Nghiên cứu ba dược liệu hướng tác dụng điều trị sỏi thận chuối hột kim tiền thảo rau om

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÙI MỸ LINH NGHIÊN CỨU BA DƯC LIỆU HƯỚNG TÁC DỤNG ĐIỀU TRỊ SỎI THẬN Chuối hột-Kim tiền thảo-Rau om LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯC HỌC TP Hồ Chí Minh - 2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÙI MỸ LINH NGHIÊN CỨU BA DƯC LIỆU HƯỚNG TÁC DỤNG ĐIỀU TRỊ SỎI THẬN Chuối hột-Kim tiền thảo-Rau om Chuyên ngành: Đông dược Thuốc Nam Mã số : 3.02.06 LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯC HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS TS.NGUYỄN KHẮC QUỲNH CỨ PGS TS.TRẦN HÙNG TP Hồ Chí Minh - 2007 I LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan Luận án công trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu Luận án trung thực chưa công bố công trình khác Tác giả Luận án Bùi Mỹ Linh I II MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cam đoan I Muïc luïc II – III Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt IV-V Danh mục bảng VI-VII Danh mục hình, sơ đồ VIII-X Danh mục hợp chất phân lập, định danh XI MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan sỏi thận 1.1.1 Định nghóa phân loại sỏi thận 1.1.2 Cấu trúc sỏi, nguyên nhân ảnh hưởng lên hình thành 1.1.3 Diễn biến sỏi 1.1.4 Tình hình nghiên cứu, điều trị sỏi tiết niệu 1.2 Giới thiệu dược liệu nghiên cứu 10 1.2.1 Chuối hột (CH) 10 1.2.2 Kim tiền thảo (KTT) 13 1.2.3 Rau om (RO) 19 1.3 Ứng dụng HPLC vào nghiên cứu hợp chất flavonoid 24 1.3.1 Ứng dụng sắc ký lỏng hiệu cao vào nghiên cứu flavonoid 25 1.3.2 Phân lập flavonoid kỹ thuật HPLC bán điều chế 26 1.3.3 Định tính flavonoid phương pháp HPLC 28 1.3.4 Định lượng flavonoid phương pháp HPLC 30 CHƯƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.1 Nguyên liệu nghiên cứu : Chuối hột, Kim tiền thảo, Rau om 32 2.2 2.3 Trang thiết bị súc vật nghiên cứu 33 2.4 Dung môi - Hóa chất 34 2.5 Phương pháp nghiên cứu 34 2.5.1 Nghieân cứu thực vật 34 2.5.2 Nghiên cứu dược lý .35 2.5.3 Nghiên cứu hóa học .41 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 44 3.1 Khảo sát thực vật hoïc 44 3.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu: chuối hột, kim tiền thảo, rau om 44 3.1.2 Độ tinh khiết 55 3.2 Kết nghiên cứu thăm dò tác dụng sinh học 55 3.2.1 Thử nghiệm tác dụng lợi tiểu 55 III 3.2.2 Thử nghiệm tác động giãn 58 3.2.3 Thử nghiệm tác động mòn sỏi 62 3.2.4 Thử nghiệm tác động kháng khuẩn 66 3.3 Kết khảo sát hoá học 67 3.3.1 Xác định hàm lượng K+ dược liệu 68 3.3.2 Thành phần hoá học quy trình chiết xuất tổng quát 68 3.3.3 Khảo sát hoá học Chuối hoät 70 3.3.4 Khảo sát hoá học Kim tiền thảo 73 3.3.5 Khảo sát hoá học Rau om 76 3.4 Xác định cấu trúc 80 3.4.1 Xác định cấu trúc chất tinh khiết Chuối hột 80 3.4.2 Xác định cấu trúc chất tinh khiết Kim tiền thảo 82 3.4.3 Xác định cấu trúc chất tinh khiết Rau om 91 3.5 Định lượng xây dựng tiêu chuẩn dược liệu 102 3.5.1 Định lượng dược liệu 102 3.5.1.1 Xác định hàm lượng chất tan cồn Chuối hột 102 3.5.1.2 Định lượng isoschaftosid /Kim tiền thảo 102 3.5.1.3 Định lượng nevadensin /Rau om 106 3.5.2 Xây dựng tiêu chuẩn dược liệu 110 3.5.2.1 Xây dựng tiêu chuaån CH 110 3.5.2.2 Xây dựng tiêu chuẩn KTT 111 3.5.2.3 Xây dựng tiêu chuẩn RO 114 3.6 Thử nghiệm dược lý 117 3.6.1 Thử nghiệm dược lý chất tinh khiết 117 3.6.2 Thử nghiệm độc tính cấp diễn 121 CHƯƠNG BÀN LUẬN 122 4.1 Bàn luận thực vật hoá phân loại thực vật 122 4.2 Bàn luận kết thực nghiệm sinh