RNase) Sau công đoạn tách chiết, nucleic acid tinh sạch nằm trong một thể tích dung dịch lớn Sự tủa kết hợp với ly tâm cho phép thu nhận nucleic acid dưới dạng

cặn tủa dễ bảo quản và khi cần có thể hòa lại trong nước theo nồng độ mong muốn

Tiến hành:

- Ly tâm dịch khuẩn nuôi qua đêm với tốc độ 8000v/p trong 7 phút, thu cặn loại bỏ dịch

- Bổ sung 1540 μl extraction buffer vào mỗi mẫu

- Bổ sung 5 μl protease K vào mỗi mẫu, đem lắc ở 37oC trong 90 phút

- Bổ sung 60 μl SDS 20%, ủ ở 65oC trong 120 phút, có đảo trộn

- Bổ sung 600 μl CI (Chloroform isoamylalcohol), spin down, ly tâm 12000v/p trong 15 phút ở 4oC, sau đó thu pha trên ra ống eppendorf mới

- Lặp lại bước trên

- Kết tủa DNA bằng 350 μl Isopropanol ủ ở nhiệt độ phòng 1 giờ

- Ly tâm 12000v/p trong 15 phút ở 4oC, thu tủa

- Rửa tủa bằng 500 μl Ethanol 70%, ly tâm 12000v/p trong 15 phút ở

có khác là dùng nhiệt độ cao (95oC) để biến tính chuỗi DNA sợi kép, kết hợp

với Taq DNA polymerase chịu nhiệt và hệ thống điều khiển nhiệt thích hợp

cho từng giai đoạn phản ứng tổng hợp cùng với các đoạn mồi được thiết kế

chủ động Kỹ thuật PCR nhân bản lượng lớn DNA chỉ với một lượng nhỏ DNA ban đầu

Tiến hành:

- Sau khi đo nồng độ DNA khuôn , tính và tạo các nồng độ DNA của các mẫu như nhau để khi đưa vào mỗi ống phản ứng thể tích DNA khuôn được giống nhau, và đạt khoảng 50mg trong tổng thể tích là 25µl/ 1 phản ứng

- Tính lượng thể tích các thành phần khác trong phản ứng , trộn đều các thành phần rồi chia vào các ống đã có khuôn DNA

- Đặt các ống vào máy PCR, khởi động, cài đặt chu kì và cho máy chạy Phản ứng PCR được tiến hành với các thành phần như sau:

+ 5µl PCR buffer 5x [( 750mM Tris-HCl (pH 8.8), 200mM (NH4)2SO4, 0,1% Tween 20) (ABgene), 2mM MgCl2,200µM của mỗi loại dNTP]

+ 1 µl mỗi loại primer (3,2 µM /µl)

+ 0,05 µl Taq DNA Polymerase ( 5 units/µl) (Abgene)

+ 2 µl DNA khuôn

+ Nước khử ion vô trùng vừa đủ 25 µl cho một phản ứng

Phản ứng PCR được thực hiện với chu trình nhiệt như sau:



30 chu kì

4oC

2.4.5 Phương pháp định type huyết thanh học các chủng Salmonella phân lập được bằng phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính

- Chuẩn bị kháng nguyên: Những chủng vi khuẩn phân lập được có các

đặc tính sinh vật, hoá học đặc trưng của vi khuẩn Salmonella;

- Trước hết là làm phản ứng ngưng kết với kháng huyết thanh O đa giá

sau đó là kháng huyết thanh O đơn giá của các chủng Salmonella cholerae

suis; Salmonella typhimirium;

- Cách tiến hành phản ứng: Trên phiến kính sạch, nhỏ hai giọt nước sinh lý tại hai vị trí riêng rẽ, dùng que cấy vô trùng lấy một ít khuẩn lạc

Salmonella cần định type từ thạch đĩa nuôi cấy, trộn đều khuẩn lạc vào nước

sinh lý ở phiến kính tạo thành huyễn dịch vô trùng Dùng que cấy vô trùng lấy một giọt kháng huyết thanh đa giá hoà vào dịch nuôi cấy vi trùng trên phiến kính, đọc kết quả sau vài giây:

