Đang tải... (xem toàn văn)
Saponin + Dich chõm sc k: Tỹa Saponin ton phõn (tua S) thu duac tự quy trợnh chiột'>... cụ Saponin duoc liờu ^ - So bụ nhõn dinh Saponin triterpenoid hay Saponin steroid: Dich chiờ't Saponin cho vo hai ụ'ng nghiờm, ụ'ng thờm acid HC1, ụ'ng thờm NaOH Lc manh, nờ'u cụt bot ụ'ng cao. .. l Saponin triterpenoid, nộu cụt bot ụ'ng cao hon l Saponin steroid - Xõc dinh chợ so tao bot cỹa diùỗfc liờu: Chợ sụ tao bot l sụ ml nuục dở ho tan saponin lg nguyờn liờu cho mot cụt bot cao. .. rõng thõn cỹa Hong liờn ụ rụ moc tai Dốo Giụ - Tinh Cao Bõng cụ chỷa Saponin v l Saponin steroid Sõc k lụp mụng: > Saponin + Dich chõm sc k: Tỹa Saponin ton phõn (tua S) thu duac tự quy trợnh chiột
BÔYTÉ TRITÔNG DAI HOC DUOC HÀ NÔI NGUYÊN VÀN TOÂN NGHIÊN CÛU SAPONIN VÀ MÔT SÔ TÂC DUNG CÜA SAPONIN TRONG THÂN CÂY HOÀNG LIÊN Ô RÔ MOC TAIDÈO GIÔ - TÎNH CAO BANG (KHOÂ LUÂN TOT NGHIÊP DUÜC SÎ KHOÂ 1998 - 2003) Ngucri hirông dân : TS. Phùng Hoà Binh Nai thuc hiên : - Bô môn Dirçrc hoc co truyên - Té môn vi sinh bô môn công nghiêp duac - Phông duac lÿ - Sinh Hoâ - Viên Duac liêu Thôi gian thuc hiên: tù 0312003 den 05/2003 HÀ NÔI, THÂNG 5,2003 J( Mi carn, (Pn c Dê hoàn thành khoâ luân tôt nghiêp, tôi dâ nhân dirçfc su" giup dd tân tinh cüa câc thây giâo, cô giâo, câc ban cùnglôp vàgia dînh. Nhân dip này, tôi xin dtfçfc gûi ldi câm ctn chân thành tôi: TS. Phùng Hoà Bînh ngiïôd dà tnfc tiê'p hirông dân tôi thüc hiên dê tài này. Tôi cüng xin diïçfc trân trong câm cm câc thây giâo, cô giâo bô mon Duçfc hoc cS truyên, thây TS. Cao Vân Thu - Té vi sinh - Bô mon công nghiêp diïçfc, Phông diroc lÿ - Sinh hoâ - Viên diïçfc lieu và câc Phông ban trong nhà tnrdîig, ban bè và ngirôi thân dà cS vu, dông viên, tao diê'u kiên, giup dd tôi rat nhiêu trong thdi gian thiic hiên dê tài này. Hà Nôi, ngày 20 Thâng 5 nam 2003. Sinh viên Nguyên Vân Toân. MUC LUC DAT VAN DÊ PHÂN 1: TÔNG QUAN 1.1. Cây Hoàng liên Ô rô 1.1.1. Dac âiem thuc vât 1.1.2. Phân ho 1.1.3. Thành phân hoâ hoc 1.1.4. Tac dung sinh hoc 1.1.5. Công dung 1.2. Câc phirong phâp xâc dinh Saponin 1.2.1. Dinh ünh 1.2.2. Dinh luomg PHÂN 2: THlTC NGHIÊM VÀ KET QUÂ 2.1. Nguyên vât lieu và phirong phâp nghiên ctiru 2.1.1. Nguyên vât lieu 2.1.2. Phucmg phâp nghiên cûu 2.2. Ket quâ thuc nghiêm và thâo luân 2.2.1. Hinh thâi thuc vât cüa mâu nghiên cûu 2.2.2. Hoâ hoc 2.2.3. Tac dung sinh hoc Trang 1 2 2 2 2 4 4 5 6 6 10 11 11 11 12 14 14 15 29 2.3. Bàn luân 2.3.1. Hoâ hoc 2.3.2. Tac dung sinh hoc PHAN 3: KÊT LUÂN VÀ DE XUAT 3.1. Ket luân 3.1.1. Hoâ hoc 3.1.2. Tac dung sinh hoc 3.2. De xuât TÀI LIEU THAM KHÂO 34 34 37 38 38 38 38 39 40 CHÜ VIÉT TÂT CSTB CSPH DD g/kg TT HPLC M. MNC NXB SKG SKLM : Chï so tao bot : Chî so phâ huyét : Dung dich : g/kg thé trong : Sâc kÿ long hiêu nâng cao : Mahonia : Mâu nghiên cuu : Nhà xuâ't bân : Sâc kÿ giây : Sâc lÿ lorp mông DAT VAN DE Mahonia sp. Berberidaceae (ho Hoàng liên gai) là tên khoa hoc cüa nhiêu loài Hoàng liên ô rô. Dây là mot loai cây cô ô nhiêu noi trên thé giôi nhir Lào, Trung Quôc, Thâi Lan, Canada [1,6,12,14,16,17].... Ô Viêt Nam chüng thtfcmg moc hoang trên câc vùng nui cao nhir : Cao Bâng, Hà Giang, Lai châu, Lâm dông, Lào Cai... [1,6,11,12,14,16,17] Théo kinh nghiêm dân gian, Hoàng liên ô rô thirôfng diroc dùng dé chüa câc bênh vê diïcfng tiêu hoâ nhir kiêt ly, viêm ruôt, tiêu chây, viêm gan vàng da [1,6,14,16,17]. Nuôc sâc dâm dâc dùng ngoài con dë tri câc chiïng viêm da, di ûng, ngûa lô [6,14,16]. Mot so loài thuôc chi này dâc biêt là M. aquifolium dâ diroc nghiên cüu cho thây cô tâc dung tôt vôi câc bênh: vây nên, eczema, da khô và nâm ngoài da. [18,19, 20,22,23]. Mot so tâc giâ birôc dàu xâc dinh thân cây Hoàng liên ô rô cô chûa Alcaloid chü yêu là nhôm Protoberberin, ngoài Alcaloid trong thành phân cüa cây côn chûa Saponin [9]. \ / Vi vây, de tài này tiép tue nghiên cüu Saponin vôi câc nôi dung sau: + Dinh tmh, dinh lirçmg Saponin toàn phân trong cây + Thü tâc dung khâng nâm, tâc dung chông viêm cüa Saponin toàn phân. 1 PHÀN 1 TÔNG QUAN 1.1. Cây Hoàng liên ô rô (Mahonia sp. Jterberidaceae). 1.1.1. Dâc âiém thuc vât. Cây bui hay cây gô nhô, cao tù 2 - 6m [6, 11, 14]. Thân cây cô ruôt màu vàng, cành không cô gai. La kép hînh long chim le, moc so le, cô hai gai nhô phia cuông la, gôm tir 3 - 21 la chét tuÿ tîïng loài. La chét thircmg cô hînh trùng dàu sàc nhon, phia cuông trôn, môi bên cô tù 3 - 8 rang cüa sàc, ngân [1.6.14.16.17], Mùa hoa cô thé tù thâng 9-11 hoâc vào mùa xuân (thâng 1-3), mùa quâ chm vào thâng 11-2 hoâc 4 - 5 tuÿ tîmg loài [1,16]. Cum hoa hînh bông, phân nhânh à gôc, hoa màu vàng nhat [1,6,14,16,17]. Quâ mong hînh trùng màu xanh thâm, khi chm quâ cô màu tfm, bên trong chùa tù 2-5 hat [1.6.14.17]. 