học 122 Tác dụng lợi tiểu 123 Tác động giãn 124 Tác động mòn sỏi kháng khuẩn 125 Độc tính cấp diễn 127 4.3 Bàn luận khảo sát hoá học 127 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 134 DANH MUÏC CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ a TÀI LIỆU THAM KHẢO i - xii PHUÏ LUÏC PL - VI DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Hệ thống phân loại thực vật theo Takhtajan 11 Bảng 1.2 Một số hợp chất có dược liệu thuộc chi Desmodium 16 Bảng 1.3 Một số hợp chất có dược liệu thuộc chi Limnophila 22 Bảng 1.4 Tác dụng kháng khuẩn kháng nấm L gratissima 23 Bảng 1.5 Một vài ví dụ phân lập flavonoid PP HPLC bán điều chế 27 Bảng 1.6 Dãy hấp thu UV-Vis flavonoid 29 Bảng 2.7 Đặc điểm cao dược liệu thử nghiệm tính mòn sỏi 39 Bảng 2.8 Đặc điểm cao dùng thử nghiệm tính kháng khuẩn 40 Bảng 3.9 Độ tinh khiết Chuối hột, Kim tiền thảo Rau om (%) 55 Bảng 3.10 Kết khảo sát tính lợi tiểu phân đoạn dung môi/Chuối hột 56 Bảng 3.11 Kết khảo sát tính lợi tiểu phân đoạn dung môi/Kim tiền thảo 57 Bảng 3.12 Kết khảo sát tính lợi tiểu phân đoạn dung môi/Rau om 58 Bảng 3.13 Ảnh hưởng Co, C1 C7 /Chuối hột ruột cô lập 59 Bảng 3.14 Ảnh hưởng K1 , K2 K7 /Kim tiền thảo / ruột cô lập 60 Bảng 3.15 Ảnh hưởng R1, R2 R7 Rau om ruột cô lập 61 Bảng 3.16 Số liệu thử nghiệm viên sỏi ngâm cao nước CH 62 Bảng 3.17 Số liệu thử nghiệm viên sỏi ngâm cao nước KTT 63 Bảng 3.18 Số liệu thử nghiệm viên sỏi ngâm cao nước Rau om 65 Bảng 3.19 Nồng độ ức chế tối thiểu cao chiết vi khuẩn thử nghiệm 66 Bảng 3.20 Bảng số liệu hàm lượng K+ trung bình X (mE Kali) 68 Bảng 3.21 Kết phân tích thành phần hóa thực vật CH, KTT RO 69 Bảng 3.22 Hàm lượng tinh dầu Rau om, thu mẫu nhiều nơi 77 Bảng 3.23 Chuyển dịch hoá học 13C-NMR M1A M1B Chuối hột 81 Bảng 3.24 Số liệu phổ 1H 13C-NMR Ds3 phân lập từ Kim tiền thảo 87 Bảng 3.25 Số liệu phổ 1H 13C-NMR Ds5 phân lập từ Kim tiền thảo 88 VII Bảng 3.26 Số liệu phổ 13C 1H-NMR phần đường flavon CGlycosid từ Kim tiền thảo (400 MHz,500, MHz DMSO-d6,  ppm) 89 Bảng 3.27 Sự tương tác cộng hưởng phổ 1H 13C-NMR Ds6 90 Bảng 3.28 Thành phần hàm lượng chất tinh dầu Rau om (S1)* 92 Bảng 3.29 Bảng so sánh chuyển dịch hoá học carbon L1và acid betulinic 93 Bảng 3.30 Những số liệu phổ 1H 13 C-NMR L4 95 Bảng 3.31 Những số liệu phổ 1H 13C-NMR L2 97 Bảng 3.32 Những số liệu phổ 1H 13C NMR L5 99 Bảng 3.33 Chuyển dịch hoá học 13C-NMR L4, L2 , L5 Nevadensin 99 Bảng 3.34 Cấu trúc flavonoid chiết xuất từ Rau om 100 Bảng 3.35 Các liệu phân tích flavonoid dịch chiết EtOH/RO 101 Bảng 3.36 Kết xác định chất tan cồn Chuối hột 102 Bảng 3.37 Kết HPLC dung dịch isoschaftosid đối chiếu 104 Bảng 3.38 DTĐ trung bình hàm lượng isoschaftosid đối chiếu / mẫu tiêm 104 Bảng 3.39 Hàm lượng isoschaftosid (iso.) dịch chiết Kim tiền thảo 105 Bảng 3.40 Kết phân tích DD nevadensin đối chiếu máy HPLC 108 Bảng 3.41 DTĐ trung bình tương ứng với hàm lượng nevadensin đối chiếu 108 Bảng 3.42 Hàm lượng nevadensin dịch chiết Rau om 109 Bảng 3.43 Kết thử nghiệm tính lợi tiểu chất M1, Ds1, Ds2, L2 118 Bảng 3.44 Ảnh hưởng mẫu M1 Ds2 ruột cô lập 119 Bảng 3.45 Ảnh hưởng mẫu L1, L2 L3 ruột cô lập 120 VIII DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Chuối hột A Cây Chuối hột B Hoa chuối (cắt dọc) C Hoa chuối 12 Hình 1.2 Các phận Kim tiền thảo 15 Hình 1.3 Cây Rau om A Cành mang hoa B Hoa C Nhị D Bầu nhụy Hình 2.4 Lồng biến dưỡng 21 36 Hình 2.5 A Chuột mổ bụng để lấy phần ruột dùng cho thử nghiệm B Đoạn ruột cô lập nhúng vào dung dịch nuôi (DD Tyrode) 38 Hình 3.6 A