Luận văn tinh sạch pectinase bằng phương pháp nuôi cấy BS aspergillus awamori

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN CHƯƠNG TỔNG QUAN 2.1 TỔNG QUAN VỀ PECTINASE VÀ PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN 2.1.1 HỆ THỐNG ENZYME PECTINASE Pectinase phân chia làm nhóm (xem bảng 2.1), bao gồm: [44, 45] – – – Nhóm 1: nhóm enzyme thủy phân protopectin – Protopectinase Nhóm 2: nhóm enzyme thủy phân liên kết ester – Esterase Nhóm 3: nhóm depolymer hóa mạch pectin – Depolymerase 2.1.1.1 Protopectinase (PPase) Protopectinase hay pectinosinase enzyme xúc tác cho phản ứng phân giải protopectin không tan thành pectin hòa tan Cơ chế phản ứng xúc tác protopectinase sau: (không tan) (hòa tan) Dựa chế xúc tác, PPase chia làm loại: – Loại A-PPase xúc tác vò trí bên mạch protopectin (vùng acid polygalacturonic) A-PPase tổng hợp nấm men Kluyveromyces fragilis IFO 0288 (PPase-F), Galactomyces reesei L (PPaseL) Trichosporon penicillatum (PPase-S) (Whitaker cộng sự, 1990) Cả loại A-PPase có tính chất tương tự khối lượng phân tử xấp xỉ (khoảng 30 kDa) Trong đó, PPase-F có chất protein mang tính acid, PPase-L -S protein mang tính kiềm Các enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân mạch polygalacturonate làm giảm độ nhớt tăng nhẹ tính khử dung dòch phản ứng [44, 102] LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN Bảng 2.1 Khóa phân loại pectinase [44] LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN – Loại B-PPase xúc tác vò trí bên mạch protopectin (vùng liên kết mạch polygalacturonic acid với thành phần cấu trúc thành tế bào thực vật) B-PPase thu nhận từ số chủng vi khuẩn Bacillus subtilis IFO 12113 (Sakai T cộng sự, 1988), B subtilis 3134 (Sakai T cộng sự, 1990) Trametes sp (Sakai T cộng sự, 1993) đặt tên tương ứng PPaseB, -C, -T Trọng lượng phân tử loại enzyme PPase-B, -C –T tương ứng 45, 30 55 kDa PPase-B -C có điểm đẳng điện pI khoảng 9.0, PPase-T có pI 8.1 Cả loại enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân protopectin từ vỏ trái thuộc họ citrus mô số thực vật khác, giải phóng pectin hòa tan [79, 80, 81] Hoạt tính PPase xác đònh dựa lượng pectin hòa tan giải phóng từ protopectin phương pháp carbazole-sulphuric acid [44] 2.1.1.2 Pectinesterase (PE) Thuộc nhóm có loại pectin methylesterase (EC 3.1.1.11) pectin acetylesterase (EC 3.1.1.6) Enzyme pectin methylesterase (PME) xuất phổ biến thực vật vi sinh vật Trong đó, pectin acetylesterase tập trung chủ yếu số thực vật.[33, 44, 45] Hình 2.1 Cơ chế xúc tác phản ứng thủy phân ester enzyme pectinesterase 1- Pectin methylesterase Pectin methylesterase (PME) có nhiều tên gọi khác pectase, pectin methoxylase, pectin demethoxylase pectolipase Về chất, PME thuộc nhóm enzyme thủy phân liên kết ester gốc methoxyl gốc carboxylic vò trí C6 acid galacturonic mạch phân tử pectin Sản phẩm phản ứng thủy phân acid pectinic (có mức độ ester hoác thấp hơn) acid pectic methanol [44] LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN PME sinh tổng hợp số vi khuẩn nấm sợi (Hasunuma cộng sự, 2003) Người ta thấy loại PME tổng hợp từ nấm sợi có khả xúc tác phản ứng thủy phân ester vò mạch pectin Trong đó, PME từ thực vật có khả xúc tác cho phản ứng demethoxyl hóa gốc galacturonic acid vò trí đầu không khử cuối mạch pectin vò trí ester gốc galacturoronic nằm kề bên gốc acid galacturonic chưa ester hóa (Froster, 1988) [29, 33] Hoạt tính PME tăng lên với mức độ ester hóa chất Do đó, PME xúc tác đặc hiệu phân tử chất ester hóa mức độ cao PME hoạt tính muối pectate Hoạt tính PME xác đònh phương pháp chuẩn độ pH tự động (pH-stat) (Whitaker, 1984) phương pháp chuẩn độ thông thường với NaOH chuẩn tới giá trò pH cố đònh [33, 28] Khối lượng phân tử hầu hết enzyme pectinesterase thu nhận từ vi sinh vật thực vật dao động khoảng từ 30-50 kDa (Hadj-Taieb cộng sự, 2002; Christensen cộng sự, 2002) Giá trò pH tối ưu cho hoạt động xúc tác PME thường nằm vùng acid đến trung tính (từ 4.0 đến 7.0), ngoại trừ PME thu nhận từ Erwinia hoạt động tốt vùng pH kiềm Hầu hết loại PME hoạt động tối ưu khoảng nhiệt độ từ 40 đến 60 oC giá trò pI từ 4.0-8.0 Giá trò Km nằm khoảng 0.1-0.5 mg/mL [33] Bảng 2.2 Tính chất vài pectinesterase [33] 2- Pectin acetylesterase Pectin acetylesterase (PAE) có tên gọi khác pectin homogalacturonan acetylesterase Hoạt động enzyme phổ biến nhiều loại thực vật cam, cà rốt đậu mung PAE tập trung chủ yếu phần vỏ múi cam Ở đậu mung (mung bean), PAE tìm thấy số mô đặc biệt Trong đó, tập trung nhiều mô phần trụ mầm (hypocotyl), thấp phần rễ Tuy nhiên, không tìm thấy hoạt tính LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN PAE mầm (cotyledon) Hoạt động PAE tìm thấy rõ cà rốt [28] 2.1.1.3 Depolymerases Depolymerase nhóm enzyme pectinase tác dụng chủ yếu lên hợp chất pectic, gây phân cắt làm giảm kích thước phân tử Người ta phân loại enzyme thuộc nhóm nhiều khóa phân loại khác dựa chế tính đặc hiệu chất Trong phần này, xin giới thiệu khóa phân loại các enzyme pectin depolymerase dựa vào chế xúc tác làm giảm chiều dài mạch pectin.Theo đó, phản ứng phân giải mạch pectin thực theo chế (xem hình 2.2): [44, 45] – Cơ chế thủy phân (hydrolysis): phân giải liên kết α-1,4 đơn vò galacturonate cần có tham gia phân tử H 2O Các enzyme thuộc loại gồm có polygalacturonase (PG), polymethylgalaturonase (PMG), rhamnose galaturonase (RG) – Cơ chế phản ứng trans-elimination: phân giải liên kết đơn vò galacturonate không cần có mặt phân tử H2O Theo chế này, enzyme công làm bẻ gãy liên kết glycoside vò trí C4, đồng thời với việc khử H vò trí C5 hình thành nên nối đôi vò trí C4-5 tạo sản phẩm sản phẩm ∆4:5 galacturonate không bão hòa Các enzyme thuộc loại bao gồm polygalacturonate lyase (hay pectin lyase), polymethylgalaturonate lyase (hay pectate lyase), rhamnogalacturonan lyase Hình 2.2 Các kiểu phản ứng xúc tác enzyme thuộc nhóm depolymerase (a) R=H polygalaturonase, R=CH polymethylgalacturonase; (b) R=H polygalacturonate lyase R=CH3 polymethylgalacturonate lyase [44] LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN A - Nhóm enzyme thủy phân (hydrolysis) 1- Polygalacturonase (PGase) Polygalacturonase enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết glycoside mạch polygalacturonate (hay pectate) theo chế exovà endo- Đây loại enzyme quan trọng nghiên cứu nhiều hệ thống enzyme thủy phân pectin  Endo-polygalacturonase (Endo-PGase) Endo-PGase (EC 3.2.1.15) thủy phân liên kết α-1,4 glycoside vò trí ngẫu nhiên mạch polygalacturonate (ở dạng homogalacturonan) Sản phẩm trình thủy phân đoạn oligogalacturonate Endo-PGase xúc tác chủ yếu chất pectate hoạt tính pectin có số methoxyl hóa cao (bảng 2.6) [44, 101] Endo-PG thường có nguồn gốc từ nấm sợi, vi khuẩn số loài nấm men Chúng tìm thấy số thực vật bậc cao vài giun ký sinh thực vật (Sakai cộng sự, 1993) Các loài vi sinh vật thường nghiên cứu thu nhận endo-PG gồm có Aureobasidium pullulans, Rhizoctonia solani, Fusarium moniliforme, Neurospora crassa, Rhizopus stolonifer, Aspergillus sp., Thermomyces lanuginosus, Peacilomyces clavisporus Endo-PG nghiên cứu thu nhận từ vi sinh vật tái tổ hợp di truyền [44, 81] Bảng 2.3 Ảnh hưởng mức độ ester hóa đến hoạt tính endoPGase [101] Các phân tử endo-PG thường có khối lượng khoảng 30-80kDa, giá trò pI dao động 3.8 đến 7.6 Hầu hết endo-PG có pH tối thích nằm vùng acid từ 2.5-6.0 nhiệt độ tối thích từ 30-55 oC (theo Singh Rao, 2002; Takao cộng sự, 2001) Giá trò K m endo-PG thường vào khoảng 0.14-2.7mg/mL ứng với chất muối pectate [33, 34, 101] LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN Hoạt tính xúc tác endo-PGase xác đònh cách gián tiếp phương pháp đo khả làm giảm độ nhớt dung dòch pectin đơn vò thời gian cố đònh điều kiện lại phản ứng (pH, nhiệt độ, nồng độ chất) [44, 97]  Exo-polygalacturonase (Exo-PGase) Ngược lại với endo-PGase, exo-polygalacturonase (EC 3.2.1.67) lại xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết α-1,4 glycoside từ mạch polygalacturonate vào tính từ đầu không khử Sản phẩm trình thủy phân xúc tác exo enzyme di- monogalaturonates [44, 101] Exo-PGase phân làm loại exo-PG từ nấm sợi từ vi khuẩn Loại exo-PGase có nguồn gốc từ nấm sợi có khuynh hướng tạo sản phẩm cuối monogalacturonic acid exo-PGase từ vi khuẩn thường tạo acid digalacturonic Các chủng vi sinh vật nghiên cứu thu nhận exo-PGase gồm có: Erwinia carotovora, Agrobacteriumtumefaciens, Bacteroides thetaiotamicron, E chrysanthemi, Alternaria mali, Fusarium oxysporum, Ralstonia solanacearum, Bacillus sp Khối lượng phân tử pI exo-PGase dao động khoảng 30-50kDa 4.0-6.0 tương ứng Nhiệt độ tối thích nằm khoảng từ 50 đến 70oC (xem bảng 2.4) pH tối thích cho enzyme dao động khoảng rộng tùy thuộc vào loài vi sinh vật cụ thể [44, 33, 34, 99] Người ta thường xác đònh hoạt tính exo-PG phương pháp đo hàm lượng đường khử (acid galaturonic) giải phóng mL dòch thủy phân đơn vò thời gian cố đònh điều kiện lại phản ứng (pH, nhiệt độ, nồng độ chất) [44, 97] 2- Polymethylgalacturonase (PMG) Khác với PG, PMG xúc tác cho phản ứng thủy phân chất pectic có mức độ methoxyl hóa cao Do đó, acid pectic dẫn xuất pectate đối tượng công enzyme Hiện nay, có công trình nghiên cứu tính chất PMG khó khăn vấn đề tinh khó xác đònh hoạt tính loại enzyme [45, 33, 34] Aspergillus xem giống vi sinh vật chủ yếu