1.1.2. Phân bd: Hoàng liên ô rô phân bô à nhiêu noi trên thé giôi nhir Lào, Trung Quôc, Thâi Lan, Mï, Canada, Viêt Nam... [1,4,12,16,17]. Cây thtfông moc hoang trên câc vùng nui cao, lanh, nui dâ vôi, à dô cao trên 1000m [16]. Mot sô loài nhu M.aquifolium Push.; M.repens (Lindl.) G.Don. cô nhiêu à vùng Tây bâc Mÿ, Canada [20]. M. Bealei (Fort.) Carr.; M. nepalensis D.C.; M. fortunei (Fort) Carr. cô nhiêu à Trung Quôc, Lào, Thâi lan, An Dô [6,14,16]. Ô Viêt nam, Hoàng liên ô rô côn duoc goi là Hoàng bâ gai, Thich Hoàng liên, Thfch hoàng bâ, Tông pênh (H’Mông), Mâ hô hay Thâp dai công lao [16,12,17,1]. Hiên nay, câc nhà khoa hoc dâ phât hiên duoc 3 loài Mahonia à nuôc ta. Viên duoc lieu (Bô Ytê) dâ lây và liru mâu 3 loài Mahonia này gôm: Mahonia bealei (Fort.) Carr. (N°1541C) à Hà Giang trên dînh nui cao 1400m (ành 1.1.a) 2 - Mahonia nepalensis D.C. (N°2709) à LangBiang - Lac Dirong - Lâm Dông. (ânh 1.1.b) - Mahonia japonica (Thunb.) D.C. (N°2021A) à Sïn H6 - Lai Châu. (ânh 1.1.c) Anh 1.1. Tiêu ban 3 loài Mahonia luu tai Viên Dixoc lieu và MNC 9 Ânh 1.1.a: Mau N°1541C Ânh 1.1.c: Mâu N°2021A Anh 1.1.d: mâu~ nghiên cûu ? So sânh vôi câc mâu liru tai Viên diroc lieu, mâu Hoàng liên ô rô moc à Dèo Giô - Tînh Cao Bàng (ânh 1.1.d) giông vôi mâu N°2021A (ânh 1.1. c). 1.1.3. Thành phân hoâ hoc. Rê và thân Hoàng liên ô rô thuông chüa câc Alcaloid chu yéu là nhôm Protoberberin nhu Berberin, Palmatin và Rotundin, ngoài ra côn cô oxycanthin, jatrorrhizin, neprotin [1,11,16,17] Trong rê, thân và la cüa MNC cô chüfa Alcaloid, saponin, duông khü, acid amin, sterol, riêng lâ cô chüa tanin. Trong dô, ngoài thành phân chmh là Alcaloid côn cô mot luçfng dâng kë Saponin [9]. 1.1.4. Tâc dung sinh hoc. - Tâc dung khâng khuân: Hoàng liên ô rô chüa mot luong lôn Berberine và Palmatin nên cô tâc dung khâng khuân khâ manh [1,2,3,16], ûc ché duoc su phât triën cüa nhiêu loài vi khuân nhu: Staphylococcus aureus, Shigella dysenteriae, Shigella paradysenteriae, Bacillus tuberculosis, Streptococcus hemolytycus, Diplococcus pneumoniae, Bacillus subtilis, Bacillus proteus..... Hoàng liên ô rô moc tai Dèo Giô - Tînh Cao Bàng cüng dâ duoc nghiên cüfu tâc dung khâng khuân vôi ket quâ nhir sau: Hôn hop Alcaloid toàn phân à nông dô 5mg/ml cô tâc dung tôt vôi 5/8 vi khuân duoc thü dô là câc chüng: Sarcina. Lutea, Staphylococcus aureus, Staphylococcus aureus Y1? Salmonela typhi, Shigella flexneri. Nuôc hâm và dich chiét toàn phân cüa thân và rê à nông dô 1: 2 côn cho tâc dung manh hün à câc chüng trên [9]. - Tâc dung khâng nâm gây bênh: Dich chiét loài Mahonia aquifolium cô tâc dung ûc ché su phât triën cüa mot sô nâm gây bênh ngoài da [22]. MNC cüng duoc thü tâc dung khâng nâm cho thây cô tâc dung tirong dôi tôt vôi hai chüng Candida Albicans, Saccharomyces cerevisea.[9]. 4 I - Tâc dung chông viêm: MNC dâ duoc thû tâc dung chông viêm câp trên chuôt công trâng [9] cho két quâ: niïôc sàc à lieu 6g/kg thé trong cô tâc dung chông viêm câp trên chuôt gây viêm bâng Carragenin. So vôi Aspirin, thôi gian tâc dung cüa MNC tuy châm hon (Aspirin cô tâc dung ngay ô liêu thû nhâ't, MNC cô tâc dung tù gid thû hai) nhung lai kéo dài hcfn (tâc dung cüa Aspirin chî kéo dài dêh già thû ba côn MNC kéo dài nhiêu già sau dô). - Tâc dung lçfi mât và bâo vê tê'bào gan: Berberin cô tâc dung loi mât, dùng tôt cho bênh viêm tüi mât [2], à liêu 6g/kg thë trong, dich chiét côn cûa thân MNC cô tâc dung loi mât tôi 65,5 % [9]. Cüng dich chiêt côn à liêu 6g/kg côn cô tâc dung bâo vê té bào gan chuôt thf nghiêm khi gây dôc bâng CCL4[9]. Ngoài câc tâc dung trên, Hoàng liên ô rô côn nhiêu tâc dung khâc nhu tâc dung ha huyét âp, ha nhiêt, hung phân tù cung, da dày, ruôt, tâc dung chông ôxy hoâ, tâc dung chông ung thu... [1,2,11,12, 21,23]. 1.1.5. Công dung: Théo Y hoc cô truyên, Hoàng liên ô rô cô vi dàng, trnh hàn, quy vào câc kinh tâm, tÿ, vi, can, thân cô tâc dung thanh nhiêt giâi dôc, tiêu viêm, làm se [1,16]. Théo kinh nghiêm dân gian, nuôc sàc cüa Hoàng liên ô rô cô tâc dung chüa ly, tiêu chây, ân uông không tiêu, viêm gan, vàng da. [14,16]. Quâ cô tâc dung loi tiëu [6]. Dich nuôc nâu dâc rûa bên ngoài dë tri viêm da, di ùng, lô ngûa [6,11,16]. Ngoài ra, côn duoc dùng dë chüa dau mât, câm lanh, dau hong và dau ràng [11,16]. Trong sô nhüng loài thuôc chi Mahonia, cô mot loài duoc câc nhà khoa hoc trên thé giôi hét sûc quan tâm dô là M. aquifolium. Nhân dân vùng Bàc Mÿ thudng dùng loài này dë chüa câc bênh nhu sot, àn không tiêu, tiêu chây, viêm khôp, câc bênh gan, thân. Dàc biêt côn dùng dë tri câc bênh vê da nhu 5 vây nén, eczema, bênh da khô [18,19,20,21,23]. Do vây, câc nhà khoa hoc dâ di sâu nghiên cuu vê M. aquifolium và dua ra nhiêu két quâ khâ quan nhât là trên bênh vây nén. Trong mot công bô' khoa hoc (1995), Gieler cho biét: khi tién hành diêu tri thü nghiêm trên 433 bênh nhân bi bênh vay nén à 89 khoa da liêu tai Duc bang M.aquifolium thây rang: sau 12 tuân diêu tri, triêu chûng cüa bênh dâ giâm hoâc không côn xuâ't hiên trên 81,1% so bênh nhân thù nghiêm [19], ban dàu vôi 31,1% bênh nhân cô triêu chiîng xâ'u thï sau 12 tuân giâm xuô'ng côn 5,6%. Théo mot bâo cao khâc, Augustin (1996) công bô: 80% bênh nhân sir dung M.aquifolium không cô tac dung phu. [18]. Diêu này cho thây, M.aquifolium vùa cô tac dung tôt trên bênh vây nén lai vùa cô dô an toàn tuofng dôi cao. 1.2. Câc phmmg phâp xâc dinh Saponin. 