Nải chuối hột 43 B Quả chuối hột cắt ngang C Hạt Chuối hột Hình 3.7 Soi bột hạt Chuối hột 44 Hình 3.8 Cây Kim tiền thảo (Desmodium styracifolium) 45 Hình 3.9 Hình chụp vi phẫu thân Kim tiền thảo 47 Hình 3.10 Lông tiết lông che chở đa bào Kim tiền thảo 47 Hình 3.11 Tinh thể calci oxalat hình trụ thân Kim tiền thảo 47 Hình 3.12 Hình vẽ vi phẫu Kim tiền thảo 48 Hình 3.13 Hình vẽ vi phẫu thân Kim tiền thảo 49 Hình 3.14 Soi bột Kim tiền thảo 50 Hình 3.15 Cây Rau om (Limnophila aromatica) 51 Hình 3.16 Vi phẫu Rau om A Vi phẫu B Vi phẫu thân C Vi phẫu thân (phần tủy) D Lông tiết tinh dầu E Mảnh biểu bì mang lông… 52 Hình 3.17 Soi bột Rau om 53 Hình 3.18 Hình vẽ vi phẫu Rau om 53 Hình 3.19 Hình vẽ vi phẫu thân Rau om 54 Hình 3.20 SK đồ HPLC phổ UV Ds3 (1), Ds5 (2), Ds6 (3) 76 Hình 3.21 Công thức cấu tạo M1 (sitosterol stigmasterol 2) 81 Hình 3.22 Công thức cấu tạo propelargonidin (M2) từ Chuối hột 82 IX Hình 3.23 Các flavon C-glycosid phân lập từ Kim tiền thảo 90 Hình 3.24 Sự tương tác HMBC proton với vòng A, B C L4 95 Hình 3.25 Sự tương tác HMBC proton với vòng A, B C L2/RO 97 Hình 3.26 Cấu trúc flavonoid chiết xuất từ Rau om 100 Hình 3.27 Tương tác HMBC proton vòng A L5 /RO 100 Hình 3.28 Sắc ký đồ HPLC isoschaftosid DD đối chiếu 103 Hình 3.29 Sắc ký đồ HPLC flavonoid có dịch chiết KTT 104 Hình 3.30 Đường cong chuẩn isoschaftosid 105 Hình 3.31 Sắc ký đồ HPLC nevadensin chuẩn DD đối chiếu 107 Hình 3.32 Sắc ký đồ HPLC flavonoid có dịch chiết Rau om 107 Hình 3.33 Đường cong chuẩn nevadensin 108 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 133 - Trong thử nghiệm hoán chuyển (sau đợt thử nghiệm), cụ thể lấy viên sỏi trước ngâm dung dịch chứng ngâm dung dịch thuốc (cao dược liệu) ngược lại Kết cho thấy khối lượng (gam) sỏi tan : Chuối hột: 0,017/CH 1:10 (chứng 0,014) Kim tiền thảo: 0,0141/KTT 1:1 0,0082/KTT 1:10 (chứng 0,0068) Rau om: 0,0049/RO 1:1 0,005/RO 1:10 (chứng 0,0183) Tóm lại qua thử nghiệm tác động mòn sỏi dược liệu Chuối hột, Kim tiền thảo Rau om kết ghi nhận viên sỏi có giảm khối lượng sau đợt thí nghiệm có mẫu cao Chuối hột 1:10 cao Kim tiền thảo 1:1 1:10 có tác dụng mòn sỏi rõ so với chứng Tuy nhiên, thử nghiệm in-vitro, số lượng viên sỏi quy định để thử không nhiều, điều kiện thử môi trường nước tiểu nhân tạo không hoàn toàn giống thể người nên kết thử nghiệm có tính sơ nhận định, thăm dò Việc tìm kiếm thêm mô hình thử nghiệm tính mòn sỏi, thử nghiệm nhiều loại sỏi, nhiều loại mẫu thử nghiệm việc hữu ích cần làm để làm tăng tính thuyết phục thử nghiệm Tác dụng kháng khuẩn Mẫu thử nghiệm chuẩn bị nhiều dạng khác cao cồn, cao nước, dịch ép dược liệu tươi, tinh dầu (Rau om), sử dụng phương pháp pha loãng môi trường rắn để xác định MIC chất kháng khuẩn Kết thử nghiệm cho thấy cao cồn dược liệu thể tính kháng khuẩn trực khuẩn mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa) yếu, dịch ép tươi cao nước Rau om lại đặc tính Tinh dầu Rau om có tác dụng kháng khuẩn tất vi khuẩn thử nghiệm, đặc điểm hữu ích Tn thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 134 cần thiết đường di chuyển, viên sỏi tạo vết thương dễ gây nhiễm trùng môi trường hệ tiết niệu Trên thực tế thuốc chống nhiễm trùng thường sử dụng phác đồ điều trị sỏi thận Từ kết thử nghiệm sinh học cho thấy dược liệu có tác dụng riêng biệt sỏi thận dựa mô hình đề Chuối hột thể số tác động giãn tác động mòn sỏi, tác động lợi tiểu lại không đáng kể Trong Kim tiền thảo lại có tác động lợi tiểu tốt (cao cồn), tác động mòn sỏi thể rõ lại tính giãn