sản xuất PMG PMG từ A niger hoạt động tối ưu vùng pH từ đến 7, chất chủ yếu cho enzyme xúc tác phải pectin có mức độ ester hóa cao (khoảng 95%) (Koller Neukom, 1967) Từ việc phân tích sản phẩm thủy phân dung dòch pectin, tác giả dự đoán rằng, Aspergillus sinh tổng hợp endo-PMG [33, 34] LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP 10 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN Bảng 2.4 Tính chất vài polygalacturonase [44] (–) chưa xác đònh tính chất 3- Rhamnogalaturonase Rhamnogalacturonase enzyme có khả thủy phân liên kết glycoside vùng phân nhánh nhiều phân tử pectin (rhamnogalacturonan) Sản phẩm cuối phản ứng thủy phân oligomer chứa đơn vò rhamnose galaturonic acid Enzyme thường xuyên có mặt chế phẩm thương mại enzyme pectinase [33, 101] B - Nhóm enzyme trans-eliminase 1Pectin lyase transeliminase) (polymethylgalacturonate lyase hay pectin Albersheim cộng (1966) người tìm thấy xuất enzyme từ A niger Cho đến nay, người ta LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 11 biết loại pectin lyase hay polymethylgalacturonate lyase (PMGL) phân cắt mạch pectin theo kiểu endo Enzyme phân giải mạch phân tử pectin vò trí hình thành nên sản phẩm có chứa liên kết đôi ∆4:5 oligomethylgalacturonate không bão hòa polymethylgalaturonate [45, 101] Hình 2.3 Cơ chế xúc tác phản ứng pectin lyase pectate lyase Khác với polygalaturonate lyase hay pectate lyase, pectin lyase không cần hoạt hóa ion calcium (ngoại trừ PMGL thu nhận từ Fusarium) Tuy nhiên, số nghiên cứu cho thấy có mặt ion Ca2+ hoạt tính PMGL tăng lên [44] Bên cạnh đó, Soriano (2005) Hayashi (1997) cộng xác đònh khối lượng phân tử PMGL nằm khoảng 30-40 kDa, có trường hợp PMGL từ Aureobasidium pullulans Pichia pinus có khối lượng phân tử cao (xấp xỉ 90 kDa) [40, 92] Thông thường, pH cho PMGL hoạt động tối ưu nằm vùng acid đến trung tính (từ đến 7) (Soriano cộng sự, 2005; Silva cộng sự, 2005) Điểm đẳng điện hầu hết PMGL xấp xỉ 3.5 giá trò K m khoảng từ 0.1 đến 5.0 mg/mL tùy theo loại chất sử dụng (Sakiyama cộng 2001; Moharib cộng sự, 2000) [40, 64, 82, 87] 2- Pectate lyase (pectate transeliminase hay polygalacturonate lyase) Pectate lyase hay polygalacturonate lyase (PGL) xúc tác cho phản ứng phân giải mạch polygalaturonate theo chế trans-elimination Cơ chất thích hợp cho enzyme tác dụng acid pectic hay muối pectate pectin có mức độ methoxyl hóa thấp Trong tự nhiên, có loại PGL tìm thấy dạng endo exo Trong đó, dạng endo-PGL phong phú phổ biến so với dạng exo-PGL [45, 101] PGL tổng hợp từ nhiều loài vi sinh vật chủ yếu vi khuẩn số nấm sợi gây bệnh cho Thường gặp Colletotrichum lindemuthionum, Bacteroides thetaiotaomicron, Erwinia carotovora, Amucala sp., Pseudomonas syringae pv Glycinea, Colletotrichum magna, E chrysanthemi, Bacillus sp., Bacillus sp DT-7, C gloeosporioides [44] LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 12 PGL thuộc loại enzyme lưỡng cấu tử đòi hỏi phải có ion calcium làm thành phần cộng tố (cofactor) (Margo P cộng sự, 1994) Khối lượng phân tử enzyme thường nằm khoảng 3050 kDa (McCarthy cộng sự, 1985; Truong cộng sự, 2001) Giá trò pH tối thích nhiệt độ tối thích để enzyme hoạt động tương ứng 8.0-10.0 30-40oC Một số loài vi sinh vật chòu nhiệt tổng hợp nên PGL có nhiệt độ tối thích cao (từ 50 đến 75 oC) [33, 34, 44, 58] Ngoài ra, số enzyme lyase, có loại enzyme khác có tên oligogalacturonate lyase (EC 4.2.2.6) Enzyme có tác dụng làm bẽ gãy mạch oligogalacturonate bão hòa không bão hòa theo chế trans-elimination từ vò trí đầu không khử Kết làm giải phóng monomer chứa nối đôi khỏi chất Oligogalacturonate lyase sinh tổng hợp chủ yếu từ Erwinia Pseudomonas sp., có pH tối ưu 7.0 [44] Bảng 2.5 Tính chất vài lyase [44] Chú thích: PGL: polygalacturonate lyase, PMGL: polymethyl galacturonate lyase LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 21 2.1.3.2 Ứng dụng công nghệ sản xuất rượu vang Ứng dụng pectinase sản xuất rượu vang với mục đích tương tự sản xuất nước Ngoài ta, người ta thấy rằng, bổ sung pectinase vào hỗn hợp dòch (đã qua xử lý nhiệt) trước lên men làm tăng độ màu cải thiện độ bền hóa lý cho rượu vang thành phẩm so với không xử lý pectinase (theo Revilla I cộng sự, 2003) [74] 2.1.3.3 Ứng dụng công nghệ sản xuất mứt Trong sản xuất sản phẩm từ (mứt nhuyễn, mứt đông… ) pectinase có vai trò quan trọng Nhờ pectinase mà thu dòch có nồng độ chất khô cao Chẳng hạn sản xuất mứt táo, dòch táo qua xử lý pectinase cô đặc lên đến hàm lượng chất khô đạt 72 o Brix Trong đó, không tách pectin sản phẩm dễ bò keo tụ cô đặc đến nồng độ cao [2] 2.1.3.4 Ứng dụng trình khai thác dầu thực vật Người ta sử dụng enzyme phân hủy