+ Phản ứng dương tính: Khi dịch nuôi cấy vi khuẩn và kháng huyết thanh tạo hạt ngưng kết trên phiến kính, dịch nuôi cấy ở trên trong;

+ Phản ứng âm tính: Dịch nuôi cấy vi khuẩn và kháng huyết thanh đục đều, không có hạt ngưng kết;

Trong trường hợp vi khuẩn có khả năng tự ngưng kết (tức là khi cho huyễn dịch vi khuẩn hoà vào nước sinh lý có hình thành các hạt ngưng kết nhiều hoặc ít) thì chủng này bị loại bỏ;

Mẫu dương tính với kháng huyết thanh O đa giá sẽ tiến hành phản ứng ngưng kết tiếp với kháng huyết thanh O đơn giá Phương pháp tiến hành và đọc kết quả theo mô tả trên

Một số chủng Salmonella có 2 pha kháng nguyên H Để xác định chủng

đó cần xác định pha 2 của kháng nguyên H Sau khi xác định kháng nguyên H pha 1 theo sơ đồ trên, tiến hành xác định pha 2 như sau

- Chuẩn bị thạch Sven Gard: Đây là môi trường bán cố thể, có bán sẵn trên thị trường, chỉ cần pha theo hướng dẫn của nhà sản xuất Dùng đĩa có đường kính ¢ 6mm trước khi đổ thạch nhỏ 1 giọt nhỏ Anti Sven Gard Serum với mục đích ức chế pha 1.Tùy theo pha 1 mà có loại Anti Sven Gard Serum khác nhau (SG1, SG2, SG3, SG4, SG5, SG6)

- Sau khi đã có thạch Sven Gard, dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn đã xác định được kháng nguyên H pha 1, chấm nhẹ lên bề mặt thạch ở giữa đĩa thạch

đường xuống đáy ống nghiệm, để tủ ấm 370

c trong 24h sau đó xem kết quả:

Bề mặt ống nghiệm có màu hồng, đường cấy trích sâu có màu đen do sản sinh

H2S Những ống có phản ứng đặc trưng của vi khuẩn Salmonella sẽ được

dùng để kiểm tra các phản ứng sinh hoá;

* Phản ứng sinh indole: Sau khi nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường nước

thịt Buffered pepton water (BPW) ở tủ ấm 370c trong 24h, kiểm tra bằng cách nhỏ vào mỗi ống nghiệm 1-2 giọt dung dịch Kovacs, nếu không tạo thành vòng màu đỏ ở trên bề mặt ống nghiệm: Phản ứng sinh Indole âm tính

2.4.7 Phương pháp thử độc lực trên chuột nhắt trắng

Sau khi nuôi cấy và tiến hành tinh khiết vi khuẩn qua các môi trường cấy chuyển, ta lấy một vài khuẩn lạc cấy tiếp lên môi trường BHI bồi dưỡng trong tủ ấm 370

C trong 24h tạo điều kiện cho vi khuẩn sản sinh độc tố rồi tiến hành thử độc lực trên chuột thí nghiệm;

Chuẩn bị chuột thí nghiệm: Chuột nhắt trắng 18-22g/con Đánh dấu thứ

tự tương ứng với canh khuẩn đem tiêm Mỗi chủng dùng 2 chuột, mỗi chuột tiêm 0,2ml canh khuẩn nguyên (đã bồi dưỡng ở 370

C trong 24h), tiêm vào xoang phúc mạc Theo dõi số chuột chết và thời gian chết của chuột sau khi tiêm canh khuẩn (trong 24-72h); Chuột chết được mổ khám kiểm tra bệnh tích, lấy bệnh phẩm ở gan, máu tim để phân lập lại

2.4.8 Phương pháp kháng sinh đồ

Chuẩn bị canh khuẩn: Sau khi tiến hành giám định các đặc tính sinh vật

học, lấy mỗi chủng vi khuẩn Salmonella đã phân lập được, cấy trên môi

trường BHI và nuôi trong tủ ấm 370

C trong 24h; Môi trường sử dụng: Muller Hinton agar; Tiến hành thử kháng sinh đồ: Lấy 0,5ml canh khuẩn đã chuẩn bị