Đối với Rau om tác động giãn tốt, tác động lại rõ Từ nhận định gợi ý cho việc điều trị sỏi thận phối hợp dược liệu với liều lượng thích hợp - phác đồ tổng hợp có tính hỗ tương giúp nâng cao hiệu điều trị Độc tính cấp diễn Qua khảo sát thử nghiệm độc tính cấp dược liệu Chuối hột, Kim tiền thảo Rau om cho thấy chúng độc tính hay dấu hiệu bất thường liều thử nghiệm, bước đầu cho thấy việc sử dụng dược liệu làm thuốc không ảnh hưởng độc cho thể Những kết thử nghiệm phù hợp với thực tế Chuối hột, Rau om loại rau dùng phổ biến lâu đời nhân dân 4.3 BÀN LUẬN VỀ KHẢO SÁT HOÁ HỌC Trên sở kết hợp phương tiện tiến lãnh vực nghiên cứu phương pháp HPLC áp dụng phân tích điều chế , SPE tinh chếá, APCI-MS phân tích, số hợp chất lần phát dược liệu nghiên cứu, cụ thể sau: Tn thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 135 - Từ Chuối hột phân lập M2 hợp chất propelargonidin Cấu trúc M2 chứng minh kỹ thuật LC-MS, phân tử khối M+ = 546 tương ứng với propelargonidin dimer cấu tạo đơn phân pelargonidin C15H14O5 Qua tài liệu tham khảo, tác giả đề cập cách tổng quát hạt Chuối hột có proanthocyanidin mà Như vậy, lần propelargonidin phân lập từ Chuối hột, flavonoid tồn thiên nhiên dạng trùng hợp dimer - Đối với Kim tiền thảo, theo tác giả Su, Y L.; Wang, Y L.; Yang, J S (1993) từ phân đoạn nước Kim tiền thảo phân lập C-glycosid vicenin-1, vicenin-3 schaftosid Trong phần nghiên cứu phân đoạn n-butanol Kim tiền thảo mọc Việt Nam, phân lập C-glycosid nữa, Ds3 (isoschaftosid), Ds5 Ds6 Qua số liệu phổ nghiệm xác định cấu trúc Ds3 , Ds5 Ds6 apigenin 6,8- di-C- glycosid: • Apigenin 6-C--L arabinopyranosyl 8-C--D- glucopyranosid (isoschaftosid) (Ds3) • Apigenin 6,8-di-C--L-arabinopyranosid (Ds5) • Apigenin 6-C--L-arabinopyranosyl-8-C--D-xylopyranosid (Ds6) Đây flavon C-glycosid lần phân lập Kim tiền thảo Trong số này, theo hiểu biết chúng tôi, Ds6 chất Theo tài liệu [60],[61],[85] từ phân đoạn nước Kim tiền thảo, tác giả nước phân lập, khảo sát flavonoid chi Desmodium cho thấy vòng A thường có nhiều nhóm nhö vitexin, isovitexin, gangetin, genistein, kaempferitrin, desmodin, vicenin-1, vicenin-3, schaftosid v.v… Kết khảo sát Tn thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 136 cho thấy chất (Ds3), (Ds5) (Ds6) vừa phân lập có đặc điểm tương tự - Đối với Rau om phân lập được: • Acid betulinic (3-) (L1), triterpen tìm thấy vỏ Betula spp., Rhododendron arboreum (Ericaceae) [71] Bên cạnh tính giãn cơ, acid betulinic có tác dụng kháng viêm, kháng khối u (antitumour), có khả chống lại hệ thống tạo khối u Walker carcinoma 256 [60] • Nevadensin (L2), aglycon flavonoid phân lập trước từ Iva nevadensis từ Lysionotus pauciflorus (Gesneriaceae), có tính kháng viêm [66] Qua thử nghiệm chất có tính giãn • Gardenin B (L4), aglycon flavonoid phân lập từ vỏ Citrus jambhiri (Rutaceae), nhựa dầu Gardenia lucida (Rubiaceae) • Nevadensin 7-O--D-glucopyranosid (L5), flavonoid glycosid phân lập từ Lysionotus pauciflorus (Gesneriaceae) Tác giả trước biện luận cấu trúc chất cách thủy phân để xác định phần genin phần đường Trong tài liệu bổ sung thêm cấu trúc phần đường nhờ phương tiện phổ đại HSQC, HMBC DQF-COSY… mà không cần phải thuỷ phân • Isothymusin (L6) tìm thấy Ocimum grandiflorum, L7 pilosin tìm thấy Ocimum americanum var pilosum (Lamiaceae) • 8-Hydroxy salvigenin (L8) , trước Krisnan & cộng công bố cấu trúc flavonoid từ L gratissima salvigenin [67], [68] Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 137 Qua tham khảo so sánh với tài