vách tế bào thực vật, có hệ enzyme pectinase để hỗ trợ trình ép dầu từ hạt cải dầu, phôi dừa, hạt hoa hướng dương, hạt cọ, ôliu Các enzym có tác dụng làm “hóa lỏng” thành phần cấu trúc vách tế bào có chứa dầu Chúng bổ sung vào trình nghiền nguyên liệu có dầu Do đó, dầu phóng thích dễ dàng trình Việc xử lý enzyme làm tăng sản lượng dầu Sự tăng sản lượng phụ thuộc vào pH, nhiệt độ liều lượng enzym sử dụng [15, 45, 99] 2.1.3.5 Ứng dụng trình lên men chè, cà phê Thành phần chủ yếu lớp vỏ nhày hạt cà phê pectin Vì thế, trình lên men cà phê, người ta dùng enzyme pectinase để phân giải pectin, loại lớp vỏ nhày khỏi hạt cà phê Chế phẩm pectinase thương mại hòa tan phun vào khối hạt với hàm lượng 2-10g/tấn 15-20oC Khi xử lý với enzym pectinase, trình lên men hạt cà phê diễn nhanh thời gian rút ngắn từ 40 – 80 xuống khoảng 20 Tuy nhiên, việc xử lý cà phê với chế phẩm enzym pectinase thương mại quy mô lớn có giá thành cao nên thực tế sản xuất, người ta thường tái sử dụng lớp vỏ nhày cà phê thải để nuôi cấy vi khuẩn sinh enzym pectinase Canh trường sau lên men xử lý sơ sau phun vào hạt [24, 45 ] LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 22 Trong sản xuất chè đen, chè xử lý pectinase thời gian lên men rút ngắn pectin chè bò phân giải giúp cho trình trích ly polyphenol khỏi tế bào dễ dàng Ngoài ra, pectin bò phân giải giúp làm giảm khả tạo bọt sản phẩm trà hòa tan [45] 2.1.3.6 Ứng dụng làm mềm mô thực vật cô lập protoplast (tế bào trần) Trong trình lai tạo giống thực vật, người ta chuyển tổ hợp gene mong muốn vào tế bào phương pháp thao tác gene thông thường Ngày nay, người ta sử dụng phương pháp dung hợp protoplast cô lập từ tế bào sinh dưỡng thực vật bậc cao điều kiện nuôi cấy invitro phát triển thành giống lai Đây thực công cụ hữu hiệu để làm tăng đa dạng đặc tính di truyền thực vật tổ hợp gene tự nhiên (Gleba, 1978) Để thực điều này, đầu tiên, người ta làm mềm mô thực vật cách xử lý với enzyme pectinase, sau tiếp tục xử lý với enzym cellulase để chuyển mô thành protoplast Nồng độ enzym là: pectinase 0,5% cellulose 0,5%, chỉnh pH 5,6 HCl 2N (Tanabe, 1968; Bock, 1983) [45] 2.2 CÁC KỸ THUẬT TINH SẠCH CHẾ PHẨM ENZYME Có nhiều kỹ thuật phương pháp tinh khác để tinh enzyme Các kỹ thuật áp dụng chủ yếu dựa vào tính chất phân tử protein kích thước, khối lượng phân tử, khả tích điện, Mỗi kỹ thuật tinh có ưu nhược điểm riêng việc chiết tách loại protein-enzyme khác Trong khuôn khổ luận văn này, xin giới thiệu số kỹ thuật thường áp dụng tinh pectinase 2.2.1 KỸ THUẬT SIÊU LỌC  Nguyên tắc Kỹ thuật siêu lọc (Ultrafiltration) trình phân riêng chọn lọc hợp chất màng lọc có kích thước siêu nhỏ với áp suất làm việc vào khoảng 0,5 – 5bar Đường kính mao quản trung bình từ đến 50 nm [73, 83]  Vật liệu lọc Trong phương pháp này, vật ngăn để phân riêng cấu tử membrane Áp lực động lực trình Membrane sản xuất từ nhiều loại vật liệu khác như: cellulose acetate, polyamide, polysulfone hay ceramic LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 23  Ứng dụng nghiên cứu tinh pectinase Trong lónh vực tinh enzyme nói chung, đặc biệt pectinase, trình siêu lọc thường áp dụng giai đoạn đầu quy trình tinh Mục đích trình tách nước tạp chất có phân tử lượng nhỏ canh trường lỏng ion kim loại, đường sót, acid amin, peptide… (dòng permeate) Trong hầu hết trường hợp, enzyme tinh phải giữ lại bề mặt vật liệu lọc (dòng retentate) Vì thế, vật liệu lọc cần phải có kích thước mao quản nhỏ kích thước enzyme Phần lớn enzyme polygalacturonase có khối lượng phân tử khoảng 30-80kDa (Jayani R S cộng sự, 2005) Vì vậy, để tinh canh trường nuôi cấy thu nhận loại enzyme cần vật liệu có kích thước nhỏ 30kDa Kích thước không tách protein tạp (có khối lượng phân tử lớn 30kD) bò lẫn canh trường [44] Kết nghiên cứu Manachini P.L cộng (1987) tinh endo-PGase kỹ thuật siêu lọc sử dụng sợi Diaflo (kích thước 10kDa) từ canh trường nuôi cấy nấm sợi Rhizopus Stolonifer cho thấy, độ tinh chế phẩm sau tinh tăng lên 2,1 lần với hiệu suất thu hồi 89% Một nghiên cứu khác Gainvors A cộng (2000) nâng cao độ tinh pectinase lên đến 10,4 lần với hiệu suất thu hồi khoảng 83% kỹ thuật siêu lọc với kích thước lỗ 30kDa Tuy nhiên, số trường hợp, việc áp dụng kỹ thuật siêu lọc không đạt hiệu cao lựa chọn kích thước lỗ màng không thích hợp (Dinu D cộng sự, 2007) [26, 34, 56] 2.2.2 KỸ THUẬT TINH SẠCH DỰA TRÊN SỰ KHÁC BIỆT VỀ ĐỘ HOÀ TAN 2.2.2.1 Kết tủa cách thay đổi lực ion  Nguyên tắc Enzyme hòa tan dung dòch dựa vào cân lực tónh điện tương tác kỵ nước Sự kết tủa enzyme xảy ta thêm muối trung tính vào dung dòch với nồng độ thích hợp Khi đó, enzyme kết tủa thuận nghòch thu lại dung dòch enzyme