Luận văn nghiên cứ tính sạch pectinase từ canh trường nuôi cây bẻ sau Asperrgillus awamori - chương 4

Luận văn nghiên cứ tính sạch pectinase từ canh trường nuôi cây bẻ sau Asperrgillus awamori - chương 4.

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 44 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 4.1 KHẢO SÁT TINH SẠCH PECTINASE BẰNG PHƯƠNG PHÁP KẾT TỦA 4.1.1 Kết tủa pectinase loại dung môi hữu Trong thí nghiệm này, thực trình kết tủa pectinase từ dịch enzyme thô sau 24 nuôi cấy canh trường bề sâu (xem hình 4.1) Tại thời điểm này, hoạt tính endo-PGase thu cao đạt giá trị 1.224 ± 0.003U/mL Nồng độ protein dịch enzyme tương ứng 0.489 ± 0.0006mg/mL Sau trình ly tâm lọc để tách tạp chất thô hệ sợi mốc, dịch enzyme thô kết tủa với tác nhân ethanol, isopropanol acetone LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 45 Hoạt tính endo-polygalacturonase, U/mL 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 10 15 20 25 30 Thời gian ni cấy, h Hình 4.1 Hoạt tính endo-polygalaturonase từ canh trường nuôi cấy Asp Awamori theo thời gian 4.1.1.1 Kết tủa endo-PGase ethanol Kết thí nghiệm: Tiến hành kết tủa enzyme thô ethanol theo trình tự trình bày phần 3.2.2.1 Kết trình bày bảng 4.1 hình 4.2: Bảng 4.1 Kết tinh endo-PGase ethanol Tỷ lệ Hoạt tính endo-Pgase* (mg/mL) Venzyme/ Vdung môi Nồng độ protein* Hoạt tính riêng (U/mL) (U/mg protein) Hiệu suất thu hồi (%) Độ tinh (lần) 10:90 0.078 1.144 14.609 92.21b 5.77b 20:80 0.074 1.204 16.294 97.02a 6.43a 30:70 0.068 1.005 14.678 80.96c 5.79b 40:60 0.052 0.287 5.493 23.15d 2.17e 50:50 0.009 0.123 13.673 7.95e 4.32c 60:40 0.004 0.036 9.321 2.90f 3.69d Enzyme thô 0.489 1.244 2.544 100.00 1.00 Chú thích: Các giá trị có ký tự (được ký hiệu phía trên) khác chúng ý nghóa (α = 0,05) (*) Nồng độ protein hoạt tính enzyme dung dịch sau tái hòa tan kết tủa LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 46 97.0% 100% 100 92.2% Độ tinh 81.0% Hiệu suất thu hồi, % 80% 90 80 70% 70 60% 60 50% 50 40% 40 30% 30 23.2% 20% 10% Độ tinh sạch, lần Hiệu suất thu hồi (%) 90% 20 5.77 6.43 8.0% 5.79 2.17 2.9% 4.32 3.69 10 0% 10:90 20:80 30:70 40:60 Venzyme:Vdung môi 50:50 60:40 Hình 4.2 Hiệu suất thu hồi độ tinh chế phẩm sau kết tủa ethanol Nhận xét: Từ kết thu được, có nhận xét sau: – Nhìn chung, tăng thể tích ethanol sử dụng (tỷ lệ thể tích Venzyme:Vdung môi thay đổi từ 60:40 đến 20:80) hàm lượng protein kết tủa tăng dần (từ 0.004mg/mL đến 0.078mg/mL) hiệu suất thu hồi enzyme tăng dần (từ 2.9% đến 92.2%) Điều cho thấy rằng, nồng độ dung môi cao khả gây biến tính protein rõ rệt Nhờø đó, lượng protein bị kết tủa nhiều tổng số đơn vị hoạt độ thu hồi tăng lên Tuy nhiên, tăng tỷ lệ thể tích ethanol sử dụng lên cao (tỷ lệ Venzyme:Vdung môi 10:90) lượng protein kết tủa có tăng theo (0.078mg/mL) hiệu suất thu hồi endo-PGase lại giảm xuống (92.21%) Kết khẳng định hàm lượng cồn cao làm cho protein kết tủa triệt để làm vô hoạt số phân tử enzyme – Chúng thấy rằng, tỷ lệ thích hợp để kết tủa enzyme: Venzyme:Vdung môi nằm khoảng từ 30:70 đến 10:90 Khi đó, hiệu suất thu hồi độ tinh chế phẩm dao động khoảng 81-97% 5.77-6.43 lần – Từ kết trên, chọn tỷ lệ Venzyme:Vdung môi = 20:80 tỷ lệ thích hợp để kết tủa enzyme với tác nhân ethanol 20:80 (v/v) Khi hiệu suất thu hồi hoạt tính LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 47 độ tinh chế phẩm đạt giá trị cực đại (97.0% 6.43 lần) Hoạt tính riêng chế phẩm đạt 16.924 U/mg protein Theo nghiên cứu Manachini P.L cộng (1988), tinh endo-PGase từ Rhizopus stolonifer, hiệu suất thu hồi độ tinh chế phẩm sau kết tủa với ethanol theo tỷ lệ 1:2 đạt 77% 9.2 lần Khi so sánh với kết chúng tôi, nhận thấy rằng, thể tích ethanol dùng để tinh endo-PGase từ Asp awamori nghiên cứu cao Dù hiệu suất thu hồi enzyme đạt giá trị cao (97.0% 77%) độ tinh chế phẩm thu thấp 1.43 lần Vì thế, tiến hành khảo sát thêm vài tác nhân kết tủa khác để lựa chọn tác nhân kết tủa enzyme tốt 4.1.1.2 Kết tủa endo-PGase iso-propanol Kết thí nghiệm : Tiến hành kết tủa dịch enzyme thô isopropanol theo trình tự trình bày phần 3.2.2.1 Kết trình bày bảng 