liệu, nhận định flavonoid L1 L3 L4 L5 L6 L7 L8 L9 chất lần xác định thành phần Rau om (Limnophila aromatica (Lamk.) Merr., Scrophulariaceae) Các flavonoid phát Rau om nevadensin, nevadensin-7O--D glucopyranosid ba flavon bị hydroxy hoá vị trí C-8 (L6 : 8-hydroxy cirsimaritin  isothymusin  5,8,4’-trihydroxy-dimethoxy flavon), (L7 : 8-hydroxy pectolinarigenin  pilosin  5,7,8 -trihydroxy-6,4’-dimethoxy flavon), (L8 : 8hydroxy salvigenin  5,8-dihydroxy-6,7,4’-trimethoxy flavon) gặp giới thực vật, số tác giả sử dụng chúng hoá phân loại thực vật [58],[74],[79] L5 : nevadensin-7-O--D glucopyranosid L8 :8-hydroxy salvigenin công bố lần trước Ngoài chất L5 lần phân lập từ Lycionotus pauciflorus thuộc họ Gesneriaceae vào năm 1998, chất lại tìm thấy họ Hoa môi (Lamiaceae) họ gần gũi với họ Hoa mõm sói (Scrophulariaceae) Rau om [46], [71],[86] • Tinh dầu Rau om : xác định hàm lượng thành phần cấu tạo tinh dầu Rau om Qua khảo sát hóa học cho thấy hàm lượng tinh dầu Rau om mọc Việt Nam 1,5% cao Rau om Ấn Độ 10 lần (0,13%), có sai biệt cách tính toán (chúng tính hàm lượng tinh dầu dược liệu khô tuyệt đối); ảnh hưởng thổ nhưỡng mà hàm lượng có khác Qua so sánh với tài liệu tham khảo nhận thấy thành phần cấu tạo tinh dầu giống Cả hai có thành phần d-limonen (42%), (S-) -(4-isopropenyl-1-cyclohexanyl) methanol perillaldehyd (4,4%) [J.Venkata, K.Srinivasan, 1989] Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn (18,7%) d- Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 138 Đã khảo sát hàm lượng tinh dầu Rau om mọc vùng khác thành phố Hồ Chí Minh (1,50%), thành phố Hà Nội (1,56%), đồng sông Cửu Long (Đồng Tháp) 1,58% cao nguyên (Lâm Đồng) 1,70% Từ kết cho thấy mẫu dược liệu Rau om trồng cao nguyên cho hàm lượng tinh dầu cao Họ Scrophulariaceae họ Lamiaceae có nhiều điểm tương đồng hình thái thực vật, thuộc Bộ Lamiales có liên hệ gần theo sở trình tự ADN, sản sinh iridoid glycosid caffeoyl phenylethyl glycosid (57) Tuy nhiên, họ phụ Nepetoideae, mặt hoá học biết họ chứa dẫn xuất bậc cao tinh dầu có nhiều họ Lamiaceae Trong họ Scrophulariaceae thường tạo dẫn chất monoterpenoid iridoid glycosid thay tinh dầu [58] Đứng mặt hóa phân loại mà nói, diện tinh dầu flavonoid Rau om lần khẳng định mối liên hệ chặt chẽ gần gũi họ Scrophulariaceae Lamiaceae Định tính - Đối với Chuối hột: hạt Chuối hột có thành phần flavonoid, saponin, tanin phytosterol chọn tanin flavonoid làm sở để định tính chúng có đặc tính đặc trưng: tanin tủa với thuốc thử gelatin muối; flavonoid dạng proanthocyanidin, thực phản ứng cyanidin thông thường kết âm tính, phản ứng flavonoid thực môi trường acid đun nóng đặc hiệu cho hạt Chuối hột - Đối với Kim tiền thảo: Kim tiền thảo có thành phần flavonoid, saponin, alcaloid phytosterol chọn flavonoid alcaloid làm sở để định tính Tn thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 139 Theo kết phân tích phần hoá học (3.3.2) nhận thấy alcaloid Kim tiền thảo đặc biệt nhạy với acid silicotungstic (TT Bertrand) với iod iodid (TT Bouchardat); với kali iodobismuthat (TT Dragendorff) trinitrophenol (TT Hager) phản ứng nhạy, cần thời gian tủa xuất [80] Bên cạnh định tính dược liệu phản ứng hóa học hình dạng bên ngoài, cấu tạo vi học đặc điểm hữu ích để xác định Đối với Kim tiền thảo với dạng hình tròn có gân phụ song song đặc biệt đặc điểm điển hình Hơn mặt vi học, lông che chở đa bào dài với tế bào ngắn gốc, lông tiết đa bào phình to gốc đặc điểm chuyên biệt dược liệu - Đối với Rau om: Rau om có thành phần tinh