cách tách (ly tâm) hòa tan lại kết tủa Ngoài ra, số trường hợp, bổ sung muối có tác dụng làm bền enzyme, chống lại biến tính phân hủy nhiễm vi sinh vật [83, 75]  Tác nhân kết tủa Để kết tủa enzyme sử dụng nhiều loại muối khác Trong thực tế, ammonium sulfate dùng phổ biến muối có độ hòa tan cao nước, đạt lực ion cao giá thành rẻ LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 24 Tỷ trọng dung dòch bão hoàø khoảng 1.235 g/mL, thuận lợi cho trình ly tâm để tách kết tủa [83]  Các yếu tố ảnh hưởng – Nồng độ muối: nồng độ thấp, có mặt muối làm bền nhóm mang điện phân tử enzyme làm tăng tính tan enzyme Khi nồng độ muối tăng độ tan protein tăng Nếu tiếp tục tăng nồng độ muối độ tan enzyme giảm enzyme bắt đầu kết tủa thêm muối vào dung dòch, số phân tử nước solvat phân tử muối [75, 83] – Tính chất ion: ảnh hưởng muối đến trình kết tủa xác đònh qua tính chất ion, điện tích ion yếu tố ảnh hưởng nhiều Hiệu ảnh hưởng ion âm giảm dần theo trật tự sau: phosphate, sulphate, acetate, chloride… Những ion dương hóa trò có ảnh hưởng mạnh ion dương hóa trò hai Hiệu ảnh hưởng xếp theo thứ tự giảm dần ion dương sau: NH4+ , K+ , Na+ [75] – Thành phần, nồng độ dòch protein, nhiệt độ trình có ảnh hưởng đến kết tủa protein Nhiệt độ cao tính tan protein giảm  Phương pháp tiến hành Nồng độ muối tối ưu cần sử dụng thay đổi tùy theo trường hợp xác đònh thực nghiệm Khi thực thí nghiệm, cần tiến hành bổ sung ammonium sulphate chậm khuấy Kết tủa tách ly tâm hay lọc Phương pháp lọc áp dụng tỷ trọng protein kết tủa gần với tỷ trọng dung dòch [75, 76] Trong số trường hợp, sử dụng phương pháp kết tủa phân đoạn để tinh protein Người ta bổ sung ammonium sulfate vào dòch trích đến nồng độ mà protein mong muốn không tủa, kết tủa xuất tách bỏ Sau bổ sung muối vào dòch để đạt đến nồng độ mà protein mong muốn kết tủa Cuối cùng, tách thu nhận kết tủa [73, 75]  Ứng dụng nghiên cứu tinh pectinase Ammonium sulphate tác nhân thường gặp nghiên cứu tinh enzyme nói chung đặc biệt tinh enzyme pectinase (Afifi A.F cộng sự, 1988; Miyazaki Y., 1990; Jaffar M B cộng sự, 1993, Guo Chung-Teng cộng sự, 2001) Ammonium sulphate có ưu điểm bật nguyên liệu rẻ tiền, phổ biến có khả gây biến tích bất thuận nghòch enzyme Vì thế, thường tác nhân kết tủa nhà sản xuất ưu tiên lựa chọn Nồng độ ammonium sulphate tối LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 25 ưu cho tinh enzyme thường nằm khoảng từ 60-80% tuỳ vào loại enzyme cụ thể [14, 35, 42, 62] 2.2.2.2 Kết tủa enzyme dung môi hữu  Nguyên tắc Quá trình kết tủa enzyme dựa thay đổi số điện môi môi trường Lực đẩy lực hút tỉ lệ nghòch với số điện môi môi trường Vì vậy, bổ sung dung môi có số điện môi nhỏ (ethanol, acetone ), chúng làm giảm số điện môi môi trường, từ làm giảm khả solvat hóa phân tử nước phân tử enzyme dung dòch Do vậy, tính tan enzyme giảm enzyme bò kết tủa Hiện tượng kết tủa xảy tốt cần dung môi pH dung dòch gần với pI enzyme [8, 10, 11, 83]  Dung môi Protein kết tủa dung môi hữu tan nước, ethanol, acetone, methanol, isopropanol Trong đó, acetone ethanol hai dung môi phổ biến việc kết tủa protein Dung môi sử dụng phải an toàn, không độc có nhiệt độ bốc cháy lớn 20 oC [8, 10, 83]  Các yếu tố ảnh hưởng – Kích thước protein ảnh hưởng đến kết tủa Những protein có kích thước lớn tủa nồng độ dung môi thấp so với protein có kích thước nhỏ [83] – Sự tỏa nhiệt dung môi: bổ sung dung môi vào dung dòch enzyme, nhiệt độ hỗn hợp tăng trình tỏa nhiệt Khi nhiệt độ tăng cao, cấu hình không gian enzyme bò thay đổi enzyme bò kết tủa bất thuận nghòch [73] – Tỷ trọng dung môi nhỏ độ nhớt thấp, kết tủa dễ tách – Độ dài mạch carbon dung môi dài khả gây biến tính bất thuận nghòch tăng [83]  Phương pháp thực Thông thường, người ta bổ sung dung môi vào dung dòch enzyme với tỉ lệ thể tích đònh Sau đó, dung dòch enzyme cần khuấy để yên thời gian nhằm tạo điều kiện kết tủa thuận lợi Khi enzyme kết tủa hết cần phải tách trình ly tâm lạnh Trong kết tủa phần dung môi Lượng dung môi tách phương pháp bốc áp suất chân không LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 26 2.2.2.3 Kết tủa enzyme sử dụng polyethylen glycol (PEG)  Nguyên tắc Cơ chế kết tủa enzyme PEG giống với chế kết tủa dung môi hữu Trong dung dòch có PEG, enzyme bò tách từ vùng có PEG, nồng độ tăng dần lên kết tủa Tương tác PEG protein tương tác hóa học PEG tách khỏi kết tủa phương pháp siêu lọc Việc sử dụng PEG để tinh protein không làm ảnh hưởng đến bước tinh sau [8, 10, 83]  Tác nhân kết tủa Polyethylene glycol (PEG) polymer ưa nước không điện li, trơ mặt hóa học PEG có khối lượng phân tử nhỏ 50.000 PEG tan nước, methanol, benzen, không tan diethyl