4.2 hình 4.3 Bảng 4.2 Tỷ lệ Kết tinh endo-PGase iso-propanol Venzyme/ Vdung môi Nồng độ protein* Hoạt tính endo-Pgase* (mg/mL) (U/mL) 10:90 0.118 20:80 Hoạt tính riêng (U/mg protein) Hiệu suất thu hồi (%) Độ tinh 1.232 10.41 a 98.87 4.09e 0.100 1.241 12.46 99.60a 4.90d 30:70 0.073 1.198 16.44 96.12b 6.53c 40:60 0.052 1.108 21.44 88.95c 8.43a 50:50 0.022 0.419 19.42 33.63d 7.65b 60:40 0.015 0.066 4.47 5.30e 1.78f Enzyme thoâ 0.489 1.244 2.544 100.00 (lần) 1.00 Chú thích: Các giá trị có ký tự (được ký hiệu phía trên) khác chúng ý nghóa (α = 0,05) (*) Nồng độ protein hoạt tính enzyme dung dịch sau tái hòa tan kết tủa LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 100% 98.9% 99.6% 48 100 96.1% 89.0% 90% Hiệu suất thu hồi (%) 90 Độ tinh 80 70% 70 60% 60 50% 50 40% Độ tinh sạch, lần Hiệu suất thu hoài, % 80% 40 33.6% 30% 30 20% 20 10% 4.09 4.90 10:90 20:80 6.53 8.43 7.65 5.3% 10 1.78 0% 30:70 40:60 Venzyme:Vdung môi 50:50 60:40 Hình 4.3 Hiệu suất thu hồi độ tinh chế phẩm sau kết tủa isopropanol Nhận xét: – So với ethanol, isopropanol có phân tử lượng chiều dài mạch carbon lớn Nhờ đó, tính kỵ nước isopropanol cao Điều làm cho có khả làm kết tủa lượng protein nhiều so với ethanol sử dụng với hàm lượng Thật vậy, hàm lượng protein thu tăng dần từ 0.015 đến 0.118mg/mL thay đổi tỷ lệ Venzyme:Vdung môi từ 40:60 đến 10:90 Hiệu suất thu hồi chế phẩm pectinase isopropanol cao so sánh với tác nhân kết tủa ethanol – Khi tỷ lệ Venzyme:Vdung môi 20:80, hoạt tính endo-PGase gần thu hồi hoàn toàn (99.6%) Tuy nhiên, độ tinh chế phẩm thu không cao (4.9 lần) Có lẽ nồng độ dung môi này, protein-enzyme, protein tạp khác dung dịch có khuynh hướng bị kết tủa theo làm giảm hoạt tính riêng chế phẩm Ngoài ra, tương tự ethanol, nồng độ isopropanol cao, khả gây biến tính bất thuận nghịch protein isopropanol xảy làm giảm hiệu suất thu hồi enzyme hoạt tính riêng chế phẩm – Dựa khả tinh chế phẩm chi phí dung môi, định chọn tỷ lệ Venzyme:Vdung môi = 40:60 để tinh endo-PGase Ở tỷ lệ này, độ tinh LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 49 chế phẩm cao (8.43 lần) hiệu suất thu hồi hoạt tính chế phẩm 88.95% 4.1.1.3 Kết tủa endo-PGase acetone Kết thí nghiệm : Tiến hành kết tủa dịch enzyme thô với tác nhân acetone theo trình tự trình bày phần 3.2.2.1 Kết trình bày bảng 4.3 hình 4.4: Bảng 4.3 Kết tinh endo-PGase acetone Tỷ lệ Nồng độ protein* Hoạt tính endo-Pgase* Hiệu suất thu hồi (%) Độ tinh (mg/mL) (U/mL) 10:90 0.137 1.067 7.77 85.70b 3.06b 20:80 0.126 1.205 9.57 96.81a 3.77a 30:70 0.097 1.023 10.52 82.20c 4.14a 40:60 0.068 0.440 6.46 35.37d 2.54c 50:50 0.022 0.111 4.92 8.89e 1.95d 60:40 0.018 0.085 4.81 6.80f 1.95d Enzyme thoâ 0.489 1.244 2.544 100.00 1.00 Venzyme/ Vdung môi Hoạt tính riêng (U/mg protein) (lần) Chú thích: Các giá trị có ký tự (được ký hiệu phía trên) khác chúng ý nghóa (α = 0,05) (*) Nồng độ protein hoạt tính enzyme dung dịch sau tái hòa tan kết tủa 96.8% 100% 90% 100 Hiệ u suấ t thu hồi (%) 82.2% 80 70% 70 60% 60 50% 50 40% Độ tinh sạ ch, lầ n Hiệ u suất thu hồi, % 80% 90 Độ tinh saï ch 85.7% 40 35.4% 30% 30 20% 20 8.9% 10% 3.06 3.77 4.14 10:90 20:80 30:70 6.8% 2.54 1.95 1.95 40:60 50:50 60:40 10 0% LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Venzyme:Vdung môi CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 50 Hình 4.4 Hiệu suất thu hồi độ tinh chế phẩm sau kết tủa acetone Nhận xét: – Acetone tác nhân kết tủa enzyme quan tâm nhiều giá thành rẻ, khả gây biến tinh bất thuận nghịch thấp có độ an toàn cao sử dụng [8, 10] Tuy nhiên, lónh vực tinh pectinase, có nghiên cứu tinh pectinase kết tủa với acetone Vì thế, luận văn này, tiến hành khảo sát khả tinh endo-PGase acetone – Kết trình bày bảng 4.3 cho thấy, endo-PGase kết tủa rấtù tốt với acetone Hàm lượng protein hiệu suất thu hồi tương đối cao Theo quy luật, hiệu suất thu hồi hoạt tính endo-PGase tăng lên tăng lượng acetone sử dụng (tỷ lệ Venzyme:Vdung môi thay đổi từ 40:60 đến 20:80 Ở tỷ lệ Venzyme:Vdung môi = 10:90, hàm lượng protein kết tủa tăng cao hiệu suất thu hồi giảm acetone gây biến tính bất thuận nghịch số phân