ở trên pha loãng đến 10-4 Dùng pipetman hút 0,2ml canh khuẩn đã pha nhỏ lên đĩa thạch và láng đều trên mặt đĩa thạch, sau đó để 3-5 phút cho khô Dùng panh đặt và ấn nhẹ các giấy tẩm kháng sinh lên mặt thạch đặt cách nhau

20 mm, bồi dưỡng trong tủ ấm 370c Đọc kết quả sau 18-24 giờ bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn và căn cứ vào tiêu chuẩn để đánh giá tính mẫn cảm

2.4.9 Phương pháp xử lý số liệu

Các số liệu nghiên cứu được xử lý thống kê sinh học theo phương pháp của Chu Văn Mẫn (2002) áp dụng trên phần mềm Office - Microsoft Excel và

hệ thống SAS 2000 [22]

Sơ đồ tóm tắt phân lập Salmonella

Mẫu (thực phẩm, bệnh phẩm, phân ): (1 phần [25g])

Môi trường Buffered pepton Water (9 phần [225ml])

Chọn khuẩn lạc đặc trưng

Định type bằng kháng huyết thanh

Phân lập gen độc tố đường ruột Enterotoxin

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Khảo sát tình hình giết mổ và tiêu thụ thịt lợn trên địa bàn thành phố Thái Nguyên

Cho đến nay, nhiều tỉnh, thành phố, đặc biệt là các tỉnh phía Bắc vẫn chưa quy hoạch, xây dựng được hệ thống giết mổ tập trung Theo báo cáo của Cục Thú y, hiện nay cả nước có khoảng 17.129 điểm và cơ sở giết mổ (CSGM) gia súc, gia cầm, trong đó chỉ có 617 CSGM tập trung (chiếm 3,6%) và chủ yếu ở các tỉnh phía Nam Việc kiểm soát giết mổ cũng đang

bị bỏ ngỏ Chỉ có 7.281 điểm giết mổ được kiểm soát (chiếm 42,5%), trong

đó tỷ lệ được kiểm soát ở các tỉnh phía Bắc rất thấp (chỉ đạt 23,7%)

Tình trạng giết mổ gia súc nói chung và giết mổ lợn nói riêng để tiêu thụ trong thành phố Thái Nguyên cũng không nằm ngoài thực tiễn trên Các điểm giết mổ diễn ra tràn lan, không quản lý được Trước tình hình đó, chuyên ngành thú y đã phối hợp với các cấp, các ngành thực hiện công tác kiểm soát giết mổ, kiểm tra vệ sinh thú y nhưng mới chỉ dừng lại ở hình thức kiểm tra bằng phương pháp cảm quan và lăn dấu trên thân thịt sau khi giết mổ tại các quầy bán trên chợ Việc giết mổ lợn vẫn chưa có lò mổ tập trung, chuyên dụng mà chủ yếu vẫn là giết mổ cá nhân tại các hộ chăn nuôi và các lò

mổ tư nhân tự phát

Trước tình hình thực tế nêu trên chúng tôi đã tiến hành khảo sát tình hình giết mổ và tiêu thụ thịt lợn trên đi bàn thành phố Thái Nguyên cụ thể như sau:

3.1.1 Khảo sát tỷ lệ chợ và quầy bán thịt được kiểm soát giết mổ trên địa bàn thành phố Thái Nguyên

Chúng tôi đã tiến hành khảo sát tỷ lệ chợ và quầy bán thịt đƣợc kiểm

soát giết mổ trên địa bàn thành phố Thái Nguyên, kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 3.1

Bảng 3.1 Tỷ lệ chợ và quầy bán thịt đƣợc kiểm soát giết mổ

trên địa bàn thành phố Thái Nguyên

Tổng

số chợ

Số kiểm dịch đƣợc

Tỷ lệ (%)

Tổng

số quầy

Số kiểm dịch đƣợc

Tỷ lệ (%)

Kết quả bảng 3.1 cho thấy:

- 100% số chợ trên địa bàn thành phố đã đƣợc cơ quan thú y kiểm tra, kiểm dịch

- Toàn thành phố có 632 quầy bán thịt lợn và đã kiểm tra vệ sinh thú y

đƣợc 610 quầy, chiếm tỷ lệ 96,6%, với 3,5% số quầy chƣa đƣợc kiểm tra vệ sinh thú y là những quầy bán nhỏ, lẻ trong ngõ, tổ, xóm, nơi có địa hình phức tạp, xa chợ chính