ether, hexane PEG tác nhân kết tủa protein phổ biến, vì: – Nhiệt độ thực trình: – 30 oC; – Lượng PEG cần cho trình kết tủa ít: – 30 %; – Ít gây biến tính bất thuận nghòch protein; – Không ăn mòn thiết bò; – Không độc hại ; – Không gây cháy nổ; – Hiệu tinh cao; Tuy nhiên, PEG có vài nhược điểm khả tạo độ nhớt cao cho dung dòch nồng độ đủ lớn (> 20%) gây khó khăn cho trình lắng tách tủa Ngoài PEG, người ta dùng hợp chất khác để kết tủa protein dextran, polyethyleneimine…  Các yếu tố ảnh hưởng đến tính tan enzyme dung dòch có PEG: – Khối lượng phân tử PEG sử dụng: khối lượng phân tử tăng tính tan enzyme giảm [83] – Nồng độ PEG dung dòch: nồng độ PEG tăng tính tan enzyme giảm Tuy nhiên, nồng độ tăng làm tăng độ nhớt dung dòch Khi độ nhớt dung dòch tăng kết tủa khó tách khỏi dung dòch [83] – Bản chất hóa học phân tử enzyme, pH, nhiệt độ: ảnh hưởng đến độ tan enzyme dung dòch có PEG Tính tan enzyme thấp pH dung dòch gần pI enzyme [83] LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 27 2.2.3 KỸ THUẬT TINH SẠCH ENZYME BẰNG SẮC KÝ 2.2.3.1 Sắc ký lọc gel  Nguyên tắc Phương pháp sắc ký lọc gel (gel filtration) ứng dụng để tách hỗn hợp chất dựa vào khác kích thước, hình dạng, cấu trúc không gian, phân tử lượng (Xem hình 2.5 B) [83, 88]  Bản chất trình lọc gel Quá trình triển khai sắc ký thực thông qua tương tác pha: – Pha tónh hạt gel có cấu trúc mở, chứa liên kết ngang tạo thành mạng lưới không gian ba chiều nhồi cố đònh cột Bên bên hạt gel có mao quản kích thước nhỏ Cả cột gel giữ cân cách rửa qua dung dòch đệm – Pha động hỗn hợp gồm dòch enzyme tạp chất hòa tan khác có kích thước phân tử khác pha dung dòch đệm Dung dòch mẫu chứa enzyme cấu tử hòa tan (pha động) có kích thước khác chạy qua cột Những phân tử có kích thước lớn kích thước lỗ mao quản gel vào bên hạt gel, chúng di chuyển khoảng không gian hạt Những phân tử có kích thước nhỏ có khả khuếch tán vào bên hạt gel LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP 28 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN (A) Hình 2.5 (B) (C) Sự phân tách phân tử protein-enzyme kỹ thuật sắc ký (A) Sắc ký trao đổi ion; (B) Sắc ký lọc gel; (C) Sắc ký lực [68] Trong trình triển khai sắc ký, tính chất đặc trưng phân tử mô tả thông qua hệ số phân tách K av = (Ve – Vo)/(Vt – Vo) (fraction coefficient) Trong đó, Vt thể tích toàn cột gel, V o thể tích rỗng (thể tích dòng chạy bên hạt) V e thể tích rửa giải cấu tử cần phân tách K va đònh nghóa tỉ lệ mao quản bò phủ đầy cấu tử phân tách so với tổng số mao quản hạt gel K av không phụ thuộc vào kích thước cột mà phụ thuộc vào tính chất protein chất gel [83] Hình 2.6 Sự di chuyển phân tử bên bên hạt gel [83]  Thành phần hóa học số loại gel sắc ký lọc gel LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP 29 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN Các loại gel sử dụng dextran, agarose, polyacrylamide hỗn hợp dextran-polyacrylamide (xem bảng 2.11) Bảng 2.11 Một số loại gel dùng sắc ký lọc gel [8] Tên thương mại Loại gel Biogel Polyacrylamide (P-type) Agarose (A-type) Agarose/polyacrylamide Agarose Vinyl polymer Dextran Sephacryl/bisacrylamide Agarose Agarose liên kết chéo 1,2-dihydroxylpropyl-substituted Uetrogele (IBF, Serva) Fractogel (Merk) Sephadex (Pharmacia) Sephacryl (Pharmacia) Sepharose (Pharmacia) Glycophase (Piere) Khoảng phân đoạn, Da 100 – 400.000 1.000 – 150.000.000 60.000 – 1.300.000 25.000 – 20.000.000 100 – 5.000.000 50 – 600.000 5.000 – 1.000.000 10.000 – 40.000.000 10.000 – 1.000.000 1.000 – 350.000 Hiện nay, người ta thường sử dụng gel sephadex làm vật liệu nhồi cột Sephadex tên thương mại loại polysaccharide có nguồn gốc từ vi sinh vật – dextran Trong đó, phân tử liên kết với thông qua liên kết ngang nhờ tác dụng epichlorohydrin tạo thành “rây phân tử” Số liên kết ngang nhiều kích thước lỗ rây nhỏ [8, 10] Sephadex ngâm nước hình thành nên mạng lưới gel ba chiều Các loại sephadex trương nở nước vài dung môi phân cực không trương methanol, ethanol, acid acetic Sephadex không tương tác với ion trung hòa điện Nếu bò oxy hóa mạnh dung dòch cấu trúc gel bò phá vỡ, trong dung dòch acid mạnh glucoside gel bò thủy phân [8, 83]  Một số tượng ý tiến hành lọc gel [83] – Hiện tượng hấp phụ (Adsorption effect) tượng gặp trình lọc gel Sự hấp phụ phần gây trễ (delay) trình phân tách phân tử protein Sự hấp phụ xem gần giống tính chất trao đổi ion (ion exchange character) mà tránh cách sử dụng dung dòch đệm có lực ion lớn – Hiện tượng chảy rối (Turbulent flow) tượng xảy dòng dung dòch đệm-mẫu di chuyển từ vùng không gian hẹp hạt gel đến vùng không gian lớn Hiện tượng xảy trình sắc ký Chỉ giảm bớt tượng