tử enzyme Tác động xảy tương tự với trường hợp kết tủa ethanol isopropanol – Tỷ lệ Venzyme:Vdung môi thích hợp để hiệu suất thu hồi endo-PGase cao 20:80 Trong đó, độ tinh chế phẩm đạt cao Venzyme:Vdung môi 30:70 – Từ nhận xét trên, có kết luận sơ sau: So với tác nhân ethanol isopropanol, acetone tỏ hiệu trình tinh endo-PGase Độ tinh cao đạt trường hợp kết tủa với tác nhân (tỷ lệ Venzyme:Vdung môi = 30:70) 0.64 0.55 lần so với trường hợp kết tủa ethanol isopropanol hiệu suất thu hồi tương ứng thấp 1.18 1.08 lần Kết tủa pectinase polymer hữu 4.1.2 4.1.2.1 Kết tủa endo-PGase PEG-6000 Kết thí nghiệm: Tiến hành kết tủa dịch enzyme thô với tác nhân polyethylene glycol (PEG 6000) theo trình tự trình bày phần 3.2.2.2 Kết thí nghiệm trình bày bảng 4.4 hình 4.5: Bảng 4.4 Kết tinh endo-PGase PEG-6000 Nồng độ tác nhân Nồng độ protein (mg/mL) Hoạt tính endo-PGase (U/mL) Hoạt tính riêng (U/mg protein) Hiệu suất thu hồi (%) Độ tinh (lần) 25% 0.028 0.106 3.76 8.67a 1.57a 20% 0.018 0.063 3.43 5.13c 1.44b 15% 0.021 0.058 2.82 4.77c 1.18c LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUAÄN 51 10% 0.028 0.083 2.97 6.77b 1.24bc 5% 0.031 0.084 2.72 6.85b 1.16c Enzyme thoâ 0.511 1.222 2.39 100.00 1.00 Chú thích: Các giá trị có ký tự (được ký hiệu phía trên) khác chúng ý nghóa (α = 0,05) (*) Nồng độ protein hoạt tính enzyme dung dịch sau tái hòa tan kết tủa 100% 100 Hiệu suất thu hồi (%) 90% Độ tinh Hiệ u suấ t thu hồ i, % 80% 90 80 70 60% 60 50% 50 40% 40 30% 30 20% 20 10% Độ tinh sạ ch, lầ n 70% 8.7% 6.8% 6.9% 1.18 1.24 1.16 15% 10% 5% 4.8% 1.57 1.44 25% 0% 5.1% 20% 10 Nồ ng độ tá c nhâ n, % Hình 4.5 Hiệu suất thu hồi độ tinh chế phẩm sau kết tủa PEG-6000 Nhận xét: – PEG dung môi có tính háo nước lớn Khi bổ sung vào dung dịch chứa protein, chúng tương tác với lớp vỏ hydrate bao quanh phân tử protein làm giảm khả hòa tan protein Nhờ đó, phân tử protein enzyme kết tủa tách khỏi hỗn hợp – Tuy nhiên, nhược điểm PEG làm tăng độ nhớt dịch enzyme, gây khó khăn cho việc tách kết tủa khỏi dung dịch Nếu sử dụng phương pháp lọc để phân riêng, thời gian lọc kéo dài, sử dụng phương pháp ly tâm phải tác động lên dung dịch lực ly tâm lớn Điều khó thực triển khai quy mô sản xuất lớn Nếu lực ly tâm nhỏ không thu hồi hết lượng kết tủa Trong nghiên cứu này, sử dụng thiết bị ly tâm có bán kính quay 0.3m tốc độ quay 5500vòng/phút , tương đương với gia tốc ly tâm làø 10000g (m/s2) hiệu suất thu hồi pectinase dao động khoảng từ 4.8% đến 8.7% – Nhận xét khả tinh chế phẩm, thấy rằng, độ tinh chế phẩm tăng dao động từ 1.16 đến 1.57 lần LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 52 – Như vậy, theo đánh giá chung, hiệu sử dụng PEG để tinh endo-PGase không cao 4.1.2.2 Kết tủa endo-PGase PG-4000 Kết thí nghiệm: Tiến hành kết tủa dịch enzyme thô với tác nhân polyethylene glycol (PEG 4000) theo trình tự trình bày phần 3.2.2.2 Kết thu trình bày bảng 4.5 hình 4.6: Bảng 4.5 Kết tinh endo-PGase PEG-4000 Nồng độ tác nhân Nồng độ protein* (mg/mL) Hoạt tính endo-PGase* (U/mL) Hoạt tính riêng (U/mg protein) Hiệu suất thu hồi (%) Độ tinh (lần) 25% 0.046 0.152 3.34 12.18a 1.30a 20% 0.041 0.138 3.39 11.03b 1.33a 15% 0.034 0.089 2.60 7.16d 1.02b 10% 0.032 0.117 3.63 9.40c 1.42a Enzyme thô 0.487 1.2480 2.56 100.00 1.00 Chú thích: Các giá trị có ký tự (được ký hiệu phía trên) khác chúng ý nghóa (α = 0,05) (*) Nồng độ protein hoạt tính enzyme dung dịch sau tái hòa tan kết tủa 100% 100 90% Hiệu suất thu hồi (%) 90 80% Độ tinh 80 60% 60 50% 50 40% 40 30 20% Độ tinh sạ ch, lầ n 70 30% Hiệu suấ t thu hồ i, % 70% 12% 20 11% 10% 7% 9% 10 1.30 1.33 1.02 1.42 25% 0% 20% 15% 10% Nồ ng độ tá c nhâ n, % LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 53 Hình 4.6 Hiệu suất thu hồi độ tinh chế phẩm sau kết tủa PEG-4000 Nhận xét: – Tương tự PEG 6000, kết kết tủa endo-PGase với tác nhân PEG-4000 không đạt hiệu cao so với trường hợp sử dụng dung môi hữu Hiệu suất thu hồi enzyme dao động từ 9.40% đến 12.18%, độ tinh tương ứng từ 1.02 đến 1.42 lần – Từ kết thu được, đánh giá phương án tinh endo-PGase loại polymer không khả thi 4.1.3 Kết tủa pectinase