1.2.1. Dinh ünh. 1.2.1.1. Dira trên tfnh châ't tao bot.[3,5, 15] Dây là tfnh châ't dâc tnrng nhât cüa Saponin. Dua vào tfnh châ't này cô thë: - So bô xâc dinh sir cô mât cüa Saponin trong duçfc liêu: Cho vào ong nghiêm mot liïçfng nhô bot duoc liêu (hoâc dich chiê't duçfc liêu), thêm nuôc, làc manh 5phut. De yên, quan sât hiên tiïçmg tao bot, néu côt bot bên vüng sau 15 phüt thî so bô nhân dinh cô Saponin trong duoc liêu. ^ - So bô nhân dinh Saponin triterpenoid hay Saponin steroid: Dich chiê't Saponin cho vào hai ô'ng nghiêm, ô'ng 1 thêm acid HC1, ô'ng 2 thêm NaOH. Làc manh, nê'u côt bot à ô'ng 1 cao hon hoâc bâng ô'ng 2 thï so bô nhân dinh là Saponin triterpenoid, néu côt bot à ô'ng 2 cao hon là Saponin steroid. - Xâc dinh chî so tao bot cüa diïçfc liêu: Chî sô tao bot là sô ml nuôc dë hoà tan saponin trong lg nguyên liêu cho mot côt bot cao 1cm sau khi làc và doc (tien hành trong diêu kiên quy dinh) [15]. 6 1.2.1.2. Dua trên tînh chât phâ huyêt: [3,5,15] Dây cüng là môt tînh chât dâc trung cüa hâu hét saponin, tuy nhiên cüng cô mot vài saponin không thé hiên rô tînh chât này. Dira trên tmh chât này cô thé: - So bô xâc dinh sif cô mât cüa Saponin trong duçfc lieu: Cô thé kiém tra tînh chât phâ huyét cüa Saponin trên lam kînh, trên thach, hay ông nghiêm. + Trên lam kînh: nhô 1 giot dich chiét duoc liêu lên mot lam kfnh cô chüa mâu, quan sât trên kînh hiën vi nêu cô Saponin sê thây hiên tuçrng hông câu bi phâ vô. + Trên thach mâu: nhô dich chiét vào câc lô dâ duc sân trên dïa thach mâu, néu dich chiét cô Saponin, sau vài giô sê thây vông phâ huyét. + Trên ong nghiêm: cho dich chiét duoc liêu vào mot ông nghiêm cô chüa mâu, làc dêu, de lâng. Nêu dich chiét cô saponin và saponin dü manh dé phâ vô hông câu, sau vài giô sê quan sât thây dung dich trong ông nghiêm cô màu hông dô. Néu saponin chua dü manh dé phâ vô hông câu, so sânh vôi ông chüng cô chüa mâu và nuôc muôi sinh lÿ sê thây liïçmg hông câu à ông thü tüa ît hon. - Xâc dinh chî so phâ huyêt: Dua vào tmh chât phâ huyét nguôi ta cô thé xâc dinh CSPH cûa saponin. Chî sô phâ huyét là sô ml dung dich dêm cân thiét dé hoà tan saponin cô trong lg duoc liêu gây ra su phâ huyét dâu tiên và hoàn toàn dôi vôi mot thü mâu dâ chon (tien hành trong dieu kiên quy dinh) [3,15]. 1.2.1.3. Câc phân ûng màu:[3,8,15] • Phân ûng chung: - Phân ûng Liebermann - Burchardat: Chât thü trong Chloroform thêm hôn hop anhydrid acetic, chloroform (dé ô 0°C) và acid Sulfuric dâc, xuât hiên câc màu xanh da trôi, lue, hông, cam, dô bên vüng trong 1 thôi gian (phân ûng dâ edi tiên). Hoâc chât thü hoà tan nông trong anhydrid acetic, thêm acid sulfuric dâc theo thành ông nghiêm thây xuât hiên môt vông màu tim dô, mâu nâu hay nâu dô à bê mât phân câch (phân ûng co diên). 7 - Phân üng Salkowski: Hoà tan chat thü trong acid sulfuric dâm dàc së cô màu thay doi tùf vàng sang dô lof, xanh là hay xanh tim. - Phân üng Molish: Chat thü tâc dung vôi dung dich a-naphtol trong Ethanol. Thêm acid Sulfuric dâc theo thành ông nghiêm thây xuât hiên môt vông màu tim. - Phân üng Lifschutz: Chat thü hoà tan trong acid acetic, thêm Benzoylhydroperoxyd, dun sôi môt vài làn. Làm nguôi, thêm acid Sulfuric dàc (cho xuong tân âây) cô mâu tfm - xanh hay xanh la à dây. • Câc phân üng phân biêt Saponin steroiâ và Saponin triterpenoid: - Phân üng Resenhein: Saponin triterpenoid tâc dung vôi acid trichloacetic 20% trong Chloroform sê cho mâu tim chuyën sang xanh la sau tù 10-20 phüt. - Phân üng Rosenthaler. Saponin triterpenoid tâc dung vôi vanilin 1% trong Ethanol thêm acid HC1, ha nông së cô màu tim hoa cà. - Phân üng Carr-Price. Saponin steroid tâc dung vôi Antimon Trichorid trong Chloroform së cho màu hông hoâc dô. Ngoài câc phân üng trên côn nhiêu phân üng khâc dë phât hiên Saponin và phân biêt 2 loai Saponin. 1.2.1A. Khâ nâng tao phüc vôi Cholesterol: Dây cüng là môt tinh chat rat dàc tnmg cüa Saponin [3,15]. Do dô, cô thë dinh tinh Saponin bang câch cho tâc dung vôi Cholesterol, phüc hop giüa Saponin và Cholesterol së kêt tüa xuông dây ông nghiêm. Thông thircmg, câc Saponin steroid tao phüc tôt han Saponin triterpenoid. 