dầu, flavonoid, saponin, hợp chất uronid Qua thử nghiệm dược lý cho thấy flavonoid dược liệu có tác dụng tốt, chọn flavonoid làm sở để định tính Phản ứng cyanidin cho kết dương tính rõ Phương pháp dùng SKLM cho vết tương đương với vết chuẩn (chất chuẩn chuẩn đối chiếu nevadensin), có Rf khoảng 0,61 với hệ dung môi chọn Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao so sánh với nevadensin phương pháp nhạy đặc hiệu để định tính Rau om Đặc điểm thực vật giúp ích nhiều cho việc nhận định Rau om với mọc vòng 3, hoa cô độc nách lá, có mùi thơm đặc trưng Đặc điểm vi học điển hình cho thực vật sống gần nước với nhiều khuyết to vùng mô mềm, riêng phần thân khuyết to nhiều, ngăn cách dãy tế bào trông đặc sắc Định lượng Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 140 Trước đây, tài liệu không thấy đề cập đến tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu Mãi đến Dược điển III có chuyên luận ngắn Kim tiền thảo, đề cập đến phản ứng định tính dựa vào flavonoid (phản ứng Cyanidin) alcaloid (phản ứng tạo tủa với TT Dragendorff TT Hager) Trong công trình xây dựng phương pháp kiểm nghiệm cho dược liệu nghiên cứu Đối với Chuối hột, tiêu chuẩn thực vật, định tính trình bày phần trước, xác định hàm lượng chất tan cồn cho dược liệu Đây phương pháp thường sử dụng Dược điển Anh (Phần phụ lục dành cho thuốc), bước tiến hành đơn giản lại góp phần xác định phần chất lượng dược liệu Đối với Kim tiền thảo Rau om tiêu chuẩn chung thực vật định tính, xây dựng tiêu chuẩn định lượng cho hai dược liệu phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao Với phương pháp này, việc định lượng flavonoid (isoschaftosid cho Kim tiền thảo nevadensin cho Rau om) tiêu biểu có hàm lượng cao cây, định lượng flavonoid khác có thành phần dược liệu dựa vào diện tích đỉnh đỉnh tách riêng sắc ký đồ Trong trường hợp max đỉnh không chênh lệch, hệ số tắt phân tử (molar extinction coefficient) quy flavonoid chuẩn Hàm lượng flavonoid toàn phần có dược liệu tích hợp hàm lượng tương ứng đỉnh Tn thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 141 KEÁT LUẬN Qua thời gian thực luận án:‛ Nghiên cứu ba dược liệu hướng tác dụng điều trị sỏi thận Chuối hột, Kim tiền thảo, Rau om”, đề tài thu kết sau: Khảo sát thực vật học - Đã thu thập mẫu nghiên cứu số nơi lãnh thổ Việt Nam Căn vào đặc điểm thực vật, đối chiếu với khóa phân loại trợ giúp nhà thực vật học xác định tên thức dược liệu Chuối hột, Kim tiền thảo, Rau om - Đã khảo sát đặc điểm vi học (vi phẫu bột) dược liệu nghiên cứu Tn thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 142 Những kết nghiên cứu thực vật học góp phần tiêu chuẩn hóa dược liệu Tác dụng sinh học - Đã khảo sát tính kháng khuẩn dược liệu, kết cho thấy tinh dầu Rau om tính kháng khuẩn Streptococcus faecalis, Staphylococcus aureus MRSA, với MIC cao Dịch chiết cồn dược liệu tính kháng khuẩn trực khuẩn mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa) yếu Trong dịch chiết nước cao nước Rau om tính kháng khuẩn vi khuẩn thử nghiệm - Thử nghiệm lợi tiểu giãn xác định phân đoạn có tác dụng Từ phân đoạn kỹ thuật hóa học phân lập 12 chất tinh khiết, có chất thử nghiệm có tác dụng sinh học là: • M1 (sitosterol, stigmasterol) từ Chuối hột: có hướng tác động lợi tiểu có tác động giãn • Ds1 (acid palmitic), Ds2 (sitosterol, stigmasterol) từ Kim tiền thảo: có tác động lợi tiểu • L1 (acid betulinic), L2 (nevadensin), L3 (24-z-methylen homocholesterol) từ Rau om có tác động giãn - Đã sơ khảo sát tính làm mòn sỏi (thử nghiệm in