loại muối 4.1.3.1 Kết tủa endo-PGase Sodium chloride (NaCl) Kết thí nghiệm: Tiến hành kết tủa dịch enzyme thô với tác nhân muối sodium chloride theo trình tự trình bày phần 3.2.2.1 Chúng thu kết sau (xem bảng 4.6 hình 4.7): Bảng 4.6 Kết tinh endo-PGase sodium chloride Nồng độ NaCl, % (w/v) Nồng độ protein* (mg/mL) Hoạt tính endo-PGase* (U/mL) Hoạt tính riêng (U/mg protein) Hiệu suất thu hồi (%) Độ tinh (laàn) 35% 0.049 0.607 12.29 48.87a 5.30a 30% 0.057 0.417 7.27 33.55b 3.14c 25% 0.098 0.347 3.55 27.94c 1.53e 20% 0.040 0.280 6.98 22.52d 3.01d 15% 0.036 0.232 6.37 18.65e 3.46b Enzyme thô 0.535 1.242 2.32 100.00 1.00 Chú thích: Các giá trị có ký tự (được ký hiệu phía trên) khác chúng ý nghóa (α = 0,05) (*) Nồng độ protein hoạt tính enzyme dung dịch sau tái hòa tan kết tủa LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 61 – Dựa kết thu từ sắc ký đồ, thấy rằng, lượng protein mẫu chủ yếu tập trung vào peak I (phân đoạn 4) III (phân đoạn 10) Tuy nhiên, hoạt tính endo-PGase thu vị trí peak không cao Điều cho phép kết luận peak có chứa protein tạp, chúng bị lẫn vào chế phẩm kết tủa So với protein enzyme, protein tạp tồn với hàm lượng cao Do đó, tách protein khỏi hỗn hợp độ tinh chế phẩm cuối nâng lên đáng kể – Ở phân đoạn 5, 7, giá trị OD280nm đo thấp hàm lượng protein xác định thấp hoạt tính enzyme thu phân đoạn 5, (đặc biệt phân đoạn 6) cao nhiều lần so với phân đoạn khác Từ đó, dự đoán enzyme cần tinh phân bố chủ yếu phân đoạn 5, Khi đó, hoạt tính riêng chế phẩm thu phân đoạn cao đạt đến giá trị tương ứng 104.7, 133.9 90.9U/mg protein Vì vậy, thu hồi phân đoạn chế phẩm thu có hoạt tính riêng cao độ tinh đạt đến 47.2 lần (so với dịch enzyme thô) – Vì hoạt tính enzyme tập trung chủ yếu vào phân đoạn 5, nên tiến hành thu hồi phân đoạn bảo quản điều kiện lạnh đông để chuẩn bị cho bước khảo sát Bảng 4.10 Hiệu suất thu hồi độ tinh pectinase qua giai đoạn tinh phương pháp kết tủa với isopropanol kết hợp với sắc ký lọc gel Thể tích (mL) Enzyme thô Sau kết tủa với isopropanol Sau lọc gel* Protein tổng (mg) Hoạt độ Tổng (U) Hoạt tính riêng (U/mg protein) Hiệu suất (%) Độ tinh 60.0 31.980 76.32 2.386 100% 1.0 60.0 3.295 67.61 20.51 88.6% 8.6 3.0 0.349 39.36 112.63 51.6% 47.2 * Kết thu hồi hoạt tính độ tinh chế phẩm phương pháp lọc gel tính phân đoạn 5, 4.2.2 Kết lọc gel enzyme qua kết tủa với ethanol 2:8 Sau giai đoạn kết tủa với ethanol theo tỷ lệ Venzyme:Vethanol = 2:8 (v/v), từ 60 mL dung dịch enzyme thô với tổng số đơn vị hoạt độ 76.32U, thu lượng kết tủa tương ứng với tổng hoạt độ 73.57U Độ tinh chế phẩm sau kết tăng lên tương ứng 6.6 lần Tiến hành phân tích chế phẩm sau kết tủa sắc ký lọc gel thu kết sau (xem bảng 4.11 hình 4.11): LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 62 Bảng 4.11 Hoạt độ hoạt tính riêng số phân đoạn đo sau lọc gel (mẫu dịch enzyme qua kết tủa ethanol theo tỷ lệ Venzyme:Vethanol = 2:8) Lượng protein (mg) 4.680 1+2 0.009 0.001 9.4 1.036 0.278 3.7 2.576 0.433 5.9 16.351 0.294 55.7 6+7 25.244 0.385 65.5 2.885 0.111 25.9 1.089 0.301 3.6 10+11+12 1.824 1.270 1.4 Toång 51.014 3.073 16.6 3.5 Hoạt tính riêng (U/mg protein) 15.72 Hoạ t tính endo-PGase OD280nm 3.0 4.5 4.0 3.5 OD280nm 2.5 3.0 2.0 2.5 1.5 2.0 1.5 1.0 1.0 0.5 Hoạ t tính endo-PGase, U/mL Mẫu trước lọc gel Hoạt độ tổng (U) 73.57 Phân đoạn 0.5 0.0 0.0 10 15 20 Phân đoạn Số thứ tự phân đoạn Hình 4.11 Đồ thị biểu diễn độ hấp thu (λ = 280nm) hoạt tính endo-PGase phân đoạn trình lọc gel với mẫu enzyme qua kết tủa với ethanol (tỷ lệ 2:8 theo thể tích) Nhận xét: – Hình ảnh sắc ký đồ cho thấy, đường cong OD280nm trường hợp mẫu enzyme kết tủa ethanol có dạng tương tự trường hợp sử dụng isopropanol LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 63 để kết tủa enzyme Đường cong hoạt tính endo-PGase có peak tập trung vị trí phân đoạn 5, 6, Điều lần khẳng định protein-enzyme có chế phẩm mà cần tinh phân bố chủ yếu peak 5, 6, – Kết đo hàm lượng protein hoạt tính endo-PGase cho thấy, tổng số đơn vị hoạt độ chế phẩm sau lọc gel thu hồi 51.014U lượng protein tương ứng 3.073mg Do đó, hiệu suất thu hồi toàn