chảy rối cách giảm tốc độ chảy dung dòch rửa giải sử dụng hạt gel có kích thước nhỏ LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN – 30 Hiện tượng không ổn đònh trọng lực (gravitational instability) Hiện tượng xuất mẫu đưa vào vò trí phía cột Hệ làm giảm khả khuếch tán protein vào hạt gel, từ đó, khả phân tách protein hỗn hợp bò giảm Có thể khắc phục tượng cách tiếp mẫu từ lên giảm kích thước hạt gel  Một số điều kiện tiến hành lọc gel [8, 75, 76, 83] Để tinh protein phương pháp sắc ký lọc gel, ta cần phải loại protein tạp khỏi hỗn hợp – Lựa chọn kích thước cột gel Tùy vào mục đích thí nghiệm mà lựa chọn cột gel có độ dài đường kính khác Để tinh enzyme, người ta sử dụng loại cột dài 100 cm, tỷ lệ chiều dài đường kính cột vào khoảng 25 ÷ 100 – Lựa chọn loại gel Sephadex sử dụng phổ biến trình chiết tách mà tốc độ chảy yếu tố quan trọng Biogels (hạt polyacrylamide liên kết ngang) sử dụng rộng rãi lónh vực xác đònh phân tử lượng protein Đối với phân tử có kích thước lớn (từ kích thước protein kích thước cỡ virus) gel agarose xem thích hợp Tuy nhiên, nhược điểm loại gel thường chúng mềm, dễ bò tác động áp suất (bao gồm áp suất thẩm thấu) trình sắc ký, từ đó, dễ gây tượng bóp méo (distortion), đè nén cục bộ, giảm tốc độ chảy – Lựa chọn kích thước hạt gel: kích thước hạt gel ảnh hưởng lớn đến khả phân tách protein-enzyme Thông thường, sắc ký lọc gel dùng để tinh protein-enzyme, người ta thường chọn hạt gel có kích thước nhỏ Kích thước nhỏ khắc phục tượng chảy tràn trọng lực, chảy rối tăng bề mặt tiếp xúc pha động pha tónh Tuy nhiên, gel có kích thước nhỏ, đặc biệt gel có cấu trúc mềm xuất tăng áp suất trình sắc ký dễ xảy tượng đè nén cục – Lựa chọn dung dòch đệm chiết xuất Tùy theo độ ổn đònh gel cấu tử cần chiết tách mà lựa chọn dung dòch đệm có pH thích hợp Thông thường, gel dextran polyacrylamide, pH ổn đònh khoảng ÷ 10 Gel agarose ổn đònh giới hạn pH ÷ 10 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 31 Hình 2.7 Quá trình tinh enzyme sắc ký lọc gel sử dụng hạt có kích thước lỗ mao quản khác (a) Kích thước lỗ lớn: enzyme C rửa giải chậm tách tốt khỏi protein A B không tách tốt khỏi D; (b) Kích thước lỗ nhỏ: enzyme C rửa giải nhanh hơn, tách rõ khỏi thể tích đầu A protein D [83] – Thể tích mẫu: thể tích mẫu yếu tố đònh thí nghiệm sắc ký lọc gel Thể tích mẫu lớn hay nhỏ ảnh hưởng không tốt đến trình phân tách Khi tinh enzyme, thể tích mẫu chiếm khoảng 1-5% thể tích cột Hình 2.8 Ảnh hưởng thể tích mẫu đến hiệu phân tách cấu tử sắc ký lọc gel (i) Thể tích đầu (V o); (ii) 2% thể tích mẫu – phân tán mẫu tốt (lý tưởng); (iii) 4% thể tích mẫu – thể tích mẫu lớn thể tích lý tưởng làm cho thể tích rửa giải lớn hơn; (iv) Thể tích mẫu lớn dẫn đến mẫu bò phân tán nhiều [83] – Tốc độ dòng chảy qua gel phụ thuộc vào nhiều yếu tố bao gồm chiều dài cột, kiểu kích thước hạt gel Để đảm bảo an toàn chung cho rửa giải cột gel tốc độ dòng chảy phải thấp nhiều so với dòng chảy tự Tốc độ dòng chảy cao làm giảm độ khuếch tán mẫu làm rộng miền khuếch tán chủ yếu làm cân nội LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 32 cấu tử cần chiết tách bề mặt mao quản gel Tuy nhiên, tốc độ rửa giải thấp làm chậm trình phân tích mà làm tăng phân tán mẫu Do đó, loại gel đòi hỏi phạm vi giới hạn tốc độ chảy khác tùy theo kích thước gel Thông thường, gel kích thước nhỏ, điều chỉnh tốc độ chảy lên đến 15-25 mL/giờ mà không gây cân nội phân tán mẫu Ngược lại, gel kích thước lớn tốc độ chảy thường chọn 5-10 mL/giờ 2.2.3.2 Sắc ký trao đổi ion (Ion-exchanged chromatography) 1- Nguyên lý phương pháp: Phương pháp sắc ký trao đổi ion coi dạng đặc biệt sắc ký hấp phụ mà cấu tử mang điện mẫu có khả tương tác tónh điện cách thuận nghòch với pha tónh hạt nhựa mang điện trái dấu, pha động dung dòch điện ly Lực liên kết phụ thuộc vào bán kính ion mật độ ion pha tónh (số điện tích đơn vò thể tích phân tử) [83] Hình 2.9 Mô trao đổi ion diễn trình sắc ký Phân tử protein tích điện âm tương tác tónh điện với ion dương dung dòch rửa giải (HTris +) Khi qua bề mặt chất mang (hạt anionite), protein có lực tónh điện mạnh tương tác với hạt chất mang, ion dương tương tác với ion âm (Cl-) môi trường 2- Nhựa trao đổi ion [10, 75] Nhựa cấu tạo hợp chất cao phân tử bao gồm khung carbon có mang nhóm chức hoạt động nối với ion di động LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 33 lực tónh điện Ion di động tham gia cân trao đổi ion Có hai loại nhựa chính: – Cationit: Ứng với trao đổi ion dương, hạt nhựa chứa nhóm hoạt động anion có tính acid Ví dụ, -SO 3-, -PO42-, -COO- – Anionit: Ứùng với trao đổi ion âm, hạt nhựa chứa nhóm hoạt động mang điện cation