vitro) từ cao nước dược liệu Kết cho thấy dịch chiết nước Kim tiền thảo Chuối hột bước đầu có số tác động làm mòn sỏi - Đã khảo sát độc tính cấp diễn dược liệu, kết cho thấy chúng độc tính liều thử nghiệm, xét nghiệm đại thể quan phủ tạng chuột thử nghiệm bình thường Qua tác động lợi tiểu, giãn mòn sỏi cao chiết Chuối hột, Kim tiền thảo Rau om phần chứng minh ý nghóa khoa học việc sử dụng dược liệu việc làm thuốc điều trị sỏi thận nhân dân Mặt khác, kết thử sinh học giúp định hướng cho phần nghiên cứu hóa học Hóa học Tn thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 143  Từ dược liệu Chuối hột, Kim tiền thảo Rau om phân lập xác định cấu trúc 12 chất tinh khiết phổ NMR (1H, 13 C-NMR, HSQC, HMBC, DQF-COSY…) tinh dầu sắc ký khí khối phổ (GCMS), định danh chất kỹ thuật HPLC-MSø (ACPI): - Chuối hột: sitosterol, stigmasterol (M1), propelargonidin ( M2) Propelargonidin chất lần xác định có hạt Chuối hột - Kim tiền thảo: acid palmitic (Ds1), sitosterol, stigmasterol (Ds2 ), ·Apigenin 6-C--L- arabinopyranosyl 8-C--D-glucopyranosid (Isoschaftosid) (Ds3) ·Apigenin 6,8-di-C--L-arabinopyranosid (Ds5) ·Apigenin 6-C--L- arabinopyranosyl-8-C--D-xylopyranosid (Ds6) Theo kiểm tra Ds3 , Ds5 , Ds6 flavonoid chưa công bố từ Kim tiền thảo Trong số Ds6 chất chưa công bố tài liệu tham khảo - Rau om: Acid betulinic (3-) (L1), nevadensin (L2), 24-z-methylen- homo cholesterol (L3), gardenin B (L4), nevadensin 7-O--D-glucopyranosid (L5), isothymusin (L6), pilosin (L7), 8-hydroxy salvigenin (L8), pectolinarigenin (L9) Theo kiểm tra L1, L3, L4, L5, chất chưa phân lập định danh từ Rau om Các chất L6,L7,L8, L9 chất định danh lần từ Rau om Tinh dầu Rau om có hàm lượng trung bình 1,58%, có diện 14 chất, có thành phần d-limonen (42%), (S)-(4-isopropenyl-1cyclohexanyl) methanol (18,7%) d-perillaldehyd (4,4%)  Bằng số liệu phổ H, 13 C-NMR, HSQC, HMBC, DQF-COSY xác định cấu trúc L5 nevadensin 7-O--D-glucopyranosid, không cần thuỷ phân  Định lượng flavonoid Kim tiền thảo Rau om phương pháp HPLC  Đã xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm Chuối hột, Kim tiền thảo, Rau om Gồm có: Tn thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 144 - Chuối hột: định tính dựa vào diện tanin, flavonoid (proanthocyanidin) Xác định hàm lượng chất tan cồn Chuối hột (X  15%) - Kim tiền thảo: định tính dựa vào diện flavonoid (phản ứng hoá học) alcaloid (phản ứng hoá học) Định lượng isoschaftosid Kim tiền thảo SK lỏng hiệu cao (HPLC) (Cx  0, %) - Rau om: định tính dựa vào diện flavonoid (phản ứng hoá học, SK lớp mỏng HPLC) dựa vào nevadensin Định lượng (nevadensin) Rau om phương pháp SK lỏng hiệu cao (HPLC) (Cx  0, 6%) Từ kết thu xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cho dược liệu nghiên cứu Điều giúp ích cho việc chọn lựa, thu mua nguyên liệu làm thuốc nói riêng, công tác kiểm nghiệm dược liệu chế phẩm từ dược liệu nói chung Qua kết nghiên cứu, đạt mục tiêu chủ yếu đề tài đề khảo sát mặt thực vật, tác dụng sinh học thành phần hóa học dược liệu Chuối hột, Kim tiền thảo Rau om Các kết nghiên cứu góp phần chứng minh tác dụng hiệu điều trị bệnh sỏi thận dược liệu, tiêu chuẩn kiểm nghiệm giúp cho chất lượng thuốc thành phẩm tốt tiện dụng KIẾN NGHỊ Nếu công trình tiếp tục, xin đề nghị thực số công việc sau đây: - Hoàn thiện phương pháp định lượng cho dược liệu Chuối hột Tn thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 145 - Nghiên cứu thêm tác động làm mòn sỏi dược liệu loại sỏi tác dụng chất tinh khiết phân lập từ dược liệu Có