chế phẩm sau lọc gel đạt 66.84% độ tinh tăng lên 7.15 lần so với dịch enzyme thô – Lý luận tương tự thí nghiệm phần 4.2.1, hoạt tính endo-PGase chủ yếu tập trung peak 5,6 nên thu lấy phân đoạn làm chế phẩm tinh cuối Khi đó, hoạt tính riêng chế phẩm thu từ phân đoạn cao gấp 25.6 lần so với dịch enzyme thô hiệu suất thu hồi đạt 81.7% Tương tự, chế phẩm sau thu hồi bảo quản điều kiện lạnh đông để chuẩn bị cho bước khảo sát Bảng 4.12 Hiệu suất thu hồi độ tinh pectinase qua giai đoạn tinh phương pháp kết tủa với ethanol kết hợp với sắc ký lọc gel Thể tích (mL) Enzyme thô Sau kết tủa với ethanol Sau lọc gel Protein tổng (mg) Hoạt độ tổng (U) Hoạt tính riêng (U/mg protein) Hiệu suất (%) Độ tinh saïch 60 31.920 76.32 2.391 100% 1.0 60 4.680 73.57 15.72 96.4% 6.6 3.0 1.018 62.39 61.26 81.7% 25.6 * Kết thu hồi hoạt tính độ tinh chế phẩm phương pháp sắc ký lọc gel tính phân đoạn 5, 4.2.3 Kết lọc gel enzyme qua kết tủa với ammonium sulphate 70% Sau kết tủa với ammonium sulphate 70% (độ bão hòa), từ 60mL dịch enzyme thô ban đầu, hiệu suất thu hồi hoạt tính chế phẩm đạt 79.7% độ tinh chế phẩm tăng lên 5.18 lần Kết tủa sau ly tâm hòa tan với thể tích đệm thích hợp phân tích sắc ký lọc gel Kết sắc ký trình bày bảng 4.13 hình 4.12 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 64 Bảng 4.13 Hoạt độ hoạt tính riêng số phân đoạn đo sau lọc gel mẫu dịch enzyme qua kết tủa ammonium sulphate 70% độ bão hòa Phân đoạn Mẫu trước lọc gel Hoạt độ tổng (U) 60.83 Lượng protein (mg) 4.901 Hoạt tính riêng (U/mg protein) 12.4 1+2 0.004 0.010 0.4 0.034 0.257 0.1 2.152 0.295 7.3 14.269 0.208 68.5 14.777 0.185 79.9 5.869 0.088 66.7 1.264 0.038 33.7 10+11+12 1.042 0.718 1.5 Toång 39.416 1.790 22.0 1.2 4.0 3.5 OD280nm 1.0 3.0 OD280nm 0.8 2.5 0.6 2.0 1.5 0.4 1.0 0.2 Hoạ t tínhendo-PGase, U/mL Hoạ t tính endo-PGase 0.5 0.0 0.0 10 15 20 Phân đoạn Hình 4.12 Đồ thị biểu diễn độ hấp thu (λ = 280nm) hoạt tính endo-PGase phân đoạn trình lọc gel với mẫu enzyme qua kết tủa với ammonium sulphate (độ bão hòa 70%) Nhận xét: Hình dạng sắc ký đồ thu từ thí nghiệm tương tự thí nghiệm trước (phần 4.2.1 4.2.2) Từ kết đo hàm lượng protein hoạt tính endo-PGase chế LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 65 phẩm sau lọc gel, tổng hiệu suất thu hồi hoạt tính enzyme chế phẩm đạt trộn ba phân đoạn 5, 68.6% độ tinh tăng lên 30.4 lần Bảng 4.14 Hoạt độ hoạt tính riêng số phân đoạn đo sau lọc gel (Mẫu dịch enzyme qua kết tủa ammonium sulphate 70% độ bão hòa) Thể tích (mL) Enzyme thô Sau kết tủa (NH4)2SO4 Sau lọc gel Protein tổng (mg) Hoạt độ tổng (U) Hoạt tính riêng (U/mg protein) Hiệu suất (%) Độ tinh saïch 60 31.980 76.32 2.386 100.0% 1.0 60 4.901 60.83 12.41 79.7% 5.2 3.0 0.722 52.37 72.59 68.6% 30.4 * Kết thu hồi hoạt tính độ tinh chế phẩm phương pháp lọc gel tính phân đoạn 5, 4.2.4 Kết luận chung Qua thí nghiệm trên, có số kết luận sau: – Trong tất trường hợp, độ tinh chế phẩm sau qua lọc gel tăng lên đáng kể so với enzyme thô enzyme qua kết tủa – Hiệu suất thu hồi enzyme sau lọc gel đạt cao 81.7% sử dụng mẫu qua kết tủa ethanol (Venzyme:Vdung môi = 20:80) Khi đó, hiệu suất thu hồi enzyme sau lọc gel giảm 14.7% so với hiệu suất thu hồi sau kết tủa Tuy nhiên, độ tinh chế phẩm thu lại thấp trường hợp khảo sát (25.6) – Ngược lại, isopropanol tác nhân thích hợp việc nâng cao độ tinh chế phẩm Từ kết thí nghiệm cho thấy, tỷ lệ Venzyme:Vdung môi = 40:60 thu hồi 88.6% tổng hoạt tính pectinase độ tinh đạt 8.6 lần Sau lọc gel, độ tinh chế phẩm đạt giá trị cao 47.2 lần, tức tăng thêm 5.49 lần so với sau kết tủa enzyme Tuy nhiên, hiệu suất thu hồi hoạt tính enzyme sau trình lọc gel giảm xuống 51.60% (giảm 37% so với hiệu suất kết tủa enzyme) Như vậy, phương án sử dụng enzyme qua kết tủa isopropanol thích hợp vấn đề tinh chế phẩm thu hồi hoạt tính chế phẩm – Kết lọc gel với mẫu qua kết tủa với ammonium sulphate cho thấy: hiệu suất thu hồi enzyme giảm ít, từ 79.7% xuống 68.6% (giảm 11.1% so với hiệu suất kết tủa enzyme) độ tinh tăng lên từ 5.2 lần đến 30.4 lần (tăng thêm 5.85 lần) Như vậy, quy trình tinh gồm có giai đoạn kết tủa enzyme sắc