8 1.2.1.5. Sâc kÿ: • Sâc kÿ lôp mông - Chat hâp phu: Silicagen GF254 365. - Hê dung môi: + Vôi Saponin, cô thé dùng câc hê: n - Butanol bâo hoà nuôc n - Butanol : Acid Acetic : Nuôc (4:1:1) n - Butanol: Ethanol: Nuôc (4:1:4) Xyclohenxan : Ethylacetat (4: 6) Chloroform : Methanol : Nuôc (65:35:10) + Vôi Sapogenin, cô thé dùng câc hê: Chloroform : Methanol (19:1) Chloroform : Aceton (9:1) Chloroform : Ethylacetat (4:1) Chloroform : Ether ethylic (1:1) n - Hexan : Aceton (4:1) - Thuôc thür hiên màu: Cô thé hiên màu bang câc thuôc thû : Carr - Price, Liebermann-Burchardat, Salkowski, Vanilin 1%/côn. Sau khi phun thuôc thur, sây bân mông ô nhiêt dô 110°C tù 5-10 phüt. • Sâc kÿ giây: Mot sô Saponin trung tfnh và acid cô thé dinh tfnh bàng sàc kÿ giây cho két quâ tâch rat tôt. - Giây sàc kÿ : Whatman sô 1 cô hoâc không cô tam Formamid. - Hê dung môi : Cô thé sur dung câc hê dung môi sau: n - Butanol: Ethanol: amoniac 25% (10:2:5) Chloroform: Tetrahydrofuran: pyridin (5:5:1) n - Butanol : acid acetic bàng: nuôc (4:1:5) Chloroform: Benzen (1:1) 9 Thudc thü hiên màu: Sàc kÿ giây dê bi phâ huÿ bai acid H2S04nên thuông hay su dung câc thudc thu: acid phosphotungstic, acid phosphomolypdic, acid trichloracetic. Ngoài SKLM, SKG, Saponin côn cô thë duoc xâc dinh bàng câc phuong phâp khâc nhu: Sàc kÿ khi (GC), HPLC, ph6 hông ngoai, pho tir ngoai, pho khoi... [15]. 1.2.2. Dinh luong. Saponin thuông duoc dinh luong theo câc phuong phâp sau: 1.2.2.1. Phuong phâp cân. [3] Saponin toàn phân duoc chiét kiêt bàng mot so dung môi hùu co: bot duoc liêu chiét loai béo bàng Ether dàu, sây khô, chiét kiêt hoat chât bàng Methanol 80%, cât thu hôi dung môi, lôp nuôc côn lai duoc làc vôi n - Butanol, cô n - Butanol dén càn, hoà tan trong mot luong toi thiëu Methanol, ket tûa saponin bàng câch thêm tù tù Aceton. Rua tua bàng Aceton. Luong tua thu duoc dem sây khô dén khoi luong không doi. Cân, xâc dinh hàm luçmg Saponin toàn phân theo duoc liêu khô tuyêt doi. 1.2.2.2. Phiïcfng phâp do quang: [3] Mot vài saponin, cô thë dinh luong bàng phuong phâp do quang. Vôi Saponin triterpenoid cô thë dùng thudc thü vanilin - sulfuric dë lên màu roi dinh luong. Vôi Saponin steroid nhôm spirostan dùng mot Aldehyd cô nhân thom và acid Phosphoric dë dinh luong. Câc dân chât À5lên màu bàng thudc thü FeCl3- H3P04 dë dinh luong. Nhîn chung, phuong phâp này hay dùng dë dinh luong riêng biêt câc sapogenin sau khi tâch bàng sàc kÿ giây hoàc sàc kÿ lôp mông. Ngoài hai phuong phâp trên, saponin côn cô thë dinh luong bàng phuong phâp HPLC [15]. 10 PHAN 2 THlTC NGHIÊM VÀ KÊT QUÂ 2.1. Nguyên vât liêu và phuong phâp nghiên curu. 2.1.1. Nguyên vât liêu. - Ditçfc liêu: Thân Hoàng liên ô rô duçfc lây tai Dèo Giô - Tïnh Cao Bang vào khoâng thâng 10; sau dô duoc phoi khô và nghiên nhô dë làm nguyên liêu dùng cho nghiên cùu. - Hoâ châ't dat tiêu chuân phân tich: + Methanol, Ethanol, Ether dâu hoâ, Chloroform, Butanol, Nuôc cât.... do phông vât tu truông Dai hoc Duoc cung câp. + Solasonin chuân, Diosgenin chuan do Phông phân tich, tiêu chuân - Viên duçfc liêu (Bô Y Tê) cung câp. + Bân sàc kÿ lôp mông Silicagen GF254 (MERCK). - Phirong tiên: + May cât quay BÜCHI waterbath B480 (Dûc). + May xâc dinh dô âm Presica PH - HA60 (Thuy Si) +Tu sây Memmert. + May do bien déi thë tich 7140 PLETHYSMOMETTER - UGO BASILE (Dûc). + Câc dung eu thuy tinh: Shoxlet 150ml, 500ml; côc cô mô .... - Vi nâm : Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae, Aspegilus niger do T6 Vi sinh - Bô môn Công nghiêp Duoc cung câp (lây tù Viên da liêu trung irong). - Chuôt công trâng: Câ hai giông, khoê manh, thuàn chüng, trong ltfçfng 100 - 120g do Hoc viên Quân y 103 cung câp. 11 2.1.2. Phuong phâp nghiên cûu: 2.1.2.1. Sa bô xâc dinh mâu cây nghiên cûu. MNC duoc Nguyên thi Hang sa bô xâc dinh tên khoa hoc bàng câch so vôi mâu hru tai Viên duoc liêu [9]. 2.1.2.2. Nghiên cûu hoâ hoc. - Dinh tfnh Saponin bang câc phân ûng chung và phân ûng dâc hiêu [3,8,15]. - Dinh tfnh Saponin và Sapogenin bàng phuong phâp SKLM. - Dinh luong Saponin toàn phân bàng phuong phâp cân. [3] Duoc liêu duoc chiét kiêt h^««. bàng Methanol 80%, thu hôi Methanol, dich nirôc côn lai làc vôi n - Butanol dén khi lôp n - Butanol trong. Dich n-Butanol cô dén càn, hoà tan càn trong mot luong tôi thiëu Methanol, tua Saponin bàng câch cho tir tuf mot luong Aceton (gâp 10 làn). Rua tua Saponin bàng Aceton, sây dén khôi luong không doi, cân, tfnh hàm luong theo duoc liêu khô tuyêt dôi. * Kê't quâ: Hàm luong Saponin toàn phân duoc tfnh theo công thüc: a x 100 (1) A= m x (1- b) Vôi: A: Hàm luong hoat chat trnh theo duoc liêu khô tuyêt dôi. (%) a : Khôithuduoc (g) m : Khôi luong duoc liêu dem chiét (g) b : Hàm àm cüa duoc liêu (%) Két quâ dinh luong duçfc xü lÿ thông kê theo mue2.1.2.4. 