3.1.2 Khảo sát tình hình giết mổ và tiêu thụ thịt lợn tại 4 khu chợ: Quan Triều, Đồng Quang, Chợ Thái và Gang Thép

Chúng tôi tiến hành khảo sát tình hình giết mổ và tiêu thụ thịt lợn tại 4 khu chợ: Quan Triều, Đồng Quang, Chợ Thái và Gang Thép trên địa bàn thành phố Thái Nguyên trong 15 ngày Kết quả trung bình thu đƣợc trình bày ở bảng 3.2

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát tình hình giết mổ và tiêu thụ thịt lợn tại

4 khu chợ: Quan Triều, Đồng Quang, Chợ Thái và Gang Thép Chỉ tiêu

Địa điểm

Thời gian hoạt động

Số lƣợng quầy

Tỷ lệ quầy đạt yêu cầu kiểm dịch (%)

Số lƣợng lợn giết thịt trung bình (con/ngày)

Khối lƣợng thịt lợn tiêu thụ trung bình (tấn/ngày)

Quan Triều 5 - 19h 18 100 22,46 ± 0,70 1,06 ± 0,02 Đồng Quang 4 - 20h 29 100 59,87 ± 1,32 3,17 ± 0,05 Chợ Thái 4 - 20h 30 100 57,67 ± 1,09 2,56 ± 0,02 Gang Thép 5 - 19h 21 100 25,73 ± 0,36 1,50 ± 0,01

Kết quả trong bảng 3.2 cho thấy: đa số các chợ trung tâm đều bắt đầu hoạt động vào khung giờ từ 4h - 20h cùng ngày Số lƣợng các quầy hàng bán

thịt lợn tươi cũng có sự chênh lệch đáng kể do quy mô và vị trí địa lý - tự nhiên xã hội từng địa điểm chợ 100% số lượng quầy bán thịt lợn ở 4 khu chợ được cơ quan thú y kiểm tra, kiểm dịch Sức tiêu thụ thịt lợn ở 4 khu chợ Quan Triều, Đồng Quang, Chợ Thái và Gang Thép khá lớn Cụ thể khối lượng tiêu thụ chợ Quan Triều 1,06 ± 0,02 tấn/ngày, chợ Đồng Quang 3,17 ± 0,05 tấn/ngày, chợ Thái 2,56 ± 0,02 tấn/ngày, chợ Gang Thép 1,50 ± 0,01 tấn/ngày Ngoài ra, có sự tương quan giữa số lượng con lợn được giết thịt mỗi ngày với khối lượng thịt tiêu thụ là do mật độ dân cư ở mỗi địa điểm lấy mẫu

có sự khác nhau

Từ số liệu trên ta có thể đánh giá được nhu cầu sử dụng thịt lợn ở thành phố Thái Nguyên là khá cao Số lượng này còn chưa kể đến khối lượng thịt xẻ, thịt gà, thịt bò ở các huyện, thị khác trong tỉnh chuyển về Theo chúng tôi, mức độ tiêu thụ thịt lợn cao là do: TP Thái Nguyên là nơi tập trung đông dân cư, đặc biệt là thành phố tập trung một lượng lớn sinh viên của các trường đại học, cao đẳng và trung học chuyên nghiệp Và cũng qua đó chứng tỏ thói quen và khẩu vị của người tiêu dùng vẫn tập trung vào thịt lợn Ngoài ra, do chất lượng cuộc sống ngày một nâng cao hơn nên nhu cầu thực phẩm có nguồn gốc động vật cũng tăng lên trong đó thịt lợn là thực phẩm thiết yếu hàng đầu

Kết quả trên cũng cho thấy, với mức sử dụng của người dân ngày càng cao thì vấn đề đặt ra cho ngành thú y là cần phải chú trọng và quản lý chặt chẽ hơn nữa đối với công tác kiểm soát giết mổ, kiểm tra vệ sinh thú y và an toàn thực phẩm để góp phần bảo vệ sức khỏe cho người tiêu dùng, hạn chế dịch bệnh xảy ra cho người và gia súc Vì vậy chúng tôi tiến hành đánh giá và xác định chỉ tiêu nhiễm khuẩn trên thịt lợn tươi