ký lọc gel sử dụng tác nhân ammonium sulphate cho: o Hiệu suất thu hồi enzyme cao so với trường hợp dùng tác nhân ispropanol lại thấp so với trường hợp dùng tác nhân ethanol LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN o 66 Độ tinh chế phẩm cao so với trường hợp dùng tác nhân ethanol lại thấp so với trường hợp dùng tác nhân isopropanol 100% 88.60% 90 81.70% 80% 79.70% 68.60% 70% Hiệu suấ t thu hồi, % 80 60% 70 60 51.60% 50% 50 47.2 40% 40 30.4 30% 25.6 20% 10% Độ tinh sạch, lần 90% 100 96.40% 30 20 8.6 6.6 5.2 0% 10 Isopropanol Ethanol Ammonium sulphate Tác nhân kết tủa Hiệ u suấ t thu hồ i sau kế t tủ a Độ tinh sạ ch sau kế t tủ a Hiệ u suấ t thu hồ i sau lọ c gel Độ tinh sạ ch sau lọ c gel Hình 4.13 So sánh hiệu suất thu hồi độ tinh qua phương án khác Như giới thiệu chương 1, mục tiêu nghiên cứu chủ yếu chọn quy trình tinh nhằm phục vụ cho việc sản xuất enzyme pectinase quy mô công nghiệp nên yếu tố độ tinh chế phẩm, hiệu kinh tế quy trình cần quan tâm Để thuận tiện cho việc so sánh, lập bảng 4.15 để đánh giá hiệu kinh tế cho phương án tinh Kết đánh giá sơ cho thấy, chi phí để thu hồi đơn vị hoạt độ (đvhđ) chế phẩm phương án sử dụng kết tủa isopropanol, ammonium sulphate ethanol 101.07, 25.96, 96.17 đồng/U chế phẩm Theo đó, không tính đến độ tinh chế phẩm phương án có sử dụng ammonium sulphate phương án mang tính khả thi cao dễ áp dụng quy mô công nghiệp Bảng 4.15 Đánh giá hiệu kinh tế cho phương án tinh chế phẩm pectinase LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Loại tác nhân Giá công nghiệp Đơn vị tính 67 Thành tiền Tổng đvhđ thu hồi** Chi phí thu hồi đvhđ*** (đơn vị) (đồng) Lượng dùng* (đồng) (U) (đồng/U) Isopropanol 44200 kg 1.5 kg 66300 656.00 101.07 (NH4)2SO4 48000 kg 472 g 22656 872.83 25.96 Ethanol 25000 1L 4L 100000 1039.80 96.17 * Lượng tác nhân cần dùng để tinh 1L chế phẩm enzyme thô ** Tổng số đơn vị hoạt độ thu hồi sau trình lọc gel ***Chi phí thu hồi cho đơn vị hoạt độ chế phẩm sau trình lọc gel: chưa tính đến chi phí cho trình lọc gel Như vậy, từ kết thu được, đề xuất sử dụng phương pháp kết tủa enzyme ammonium sulphate 70% kết hợp với sắc ký lọc gel để tinh pectinase Chế phẩm thu từ giai đoạn tinh nói sử dụng để nghiên cứu tính chất động học phần LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 4.3 68 XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA CHẾ PHẨM Trong thí nghiệm này, sử dụng chế phẩm qua tinh theo phương án 4.2.3 Để tạo chế phẩm, tiến hành kết tủa 160mL dịch enzyme thô ammonium sulphate 70% Toàn kết tủa sau ly tâm tái hòa tan 4mL dung dịch đệm acetate 0.05N thực trình lọc gel Chế phẩm sau tinh sử dụng làm đối tượng cho nghiên cứu sau đây: – Xác định nhiệt độ pH hoạt động tối thích chế phẩm; – Khảo sát độ bền (độ ổn định) hoạt tính chế phẩm pH nhiệt độ khác nhau; – Xác định thông số động học (Km Vmax) chế phẩm thu 4.3.1 Xác định nhiệt độ tối thích chế phẩm Tiến hành xác định hoạt tính chế phẩm nhiệt độ khác theo trình tự nêu phần 3.2.2.3 Kết trình bày bảng 4.16 hình 4.17: Bảng 4.16 Ảnh hưởng nhiệt độ phản ứng đến hoạt tính endo-PGase Nhiệt độ Hoạt tính Hoạt tính tương đối C (U/mL) (% so với hoạt tính cực đại) 30 5.054 86% 35 5.353 91% 40 5.554 95% 45 5.678 97% 50 5.808 99% 55 5.858 100% 60 5.280 90% 65 4.888 83% 70 4.360 74% o Nhận xét: Kết thí nghiệm hoàn toàn phù hợp với quy luật ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính enzyme [10, 11] Từ đồ thị biễu diễn mối tương quan nhiệt độ phản ứng hoạt tính chế phẩm (Hình 4.14), nhận thấy, nhiệt độ mà hoạt tính endo-PGase đạt giá trị cao 55oC Do đó, chọn giá trị nhiệt độ nhiệt độ hoạt động tối thích chế phẩm Trong khoảng nhiệt độ từ 30 đến 50oC, hoạt tính tương đối chế phẩm tăng từ 86% đến 99% Khi nhiệt độ vượt 55oC tăng đến 70oC, hoạt tính xúc tác giảm từ 100% xuống 70% Kết hình 4.14 cho thấy, vùng giá trị nhiệt độ mà hoạt tính endo-PGase thể 90% so với hoạt tính tối đa nằm khoảng từ 35 đến LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 69 60oC Điều tạo thuận lợi cho khả ứng dụng chế phẩm Vì thực tế sản xuất, lúc nhiệt độ phản ứng ổn định giá trị nhiệt