12 2.1.2.3. Nghiên cûu tâc dung sinh hoc. • Thü tâc dung khâng nâm [7,13] Thü tâc dung khâng nâm theo phuong phâp khuyéch tân trên thach, khâ nâng üc ché nain duoc dânh giâ bàng duông kmh vông vô nâm cüa câc dung dich thü. • Thü tâc dung chong viêm : theo phuong phâp cüa Winter [24]. Thü thuôc trên chuôt công trâng theo ducfng uông. Gây viêm chân chuôt bàng Carrageenin. Mûc dô viêm biëu hiên bàng dô phù. Do thë iïch chân chuôt tai thôi diëm 3 giô sau khi gây viêm. Tmh tÿ le phù chân chuôt tai thôi diëm trên. Thuôc cô tâc dung chong viêm khi làm giâm tÿ le phù chân chuôt à lô thü so vôi lô tràng tai thôi diëm nghiên cüu vôi dô tin cây 95% (P Phân ûng Liebermann - Burchardat. Cho 1ml dich A vào mot ong nghiêm, cô câch thuÿ dén cân, hoà tan trong 1ml anhydrid acetic, dun nông. Thêm tù tir 1ml H2S04 theo chiêu doc cüa ông nghiêm, thây xuât hiên môt vông màu nâu dô giûa bê mât phân câch. > Phân ûng Salkowski: Cho 1ml dich A vào mot ông nghiêm, cô dén cân. Thêm vào ông nghiêm 1ml Chloroform, dun nông, thêm 1ml acid Sulfuric dâc (d=l, 76) theo chiëu doc cüa ông nghiêm thây xuât hiên mot vông màu hông dô ô bê mât phân câch. 16 > Phân ûng Hirchshon: Cho vào ong nghiêm 1ml dich A, thêm 1ml acid Trichloacetic, dun câch thuy khoâng 5 phüt, thây dung dich chuyën tù màu vàng sang màu dô. * Nhân xét: Qua câc phân ûng dinh tinh trên, sa bô thây râng trong thân cüa Hoàng liên ô rô moc tai Dèo Giô - Tinh Cao Bâng cô chûa Saponin và là Saponin steroid. • Sâc kÿ lôp mông: > Saponin. + Dich châm sàc kÿ: Tüa Saponin toàn phân (tua S) thu duac tù quy trînh chiét xuât biëu diên si à sa dô 2.2 (mue 2.2.2) duçfc hoà tan trong MeOH làm dung dich châm sâc kÿ. + Chât hâp phu: Silicagel GF254 (MERCK), kfch thuôc 3x10cm. + Hê dung môi/Saponin duac chay thâm dô vôi câc hê dung môi sau: SI: S2: S3: S4: S5: S6: S7: S8: S9: S10: Sll: S12: Chloroform : Methanol: nuôc Chloroform : Methanol Chloroform : Aceton Chloroform : Ethanol : Amoniac 1%/H20 n - Butanol bâo hoà nuôc CycloHexan : Ethylacetat Ethyl acetat : Acid acetic : Nuôc n - Butanol : Ethanol n - Butanol : Acid formic: Ethanol n - Butanol : Ethanol : Nuôc n - Butanol : Ethanol n - Butanol : Acid acetic : Ethanol (65 : 35 : 1 (8:2) (4:1) (2 :2 :1 ) (4:6) (8 :2 :1 ) (10 : 2) (50 : 3 : 10 (4 :1 :4 ) (5:3) (10 : 1 : 3) % S J O . ùT- l \ •\V*.\ i 17 i< L y 0 Sau khi bay hoi dung môi à nhiêt dô phông, ban mông duçfc phun hiên màu bàng câc thuôc thu: Tl: T2: T3: Vanilin 1% trong côn + 2ml H2S04 H2S0410% trong côn Liebermann - Burchardat (lm l H2S04, 20ml anhydrid acetic, 50ml Chloroform) Sau khi phun thuôc thu, bân mông duoc sây cf nhiêt dô 110°C trong 10 phüt. * Két quâ: (ânh 2.4 A, B) + Thuôc thû Tl cho két quâ hiên màu tôt nhât. +Màu sàc và Rf cüa câc vét duçfc ghi eu thé trong bâng 2.3. Bang 2.3. Kët quâ SKLM cüa Saponin 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Xanh lue Xanh lue Xanh lue Xanh lue Xanh lue Xanh lue Xanh lue Xanh lue Xanh lue Xanh lue Rf Hê S9 0,00 0,17 0,23 0,26 0,31 0,37 0,41 0,47 0,54 0,66 18 Hê S12 0,00 0,13 0,19 0,28 0,32 t— H O TT Màu 0,47 0,59 0,66 0,76 > Sapogenin. - Dich sâc kÿ: Tüa saponin toàn phân thuÿ phân bàng H2S04 7% trong 6 giô. Dich thuÿ phân dë nguôi, pha loâng vôi nuôc, làc vôi Qiloroform dë chiét Sapogenin. Cô dâc làm dung dich chay sâc kÿ. - Chât hâp phu: Silicagel GF254 (MERCK) - Hê dung môi: Sapogenin duoc chay thàm dô vôi câc hê dung môi sau: S’1 S’2 S’3 S’4 S’5 S’6 S’7 S’8 Chloroform: Aceton Chloroform: Ethyl acetat n - Hexan: Aceton Ether: Chloroform Benzen: Ethyl acetat Benzen: Aceton Xyclohexan : Ethyl acetat Chloroform: MeOH (4:1) (4:1) (4:1) (1:1) (1:4) (4:1) (7:3) (19: 1) Sau khi chay sàc kÿ, dë ban mông khô tu nhiên à nhiêt dô phông. Hiên màu bàng thuôc thü Tl, sây à nhiêt dô 120°C trong 10 phüt. * Kê't quâ: + Hê S’8 cho vét tâch tôt nhât vôi 9 vét (ânh 2.4 C) + Màu sàc và Rf cüa câc vét duoc ghi eu thë trong bàng 2.4. + Trên Sàc kÿ dô không thây cô vét nào trùng vÿfi So sânh vôi Solasonin và Diosgenin chuân (ânh 2.4 D). u 19 TT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Bâng 2.4. Kê't quâ SKLM cüa Sapogenin Màu Rf Nâu dâm 0,00 Xanh da trôi 0,06 Nâu 0,13 Xanh là dâm 0,23 Tim nhat 0,32 Nâu nhat 0,51 Xanh la nhat 0,64 0,78 Hông Tim than 0,99 9 2.4. Sâc' kÿ dô cua ? Saponin và Sapogenin Anh éA l 1 B A Trong âô: A: Sàc kÿ dô Saponin hê SI2 B. Sâc kÿ dô Saponin hê S9 C: Sâc kÿ dô Sapogenin hê S’8 D: Sâc kÿ dô so sânh cüa Sapogenin (1) vôfv §olasoni chuân (2) và Diosgenin chuân (3) hê S’8 Cân 8g bôt duçfc liêu, cho vào bînh non cô dung tich 500ml dâ chüa sân 100ml nuôc soi, giù cho soi nhe trong 30 phüt. Dë nguôi, loc, thêm nuôc cho du 100ml. Lây 10 ông nghiêm chiêu cao 16 cm, duông kmh 16mm, cho vào câc ông nghiêm dô làn luçft 1, 2, 3... 10 ml dich chiét, thêm nuôc cât vào môi ông cho dü 10ml (bàng 2.5). Làc manh câc ông nghiêm theo chiêu doc trong 15 giây, môi giây 2 làn làc. Dë yên 15 phüt roi do chiêu cao cüa câc côt bot. Bang 2.5. Thi nghiêm xâc dinh CSTB Dich chiét saponin (ml) Nuôc cât (ml) Tong so 1 1 9 10 2 2 8 10 3 3 7 10 4 4 6 10 5 6 7 5 6 7 5 4 3 10 10 10 8 9 10 8 9 10 2 1 0 10 10 10 Chî sô tao bot duoc tfnh theo công thüc. A 10 x 1 CSTB = ----------------axC Vôi: a : ông cô côt bot 1cm ' sàc. C: nông/'— dô'xnuôc * Két quâ: Ông sô 7 cô côt bot cao 1cm . Vây, chî sô tao bot là: CSTB = 10 x 1 ----------------- = 18 7 x 0,08 • Xâc dinh chî sôphâ huyét. > Chuân bi: - Pha dung dich nuôc muôi sinh lÿ 0,9%: Cân 9g NaCl, cho vào môt bînh dinh müc 100ml, cho nuôc dén vach làc dêu. Lây 10 ml dung dich này cho