có tính base Ví dụ, -N +(CH3)3, -CH2N+R3 3- Quy trình thực hiện: gồm bước [10] – Bước 1: Nhồi hạt nhựa trao đổi ion cột – Bước 2: Đưa mẫu phân tích vào cột – Bước 3: Các thành phần mẫu (gồm cấu tử tích điện âm, dương trung hòa điện) qua cột có phần tử mang điện trái dấu kết hợp với hạt nhựa, thành phần khác không bò giữ lại pha tónh nhanh chóng chạy khỏi cột – Bước 4: Dùng pha động có lực ion lớn đẩy ion mẫu khỏi hạt nhựa – Bước 5: Tái sinh cột 2.2.3.3 Sắc ký lực (Affined chromatography) 1- Nguyên tắc Phương pháp dựa khả giữ enzyme chất không hòa tan Sự phân tách thực nhờ vào đặc tính sinh học cấu tử 2- Ligand chất mang Ligand sử dụng sắc ký lực hợp chất có khả tương tác đặc hiệu với hợp chất cần phân tách Ligand cố đònh phân tử chất mang nhờ liên kết cộng hoá trò Đối với chất cần phân tách enzyme, ligand coenzyme, cofactor chất có cấu tạo tương đồng với chất Chất mang polymer trơ mặt hóa học, bò biến đổi agarose, polyacrylamide, sepharose 3- Quy trình thực Cho hỗn hợp mẫu qua cột Trong cột chứa chất mang có gắn hợp chất ligand có khả tương tác đặc hiệu với enzyme Như vậy, enzyme tương tác với ligand giữ lại, protein khác thoát khỏi cột Sau enzyme đẩy dung dòch có pH thay đổi hay có lực ion tăng LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 34 Hình 2.10 Mô nguyên tắc hoạt động sắc ký lực Ligand (L) gắn lên phân tử chất mang nhờ liên kết cộng hoá trò Chỉ có enzyme (E) có khả tương tác với cấu tử Ligand giữ lại lâu chất mang Các protein (P) khả tương tác với ligand chạy qua cột [83] 2.2.4 MỘT SỐ KẾT QUẢ TRONG LĨNH VỰC TINH SẠCH PECTINASE Các nghiên cứu lónh vực tinh pectinase tiến hành từ năm 1960, nay, chưa có phương pháp xem thật có hiệu lónh vực tinh pectinase Do đó, vấn đề quan trọng cần đặt phải biết lựa chọn phương pháp kết hợp chúng với để tạo nên quy trình tinh thật hài hoà đạt hiệu cao [10, 34] Bảng 2.12 trình bày tóm tắt số kết nghiên cứu tinh enzyme pectinase từ vi sinh vật [14, 21, 22, 26, 35, 42, 47, 57, 61, 62, 66, 96] LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP 35 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN Bảng 2.12 Tổng hợp số nghiên cứu tinh enzyme pectinase từ vi sinh vật [34] Vi sinh vật Asp niger Erwinia carotava Rhizopus stolonifer Loại enzyme Exo-PG I PG II Endo-pectate lyase I Endo-pectate lyase II Endo-pectate lyase III Endo-pectate lyase IV EndoPolygalaturonase Curvularia inaequalis Pectin lyase Bacillus macerans Endo-Pectate lyase Arthrobotrys oligospora Pectinmethylesteras e Amycolata sp Pectate lyase Asp awamori IFO 4043 Endo-PGase X2 Bacillus sp Exo-PG Acrophialoph ora nainiana Pectinase bào Asp niger Endo-PGase ngoại LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Phương pháp tinh DEAE-cellulose Kết tủa đẳng điện (2 lần) Hiệu suất thu hồi, % 8.6 1.0 60.2 61.1 60.4 59.5 Độ tinh Tác giả 209.0 205.0 54.2 53.8 55.2 56.8 Mill P.J., 1966 Tanabe H cộng sự, 1984 Manachini P.L cộng sự, 1987 Siêu lọc Kết tủa với ethanol 1:2 CM-sepharose 6B Sephadex G-100 Kết tủa (NH4)2SO4 Sephadex G-100 DEAE-cellulose (NH4)SO4 80% DEAE-sephadex A-50 CM-cellulofine (1) CM-cellulofine (2) Kết tủa (NH4)2SO4 Hydroxyapatide Sephadex G-100 DEAE-sepharose Mono S Phenyl-Superose 89.0 77.0 62.0 55.0 2.1 9.2 77.0 82.0 86.8 70.1 46.1 3.9 16.44 50.9 64.0 55.0 47.0 28.0 62.5 52.5 46.3 89.7 69.8 36.6 8.3 19.0 34.4 37.0 10.0 14.3 26.4 1.3 2.8 3.6 DEAE-Toyopearl CM-Toyopeal (1) CM-Toyopeal (2) Superdex 75 CM-Toyopearl SuperQ-Toyopearl DEAE-Bio-Gel A (pH 9) DEAE-Bio-Gel A (pH 6) Bio-gel A-0.5m Sepharyl S-100 DEAE-Sepharose Sephadex G-50 Kết tủa (NH4)2SO4 - Phân đoạn 60% - Phân đoạn 60-100% CM-Sephadex C-50 - CMC-I - CMC-II 30.1 22.3 5.3 3.0 52.0 44.0 25.0 11.0 8.4 4.8 9.2 9.4 1.63 236.0 272.0 349.0 1.3 11.0 22.0 137.0 284.0 122.0 81.0 66.6 70.0 46.0 1.4 7.0 22.0 66.3 Afifi A.F cộng sự, 1988 Miyazaki Y., 1990 Jaffar M.B cộng sự, 1993 Bru¨hlman n cộng sự, 1995 Nagai M cộng sự, 2000 Kobayashi T cộng sự, 2001 Celestino cộng sự, 2006 Guo C.-T cộng sự, 2001 ... polygalacturonase vi sinh vật phương pháp nuôi cấy bề sâu [28] Hiện nay, công nghiệp sản xuất enzyme nói chung, hầu hết nhà sản xuất sử dụng phương pháp nuôi cấy bề sâu phương pháp có ưu điểm sau: [8,... hiệu suất sinh tổng hợp enzyme, phương pháp nuôi cấy (canh trường bề mặt hay bề sâu), thành phần môi trường nuôi cấy (cơ bản, phổ biến kinh tế), điều kiện nuôi cấy (liên quan đến pH độ bền nhiệt... VĂN TỐT NGHIỆP 18 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 2.1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình nuôi cấy thu nhận pectinase từ nấm sợi canh trường nuôi cấy bề sâu 1- Tỷ lệ giống cấy Theo quy luật, tỷ lệ giống cấy