độ tối thích Của enzyme xúc tác Chế phẩm có khoảng nhiệt độ phản ứng rộng dễ sử dụng Để xác định khoảng nhiệt độ phản ứng thích hợp, thí nghiệm khảo sát độ ổn định hoạt tính chế phẩm giá trị nhiệt độ khác Theo kết nghiên cứu từ số loài nấm sợi, người ta thấy nhiệt độ tối thích endo-PGase thường nằm khoảng 30-50oC (Jayani R S cộng sự, 2005) Như vậy, chế phẩm endo-PGase nghiên cứu có nhiệt độ tối thích tương đối cao Nhiệt độ tối thích cao (Topt = 55oC) lợi nhiệt độ này, hệ vi sinh vật nguyên liệu dễ bị ức chế so sánh với nhiệt độ 30-50oC Điều góp phần hạn chế tượng hư hỏng sản phẩm vi sinh vật gây nên Ngoài ra, so sánh với chế phẩm Pectinex Ultra SPL (Novodisk, Denmark), Topt = 35oC, có kết luận tương tự [44] 7.0 Hoạ t tính endo-polygalacturonase, U/mL 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0.0 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 o Nhiệ t độ phả n ứ ng, C Hình 4.14 Ảnh hưởng nhiệt độ phản ứng đến hoạt tính endo-PGase LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP 75 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 4.3.2 70 Xác định pH tối thích chế phẩm Trong thí nghiệm này, tiến hành xác định hoạt tính chế phẩm giá trị pH khác theo trình tự nêu phần 3.2.2.3 Kết thí nghiệm trình bày bảng 4.17 hình 4.15 Bảng 4.17 Ảnh hưởng pH phản ứng đến hoạt tính endo-PGase Hoạt tính Hoạt tính tương đối (U/mL) pH (% so với hoạt tính cực đại) 3.0 2.738 47% 3.5 3.922 67% 4.0 5.508 94% 4.5 5.836 100% 5.0 5.733 98% 5.5 5.632 97% 6.0 5.446 93% 6.5 5.007 86% 7.0 4.854 83% Hoạt tính endo-polygalacturonase, U/mL 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0.0 2.5 3.5 4.5 5.5 6.5 pH phản ứng Hình 4.15 Ảnh hưởng pH phản ứng đến hoạt tính endo-PGase LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP 7.5 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 71 Nhận xét kết thí nghiệm: Khi tăng pH từ 3.0 đến 4.0, hoạt tính xúc tác endo-PGase tăng nhanh từ 47% đến 94% (so với giá trị cực đại) Tại pH 4.5, hoạt tính chế phẩm đạt giá trị cực đại Khi pH > 4.5, hoạt tính endo-PGase có xu hướng giảm dần, với mức độ chậm so với tăng pH từ 3.0 đến 4.0 Điều cho thấy, endo-PGase loại enzyme hoạt động tốt vùng pH acid Từ nhận xét trên, chọn giá trị pH tối thích chế phẩm pHopt = 4.5 Chúng ta biết, endo-PGase ứng dụng chủ yếu lónh vực sản xuất loại thức uống từ rau Do đó, pHopt = 4.5 hoàn toàn phù hợp để sử dụng chế phẩm lónh vực 4.3.3 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến độ ổn định hoạt tính chế phẩm Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính chế phẩm quan tâm nhiều sản xuất sử dụng enzyme Khi ứng dụng chế phẩm enzyme thực tế sản xuất, người ta thường quan tâm nhiều đến khoảng nhiệt độ mà enzyme hoạt động ổn định có hoạt tính cao Khoảng nhiệt độ thường dao động xung quanh giá trị nhiệt độ tối thích chế phẩm Chúng xác định nhiệt độ pH tối thích chế phẩm endo-PGase 55 oC 4.5 Trong phần này, tiến hành khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ phản ứng đến độ bền hoạt tính enzyme Kết thí nghiệm trình bày bảng 4.18 hình 4.16 Bảng 4.18 Phần trăm hoạt tính lại chế phẩm theo thời gian, ứng với giá trị nhiệt độ phản ứng khác pH tối thích Thời gian phản ứng, phút Nhiệt độ, C 20 40 60 120 180 240 35 100.00 98.99 98.08 96.78 94.53 92.36 90.37 45 100.00 97.91 96.23 94.40 92.41 90.73 89.44 55 100.00 96.32 95.40 93.59 92.60 90.18 89.10 65 100.00 30.86 9.61 6.89 5.10 3.75 2.80 o LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 72 100 90 80 Độ giảm hoạt tính, % 70 60 50 40 30 20 10 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 Thời gian phản ứng, phút Hình 4.16 Độ bền hoạt tính chế phẩm theo thời gian nhiệt độ khác (), 35oC; (), 45oC; (), 55oC; (x) 65oC Từ kết thí nghiệm, có nhận xét sau: – Ở nhiệt độ 35oC, 45oC 55oC, hoạt tính endo-PGase giảm chậm theo thời gian Sau 240 phút phản ứng, hoạt tính đến 90% – Ngược lại, nhiệt độ 65oC, hoạt tính enzyme giảm nhanh Chỉ sau 40 phút phản ứng, hoạt tính lại 10% so với hoạt tính ban đầu sau 240 phút phản ứng, toàn enzyme gần vô hoạt hoàn toàn Như vậy, kết hợp với kết thí nghiệm phần 4.3.1, thấy