vào mot bînh dinh mire 100ml khâc, cho nuôc dén vach làc dêu duoc dung dich muôi dàng truong 0,9%. - Pha dung treo mâu 2%: Lây 5ml mâu thô cho vào mot ông nghiêm chira sàn 0,5 ml Natri Citrat 3,65%, li tâm, bô phân huyét tUüng, lây phân hông càu, rira sach hông càu bàng dung dich NaCl 0,9%, thêm dung dich NaCl 0,9% vào hông càu dâ li tâm cho dü 5 ml. Hüt 2ml cho vào môt bînh dinh müc 100ml, thêm NaCl 0,9% dén vach, làc dêu. - Pha dung dich Saponin: Nguyên liêu dâ rây qua rây 0,5mm, cân chrnh xâc lg, cho vào bînh non, thêm 100ml NaCl 0,9% dun câch thuÿ 30 phüt. Loc, pha dén thë tfch chrnh xâc (100ml) vôi dung dich NaCl 0,9%. > Thü sa bô: Pha câc hôn hçfp theo bâng 2.6\ Bâng 2.6. Thi nghiêm sa bô xâc dinh chî so phâ huyét I 0710 0,90 1;00 2?00 Ong Dung dich chiét duoc liêu (ml) (ml) Dung dich dêm Dung treo mâu 2% (ml) Tong sô (ml) II 0,20 0,80 1,00 2?00 ni 0,50 0^0 1,00 2,00 IV 1,00 0,00 1,00 2,00 Làc nhe ngay hôn hop (trânh tao bot). Sau 30 phüt, làc lai môt làn nùa dë yên trong 6 giô à nhiêt dô phông. Quan sât câc ông và xâc dinh ông (hoâc câc ông) cô hiên tuçfng phâ huyét hoàn toàn. 22 * Câch dieu chinh nong dô dich chiê't duç/c liêu dë xâc dinh CSPH duac ghi ô bâng 2.7 Bâng 2.7. Câch dieu chînh nong dô dich chiët duoc liêu de xâc dinh CSPH II III IV + + + + + + Hiên tuang phâ huyêt + + + + Ông I - - - - - - - - - Câch dieu chînh nong dô dich chiët Dùng luang duofc liêu ban dau Pha loâng gâp dôi Pha loâng gâp 5 Pha loâng gâp 10 Thû vôi dich chiét dâm dàc han Trong dô: - : Không cô hiên tuçfng phâ huyét hoàn toàn + : Cô hiên tuang phâ huyét hoàn toàn Sau khi thay doi dich chiét duac liêu, làm lai thi nghiêm sa bô tir dau dë xâc dinh luçfng duac liêu thich hap cho thi nghiêm. * Kêt quâ: Nhièu lan thu cho thây vôi dung dich 5% ông IV cô hiên tuang phâ huyét hoàn toàn. Do vây, dùng dich chiét duoc liêu 5% dë xâc dinh CSPH. 23 > Thï nghiêm quyet dinh. Lây 20 ông nghiêm nhô (côn goi là ong phâ huyê't), dânh sô' thur tu rôi pha câc hôn hop theo bàng 2.8. Bàng 2.8. Thi nghiêm quyet dinh xâc dinh CSPH Djch chiét 5% DD NaCl 0,9% Dung treo mâu 2% Ông (ml) (ml) (ml) 0,05 1,00 0,95 1 0,10 0,90 1,00 2 0,15 1,00 0,85 3 0,20 1,00 0,80 4 0,25 0,75 1,00 5 0,70 1,00 0,30 6 1,00 0,35 0,65 7 1,00 0,40 0,60 8 1,00 0,45 0,55 9 1,00 0,50 0,50 10 1,00 0,45 0,55 11 1,00 0,60 0,40 12 1,00 0,65 0,35 13 1,00 0,30 0,70 14 1,00 0,25 0,75 15 1,00 0,20 0,80 16 1,00 0,15 0,85 17 1,00 0,10 0,90 18 1,00 0,05 0,95 19 1,00 0,00 1,00 20 24 Sau khi pha, làc khë ngay hôn hçfp dë trôn dêu (trânh tao bot). Sau 30 phüt làc lai mot làn nüa. Sau 24 giô, doc kêt quâ. Tîm ong nghiêm dau tiên cô hiên tuçfng phâ huyét hoàn toàn. Chî so phâ huyét duçfc tinh theo công thurc: 2 CSPH = -----------------CxX Vôi: CSPH : Chî sô phâ huyét C : Nong dô dung dich duoc liêu X : So ml dung dich duoc liêu cho vào ông nghiêm mà ô dô gây ra hiên tuçfng phâ huyét dàu tiên và hoàn toàn * Kê't quâ: ông sô 16 là ông dàu tiên cô hiên tuçfng phâ huyét hoàn toàn. Vây, chî sô phâ huyét là: 2 CSPH = ------------ = 50 0,05 x 0,80 22.2.2. Chiët xuâ't: • Quy trînh 1 [3]. - Mô tâ quy trînh: Cân 20g bôt duçfc liêu, chiét vôi Ether dàu hoâ bâng Sb >xlet trong 8h dë loai béo, dë duçfc liêu khô tu nhiên, chiét tiép Shoxlet bàng hôn hçfp Methanol: Nuôc (4:1) trong 24h. Dich chiét thu duçfc dem cât thu hôi dung môi, luçfng nuôc dâm dàc côn lai pha loâng bâng nuôc nong, dë nguôi, loc loai câc tap chat không tan trong nuôc nguôi. Dich nuôc loai béo làn 2 bàng Ether dàu hoâ, bôc hoi cho het ether dàu. Làc vôi n-Butanol dén khi lôp n-Butanol trong, cât thu hôi n-Butanol dén càn. Hoà tan cân trong mot luçfng toi thiëu Methanol, thêm tuf tù mot luçfng Aceton gâp 10 làn, thu duoc kêt tua Saponin toàn phàn (So do 2.1). 25 - S& dâ quy trinh : Sa dô 2.1. Quy trinh 1 MeOH Ether dâu Dich nuôc n- Butanol Aceton Bôt ducrc liêu Ether dâu ^ Chiê't Shoxlet 8 giô» Bôt duoc liêu dâiloai béo MeOH: B ,0(4:1) ^ Chiê't Shoxlet 24 gicf Dich MeOH Cât thu hôi dung môi Dich nuôc dâm dâc H20 nông, dë nguôi, loc loai tap Dich nuôc Ether dâu Dich nuôc n-Butanol n-Butanol Câ't thu hôi dung môi Cân Saponin toàn phân MeOH I Dich MeOH 1 Aceton Tüa Saponin toàn phân Sau khi thur dinh tmh bàng câc phân ûng màu và sàc kÿ lorp mông chüng tôi phât hiên cô Alcaloid lân trong luong tüa Saponin toàn phân. Khi tiên hành tinh chê' thây ràng luong Alcaloid lân nhiêu gây khô khàn rât lôn cho viêc tinh ché Saponin. • Quy trinh 2: Loai Alcaloid truôc khi chiét Saponin trên ca sô quy trînhl 26 Sff dô 2.2: Quy trinh 2 Bôt duoc liêu Kiêm hoâ 12 gicf NH4OH 10% Bôt duoc liêu dâ kiêm hoâ I Cloroform V Chiét Shoxlet 10 gicf 1 ______ __ Bôt dtfcfc liêu dâ loai Alcaloid MeOH: H2Q (4:1 ) Chiét Shoxlet 10 gicf Dich MeOH MeOH -J Cal thu hôi dung môi Dich nuôc dâc H20 nông, dë nguôi, loc loai tap Dich nuôc Ether dàu VvEther dàu Dich nuôc Dich nuôc n-Butanol Dich n-Butanol n- Butanol Cât thu hôi dung môi Cân toàn phân MeOH