kết giúp cho việc điều trị sỏi chuyên biệt hiệu - Nghiên cứu dạng chế phẩm thích hợp từ dược liệu phối hợp Chuối hột, Kim tiền thảo, Rau om với để thử nghiệm lâm sàng sử dụng thực tế Tn thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PHUÏ LUÏC PL-1: Phổ IR viên sỏi thận /TN mịn sỏi PL-2A: Phổ 1H-NMR (CDCl3, 200 MHz) M1/CH PL-2B: Phổ 13C-NMR (CDCl3, 100 MHz) M1/CH PL-2C: Phổ 13C-NMR DEPT (CDCl3, 100 MHz) M1/CH PL-2D: Phổ HETCORR (CDCl3) M1/CH PL-3: Phổ LC-MS propelargonidin (M2)/CH PL-4A: Phổ 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) Ds3/KTT PL-4B: Phổ HSQC-1 (DMSO-d6, 400 MHz) Ds3/KTT PL-4C: Phổ HSQC-2 (DMSO-d6, 400 MHz) Ds3/KTT PL-4D: Phổ HMBC (DMSO-d6, 400 MHz) Ds3/KTT PL-4E: Phổ LC-MS Ds3/KTT PL-5A: Phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 400 MHz) Ds5/KTT PL-5B1: Phổ HSQC-1 (DMSO-d6, 400 MHz) Ds5/KTT PL-5B2: Phổ HSQC-2 (DMSO-d6, 400 MHz) Ds5/KTT PL-5C: Phổ LC-MS Ds5/KTT PL-6A: Phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz, 60C) Ds6/KTT PL-6B1: Phổ HSQC-1 (DMSO-d6, 500 MHz, 60C) Ds6/KTT PL-6C2: Phổ HSQC-2 (DMSO-d6, 500 MHz, 60C) Ds6/KTT PL-6C3: Phổ HSQC-3 (DMSO-d6, 500 MHz, 60C) Ds6/KTT PL-6C4: Phổ HSQC-4 (DMSO-d6, 500 MHz, 60C) Ds6/KTT PL-6D1: Phổ HMBC-1 (DMSO-d6, 500 MHz, 37 C) Ds6/KTT PL-6D2: Phổ HMBC-2 (DMSO-d6, 500 MHz, 60C) Ds6/KTT PL-6E: Phổ HMBC (DMSO-d6, 400 MHz) cuûa Ds6/KTT PL-6E: Phổ LC-MS cuûa Ds6/KTT PL-9A1 : Phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 400 MHz) L4/RO PL-9A2 : Phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 400 MHz) L4/RO PL-9A3 : Phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 400 MHz) L4/RO PL-9B : Phổ 13C-NMR (DMSO-d6, 100 MHz) L4/RO PL-9C: Phổ 1H, 13C-HSQC (DMSO-d6, 400 MHz) L4/RO PL-9D: Phổ HMBC (DMSO-d6, 400 MHz) L4/RO Tn thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM PL-10A1 :Phoå 1H-NMR (DMSO-d6, 400 MHz) L2/RO PL-10A2 :Phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 400 MHz) L2/RO PL-10A3 :Phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 400 MHz) L2/RO PL-10B1: Phổ 13C-NMR (DMSO-d6, 100 MHz) L2/RO PL-10B2: Phổ 13C-NMR (DMSO-d6, 100 MHz) L2/RO PL-10D: Phổ 1H, 13C-HSQC (DMSO-d6, 400 MHz) L2/RO PL-10E: Phổ HMBC (DMSO-d6, 400 MHz) L2/RO PL-11A: Phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) L5/RO PL-11A1: Phổ 1H-NMR-1 (DMSO-d6, 500 MHz) L5/RO PL-11A2: Phổ 1H-NMR-2 (DMSO-d6, 500 MHz) L5/RO PL-11A3: Phổ 1H-NMR-3 (DMSO-d6, 500 MHz) L5/RO PL-11B: Phổ 13C-NMR (DMSO-d6, 100 MHz) L5/RO PL-11C Phổ 1H, 13C-HSQC (DMSO-d6, 400 MHz) L5/RO PL-11D1: Phổ HMBC (DMSO-d6 ) L5/RO PL-11D2: Phổ HMBC over wide sweep (DMSO-d6, 100 MHz) cuûa L5/RO PL-11E1 : Phổ 1H-DQF-COSY (DMSO-d6, 400 MHz) L5/RO PL-11E2 : Phổ 1H-DQF-COSY (DMSO-d6, 400 MHz) L5/RO CHÚ THÍCH: CH: Chuối hột ; KTT: Kim tiền thảo ; RO: Rau om Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn ... BÙI MỸ LINH NGHIÊN CỨU BA DƯC LIỆU HƯỚNG TÁC DỤNG ĐIỀU TRỊ SỎI THẬN Chuối hột- Kim tiền thảo- Rau om Chuyên ngành: Đông dược Thuốc Nam Mã số : 3.02.06 LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯC HỌC Người hướng dẫn khoa... ? ?Nghiên cứu ba dược liệu hướng tác dụng điều trị sỏi thận Chuối hột, Kim tiền thảo Rau om? ?? với nội dung sau: Khảo sát mặt thực vật học giúp nhận định xác dược liệu Khảo sát tác dụng sinh học giúp... 44 3.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu: chuối hột, kim tiền thảo, rau om 44 3.1.2 Độ tinh khiết 55 3.2 Kết nghiên cứu thăm dò tác dụng sinh học 55 3.2.1 Thử nghiệm tác dụng lợi tiểu