rằng, khoảng nhiệt độ mà enzyme hoạt động ổn định có hoạt tính cao (hoạt tính tương đối >90%) 35-55oC Thực tế nay, thời gian xúc tác phản ứng thủy phân pectin sản xuất thức uống từ rau thường kéo dài từ đế Do đó, khả ổn định hoạt tính nhiệt độ cao (55oC) thời gian dài (4h) ưu điểm lớn chế phẩm 4.3.4 Khảo sát ảnh hưởng pH đến độ ổn định hoạt tính chế phẩm Tiếp theo, khảo sát ảnh hưởng pH phản ứng đến hoạt tính chế phẩm theo thời gian Kết thí nghiệm trình bày bảng 4.19 hình 4.17: LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 73 Bảng 4.19 Phần trăm hoạt tính lại chế phẩm theo thời gian ứng với pH phản ứng khác nhiệt độ tối thích chế phẩm Thời gian phản ứng, phút pH 20 40 60 120 180 240 3.5 100 94.66 87.88 74.90 54.31 39.82 30.12 4.5 100 97.68 95.40 93.59 91.58 90.18 89.10 5.5 100 80.33 64.79 56.89 47.05 36.50 27.78 6.5 100 61.92 37.88 21.57 15.29 7.92 4.17 100 90 Độ giả m hoạt tính, % 80 70 60 50 40 30 20 10 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 Thời gian phả n ứng, phút Hình 4.17 Độ bền hoạt tính chế phẩm theo thời gian pH khác (), 3.5; (), 4.5; (), 5.5; (x) 6.5 Khi sử dụng chế phẩm, pH dung dịch phản ứng bị thay đổi theo thời gian làm giảm hoạt tính xúc tác chế phẩm Do đó, số trường hợp, ta dùng dung dịch đệm để ổn định giá trị pH suốt thời gian xúc tác phản ứng Dựa vào kết trình bày bảng 4.19, có nhận xét sau: – Ở pH tối thích (pH 4.5), endo-PGase hoạt động ổn định Hoạt tính enzyme sau 240 phút phản ứng pH lại 90% so với hoạt tính ban đầu – Ở pH < 4.5, hoạt tính enzyme giảm xuống 90% 30 phút phản ứng Sau 240 phút phản ứng, hoạt tính lại xấp xỉ 30% LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 74 – Ở pH > 4.5, hoạt tính enzyme giảm nhanh suốt thời gian phản ứng Càng xa pH tối thích, hoạt tính giảm nhanh, độ ổn định hoạt tính thấp Như vậy, hoạt tính endo-PGase ổn định pH 4.5 4.3.5 Xác định thông số động học chế phẩm Trong thí nghiệm này, động học phản ứng thủy phân pectin endo-polygalacturonase khảo sát nồng độ pectin 0.5; 1.0; 2.0; 4.0; 6.0 g/L Các phản ứng thực 55oC, pH 4.5 Hoạt tính xúc tác chế phẩm enzyme thí nghiệm 4.5 U/mL Các kết thí nghiệm trình bày bảng 4.20, 4.21; hình 4.18 4.20 Bảng 4.20 Biến thiên độ nhớt tương đối hỗn hợp phản ứng theo thời gian ứng với hàm lượng chất ban đầu khác Nồng độ pectin, g/L Thời gian phản ứng, phút 0.5 1.1705 1.1414 1.1123 1.1031 1.0982 1.0976 1.0 1.3689 1.2044 1.1909 1.1660 1.1495 1.1414 2.0 1.7677 1.4593 1.4275 1.3738 1.3149 1.2790 4.0 2.8783 2.2555 2.0945 1.9237 1.7751 1.6955 6.0 4.3667 3.3189 2.8747 2.6526 2.5545 2.4563 Baûng 4.21 Tương quan tốc độ phản ứng ban đầu nồng độ dung dịch pectin Nồng độ pectin (g/L) Vo = − dµ p dt 1/S 1/Vo t =0 0.5 0.0465 2.000 15.625 1.0 0.1573 1.000 8.319 2.0 0.2314 0.500 5.731 4.0 0.2479 0.250 4.621 6.0 0.2991 0.167 4.167 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUAÄN 75 100% [S] = 0.5g/ L [S] = 1.0g/ L [S] = 2.0g/ L 90% 70% (% so vớ i ban đầ u) Độ nhớ t hỗ n hợ p phả n ứ ng 80% [S] = 4.0g/ L [S] = 6.0g/ L 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% Thờ i gian phả n ứ ng, phú t Hình 4.18 Sự thay đổi độ nhớt dịch phản ứng theo thời gian ứng với hàm lượng chất ban đầu khác 0.40 Tố c độ phả n ứ ng, ph -1 0.35 0.30 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00 Noà ng độ chấ t , g/L Hình 4.19 Đồ thị phương trình Michealis Menten chế phẩm endo-PGase sau tinh LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ... 82.20c 4. 14a 40 :60 0.068 0 .44 0 6 .46 35.37d 2.54c 50:50 0.022 0.111 4. 92 8.89e 1.95d 60 :40 0.018 0.085 4. 81 6.80f 1.95d Enzyme thoâ 0 .48 9 1. 244 2. 544 100.00 1.00 Venzyme/ Vdung môi Hoạt tính riêng... 10 .41 a 98.87 4. 09e 0.100 1. 241 12 .46 99.60a 4. 90d 30:70 0.073 1.198 16 .44 96.12b 6.53c 40 :60 0.052 1.108 21 .44 88.95c 8 .43 a 50:50 0.022 0 .41 9 19 .42 33.63d 7.65b 60 :40 0.015 0.066 4. 47 5.30e 1.78f...CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 45 Hoạt tính endo-polygalacturonase, U/mL 1 .4 1.2 1.0 0.8 0.6 0 .4 0.2 0.0 10 15 20 25 30 Thời gian nuôi cấy, h Hình 4. 1 Hoạt tính endo-polygalaturonase từ canh trường