Dich MeOH 1 y r Két tinh Alcaloid Aceton Tua Saponin toàn phân m tn o Rira bàng Cloroform 3 lân 2.2.2.3. Dinh luang. Sau khi tien hành chiét xuât theo quy trînh trên (Sa dô 2.2) thu duçfc tua S, sây tua à 80°C tôi khoi luang không doi, cân. Hàm luçfng Saponin toàn phân duoc tmh theo công thtfc (1) trong mue 2.1.2.2. Song song vôi quâ trînh dinh luçfng, tién hành xâc dinh hàm âm cüa duoc liêu, làm 3 làn lây két quâ trung bînh là 4,3%. Dinh luçmg Saponin toàn phân vôi 6 mâu và cho câc két quâ nhu bàng Bâng 2.9. Kët quâ dinh luang Saponin toàn phân Hàm luong Saponin Khoi luang TT Khoi luang Hàm âm toàn phân duac liêu duac liêu Saponin toàn phân (%) (%) (g) (g) 0,494 2,57 20,08 4,3 1 2,70 4,3 0,520 20,14 2 2,60 4,5 0,499 3 20,09 0,504 2,62 20,12 4,3 4 2,65 20,08 4,3 0,509 5 2,68 20,15 4,3 0,516 6 Trung bînh 2,64 ± 0,02 28 2.2.3. Tâc dung sinh hoc: 2.2.3.1. Thü tâc dung khâng nâm: • Chuân bi nguyên liêu và môi tnrùng: > Môi tnrùng nuôi cây: Môi trudng Sabouraud. Pepton 10g Glucose 20g Thach 15g Nuôc cât 1000ml PH= 5,6 ± 0,2. > Vi nâm: Câc chüng nâm thü nghiêm gôm: Candida albicans (CA), Saccharomyces cerevisiae (SC), Aspegilus niger (AN). Câc chüng nâm truôc khi thf nghiêm duoc cây vào môi trucmg Sabouraud long, dë à nhiêt dô 28°C trong 24h cho phât triën tôt. Riêng AN duoc pha vào dung dich Tween 5% truôc khi do môi trudng thach. > Chuân bi mâu thü: Saponin toàn phân cüa thân cây Hoàng liên ô rô duoc thü à câc nông dô tuong duong vôi cao 3:1, 2:1, 1:1, 1:2. > Chuân bi mâu chüng: - Dung dich Nystatin lOOUI/ml (Phâp) trong MeOH. - Dung dich Nipazin 600mg/ml trong MeOH. > Chuân bi câc khoanh giây thü: - Câc khoanh giây sâc kÿ cô duông kfnh 6mm. Tiêt trùng à 120°C trong 30 phüt truôc khi dùng. - Tâm vào câc khoanh giây dâ vô trùng vôi câc mâu thü và chüng dén bâo hoà vôi mot thë tfch nhu nhau. Dë khô à nhiêt dô phông cho bay hoi hét dung môi. 29 • Tien hành. Vôi CA, SC dun 15 ml môi trucmg Sabouraud dàc, dë nguôi dén nhiêt dô 45-50°C trôn dêu vôi 5ml môi trucmg Sabouraud long dâ nuôi cây câc chüng nâm, riêng AN trôn môi trucmg Sabouraud dàc vôi 5ml dung dich Tween 5% dâ pha chüng, dd ra dïa Pétri, dë 30 phüt à nhiêt dô phông cho bè mât thach khô. Dàt câc khoanh giây dâ tâm chât thir lên bê mât thach theo so do ghi rô trong bang 2.10. Môi mot chüng nâm duoc làm trên 3 dïa Pétri, lây két quâ trung bïnh. Bang 2.10. Sff dô bô tri câc mâu thü tâc dung khâng nâm 6 Vi tri 4 5 1 2 3 Chât thü Nystatin Nipazin Cao 1:2 Cao 1:1 Cao 2:1 Cao 3:1 Câc dïa sau khi dàt mâu dë vào tü âm à nhiêt dô 28°C/ 24h. • Két quâ: Sau thôi gian nuôi cây, câc dïa thach duoc lây ra, do ducmg krnh vông vô nâm kl hiêu là d (mm), két quâ biëu thi à bàng 2.11 và hnh 2.5. Ânh 2.5. Tâc dung khâng nâm cüa Saponin toàn phân Anh 2.5. b. Saccharomyces Cerevisiae Anh 2.5. a. Candida Albicans ? 9 30 Bâng 2.11. Kêt quâ thükhâng nam cüa Saponin toàn phân TT 1 2 3 4 5 6 Dung dich thû Nystatin Nipazin Cao 1:2 Cao 1:1 Cao 2:1 Cao 3:1 CA d (mm) 8,35 + + + 6,35 6,39 SC d (mm) 7,78 + 1 + + 6,42 7,43 AN d (mm) - - - - - - Trong dô: + : cô tâc dung ûc ché nâm - : không cô tâc dung ûc ché nâm * Nhân xét: - Vôi CA: dich Saponin toàn phân à nong dô tuong duong cao 2:1, 3:1 cô vông ûc ché CA (d= 9 - 9,5) và bàt dàu cô vông vô nâm nhô (Ânh 2.5.a), chûng tô à nong dô tuong duong vôi cao 2:1 trô lên, Saponin toàn phàn trong MNC cô tâc dung diêt CA, tâc dung này yéu hon Nystatin lOOUI/ml, nhung manh hon Nipazin 600mg/ml. - Vôi SC: Saponin toàn phàn à nông dô tuong duong vôi cao 2:1 bàt dàu cô vông vô nâm, à nông dô tuong duong cao 3:1 cô tâc dung diêt nâm (d=7,43) gàn tuong duong vôi Nystatin lOOUI/ml (d=7,78) và lôn hon nhiêu so vôi Nipazin. Trên câ hai chüng này, dich Saponin tuong duong vôi cao 1:2 và 1:1 chî cô tâc dung urc chê' nâm (Anh 2.5.b). - Vôi AN: tâ't câ câc mâu thû và chûng dêu không cô tâc dung ûc ché hay diêt chüng nâm này. Nhu vây, à nông dô tuong duong cao 2:1 và 3:1, Saponin toàn phàn cô tâc dung diêt SC, CA yéu. 31 2.2.3.2. Thü tâc dung chong viêm. > Mâu thü: Saponin toàn phân thu duoc sau khi kê't tüa hoà tan trong nuôc thành dung dich 4% - dich B. > Tien hành: theo phircfng phâp cüa Winter [24]. - Thü nghiêm duoc tiên hành trên 6 lô chuôt công tràng, trong luong 100-120g/con, câ duc và câi, khoê manh, thuàn chüng, sô chuôt môi lô n=6. + Lô trâng : Uông dung dich NaCl 0,9% vôi liêu lml/lOOg thë trong. + Lô thü 1 (Tj) : Uông dich Saponin toàn phân vôi liêu 0,2g/Kg TT (5ml dich B) tuong duong 7,5g duoc liêu/kg TT. + Lô thü 2 (TJ : Uông dich Saponin toàn phân vôi liêu 0,3g/Kg TT (7,5 ml dich B) tuong duong 11,25g duoc liêu/kg TT. + Lô thü 3 (TJr. Uông dich Saponin toàn phân vôi liêu 0,4g/Kg TT (10ml dich B) tuong duong 15g duoc liêu/kg TT. + Lô thü 4 (TJr. Uông dich Saponin toàn phân vôi liêu 0,6g/Kg TT (15ml dich B) tuong duong 22,5g duoc liêu/kg TT. + Lô chüng (C). Uông dung dich Prednisolon vôi liêu 5mg/Kg TT. - Chuôt duoc cho uông vào câc thôi diëm: + lh30 phüt truôc gây viêm + 30 phüt truôc gây viêm + 30 phüt sau gây viêm. - Tâc nhân gây viêm: Carragenin 3%, tiêm vào gan bàn chân phâi chuôt, môi con 0,1ml. - Do V0 truôc khi gây viêm và Vt sau khi gây viêm 3h bàng mây do bien déi thë iïch 7140 PLETHYSMOMETTER - UGO BASILE (Düc) • Ket quâ: duoc biëu thi trong bâng 2.12. 32 Bâng 2.12. Ty lê phù chân chuôt tai thôi âiém sau 3h TT Trâng Chùmg t2 t4 t3 37,62 1 15,62 18,48 20,48 44,16 0,00 2 21,10 48,91 5,10 23,53 52,94 19,10 3 64,18 10,00 17,71 6,82 23,01 27,39 4 22,73 18,27 35,95 43,37 9,30 15,00 5 40,00 25,92 9,82 32,58 33,72 18,07 6 65,12 15,13 1,16 35,56 37,70 0,00 TB 41,79±7,87 22,31+5,73 14,70±5,08 27,05± 5,27 33,47±6,34 13,26+4,51 G 46,62% 64,83% 35,27% 18,62% 68,27% P >0,05 0,05 >0,05 [...]... cụ Saponin trong duoc liờu ^ - So bụ nhõn dinh Saponin triterpenoid hay Saponin steroid: Dich chiờ't Saponin cho vo hai ụ'ng nghiờm, ụ'ng 1 thờm acid HC1, ụ'ng 2 thờm NaOH Lc manh, nờ'u cụt bot ụ'ng 1 cao hon hoõc bõng ụ'ng 2 thù so bụ nhõn dinh l Saponin triterpenoid, nộu cụt bot ụ'ng 2 cao hon l Saponin steroid - Xõc dinh chợ so tao bot cỹa diùỗfc liờu: Chợ sụ tao bot l sụ ml nuục dở ho tan saponin. .. trong lg nguyờn liờu cho mot cụt bot cao 1cm sau khi lc v doc (tien hnh trong diờu kiờn quy dinh) [15] 6 1.2.1.2 Dua trờn tợnh chõt phõ huyờt: [3,5,15] Dõy cỹng l mụt tợnh chõt dõc trung cỹa hõu hột saponin, tuy nhiờn cỹng cụ mot vi saponin khụng thộ hiờn rụ tợnh chõt ny Dira trờn tmh chõt ny cụ thộ: - So bụ xõc dinh sif cụ mõt cỹa Saponin trong duỗfc lieu: Cụ thộ kiộm tra tợnh chõt phõ huyột cỹa Saponin. .. phõn biờt Saponin steroiõ v Saponin triterpenoid: - Phõn ỹng Resenhein: Saponin triterpenoid tõc dung vụi acid trichloacetic 20% trong Chloroform sờ cho mõu tim chuyởn sang xanh la sau tự 10-20 phỹt - Phõn ỹng Rosenthaler Saponin triterpenoid tõc dung vụi vanilin 1% trong Ethanol thờm acid HC1, ha nụng sở cụ mu tim hoa c - Phõn ỹng Carr-Price Saponin steroid tõc dung vụi Antimon Trichorid trong Chloroform... trờn, sa bụ thõy rõng trong thõn cỹa Hong liờn ụ rụ moc tai Dốo Giụ - Tinh Cao Bõng cụ chỷa Saponin v l Saponin steroid Sõc k lụp mụng: > Saponin + Dich chõm sc k: Tỹa Saponin ton phõn (tua S) thu duac tự quy trợnh chiột xuõt biởu diờn si sa dụ 2.2 (mue 2.2.2) duỗfc ho tan trong MeOH lm dung dich chõm sõc k + Chõt hõp phu: Silicagel GF254 (MERCK), kfch thuục 3x10cm + Hờ dung mụi /Saponin duac chay thõm... cỹa Saponin ton phõn Anh 2.5 b Saccharomyces Cerevisiae Anh 2.5 a Candida Albicans ? 9 30 Bõng 2.11 Kờt quõ thỹkhõng nam cỹa Saponin ton phõn TT 1 2 3 4 5 6 Dung dich thỷ Nystatin Nipazin Cao 1:2 Cao 1:1 Cao 2:1 Cao 3:1 CA d (mm) 8,35 + + + 6,35 6,39 SC d (mm) 7,78 + 1 + + 6,42 7,43 AN d (mm) - - - - - - Trong dụ: + : cụ tõc dung ỷc chộ nõm - : khụng cụ tõc dung ỷc chộ nõm * Nhõn xột: - Vụi CA: dich Saponin. .. hon 15 phỹt > Sa bụ xõc dinh Saponin steroid v Saponin triterpenoid Thi nghiờm duoc bụ' tri theo bng 2.1 sau: Bõng 2.1 Thi nghiờm phõn biờt Saponin triterpenoid v Saponin steroid Dich chiờ't (ml) Dung dich NaOH 0,1N Dung dich HC1 0,1N ' Ong 1 5ml 5ml Ong 2 5ml 5ml Lc doc theo ụng nghiờm trong 1 phỹt Kờt qua : Ong 1 cụ cụt bot cao hon ụng 2 * Nhõn xột: So bụ nhõn dinh l Saponin steroid Dira vo tfnh... trờn cụn nhiờu phõn ỹng khõc dở phõt hiờn Saponin v phõn biờt 2 loai Saponin 1.2.1A Khõ nõng tao phỹc vụi Cholesterol: Dõy cỹng l mụt tinh chat rat dc tnmg cỹa Saponin [3,15] Do dụ, cụ thở dinh tinh Saponin bang cõch cho tõc dung vụi Cholesterol, phỹc hop giỹa Saponin v Cholesterol sở kờt tỹa xuụng dõy ụng nghiờm Thụng thircmg, cõc Saponin steroid tao phỹc tụt han Saponin triterpenoid 8 1.2.1.5 Sõc k:... duoc chiột kiờt h ^ô bng Methanol 80%, thu hụi Methanol, dich nirục cụn lai lc vụi n - Butanol dộn khi lụp n - Butanol trong Dich n-Butanol cụ dộn cn, ho tan cn trong mot luong tụi thiởu Methanol, tua Saponin bng cõch cho tir tuf mot luong Aceton (gõp 10 ln) Rua tua Saponin bng Aceton, sõy dộn khụi luong khụng doi, cõn, tfnh hm luong theo duoc liờu khụ tuyờt dụi * Kờ't quõ: Hm luong Saponin ton phõn... phõn nong dụ tuong duong cao 2:1, 3:1 cụ vụng ỷc chộ CA (d= 9 - 9,5) v bt du cụ vụng vụ nõm nhụ (nh 2.5.a), chỷng tụ nong dụ tuong duong vụi cao 2:1 trụ lờn, Saponin ton phn trong MNC cụ tõc dung diờt CA, tõc dung ny yộu hon Nystatin lOOUI/ml, nhung manh hon Nipazin 600mg/ml - Vụi SC: Saponin ton phn nụng dụ tuong duong vụi cao 2:1 bt du cụ vụng vụ nõm, nụng dụ tuong duong cao 3:1 cụ tõc dung diờt... cua ? Saponin v Sapogenin Anh ộA l 1 B A Trong õụ: A: Sc k dụ Saponin hờ SI2 B Sõc k dụ Saponin hờ S9 C: Sõc k dụ Sapogenin hờ S8 D: Sõc k dụ so sõnh cỹa Sapogenin (1) vụfv Đolasoni chuõn (2) v Diosgenin chuõn (3) hờ S8 Cõn 8g bụt duỗfc liờu, cho vo bợnh non cụ dung tich 500ml dõ chỹa sõn 100ml nuục soi, giự cho soi nhe trong 30 phỹt Dở nguụi, loc, thờm nuục cho du 100ml Lõy 10 ụng nghiờm chiờu cao 16