Lan rừng ở Gia Lai rất phong phú và nhiều chủng loại. Trong đó Hoàng thảo (Dendrobium) là chi phổ biến và có giá trị về nhiều mặt. Tam bảo sắc, Hạc vỹ, Hoàng thảo ngọc thạch là ba loài lan rừng đẹp và quý hiếm thuộc chi Dendrobium, nằm trong Sách đỏ Việt Nam. Ngày nay, do nạn phá rừng và khai thác quá mức, ba loại lan này đang mất dần trong tự nhiên.
Bảo tồn nhân giống số loại lan rừng quý tỉnh Gia Lai phương pháp nuôi cấy mơ tế bào thực vật KS.TRẦN THỊ THÚY, KS.NGƠ LÊ HỒNG DUYÊN Trung tâm Ứng dụng tiến Khoa học Công nghệ tỉnh Gia Lai Đặt vấn đề Lan rừng Gia Lai phong phú nhiều chủng loại Trong Hồng thảo (Dendrobium) chi phổ biến có giá trị nhiều mặt Tam bảo sắc, Hạc vỹ, Hoàng thảo ngọc thạch ba loài lan rừng đẹp quý thuộc chi Dendrobium, nằm Sách đỏ Việt Nam Ngày nay, nạn phá rừng khai thác mức, ba loại lan dần tự nhiên Vì khơng có biện pháp bảo vệ nhân giống kịp thời, lồi lan có nguy tuyệt chủng Hạt hoa lan nói chung ba loại lan nói riêng khơng có nội nhũ nên nảy mầm có nấm cộng sinh thích hợp nên việc nhân giống tự nhiên khó khăn, nhân giống keiky phương pháp sử dụng phổ biến để nhân giống loại lan rừng hệ số nhân thấp Nuôi cấy mô tế bào thực vật từ lâu lựa chọn phương pháp hàng đầu để nhân giống loại q hiếm, khó nhân giống ngồi tự nhiên cho số lượng giống lớn thời gian ngắn giữ nguyên đặc tính quý bố mẹ Việc nhân giống thành công loại lan rừng quý phương pháp ni cấy mơ góp phần bảo tồn loại lan rừng quý hiếm, đáp ứng nhu cầu thị trường đồng thời giảm áp lực khai thác mức loại lan tự nhiên Vật liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Vật liệu Các chồi lan rừng thu hái Vườn quốc gia Kon Ka Kinh (huyện Mang Yang, tỉnh Gia Lai) Các cụm lan lựa chọn làm vật liệu ban đầu phải chứa nhiều chồi (giả hành), chồi khỏe mạnh, dày, khơng có dấu hiệu sâu bệnh 2.2 Phương pháp nghiên cứu - Ảnh hưởng chất khử trùng thời gian khử trùng đến khả tạo mẫu thể chồi lan Hạc vỹ, Hoàng thảo ngọc thạch, Tam bảo sắc: chồi lan rửa vịi nước chảy, tách bỏ vảy, sau rửa lại với xà phịng lỗng khoảng 5-10 phút để loại bỏ chất bẩn bám bề mặt Cắt thành đoạn có chứa mắt ngủ dài từ 1,5-2cm đưa vào tủ cấy vô trùng Tiếp theo mẫu cấy khử trùng cồn (ethanol) 70o 60 giây, rửa lại nhiều lần với nước cất vơ trùng Bố trí thí nghiệm khảo sát điều kiện vô mẫu sử dụng NaOCl 5% để tiếp tục khử trùng thời gian 10, 15 20 phút HgCl2 0,1% 5, 10 phút Tráng lại mẫu lần nước cất vô trùng Các mẫu sau khử trùng cấy vào môi trường nuôi cấy khởi đầu để đánh giá hiệu khử trùng Thí nghiệm bố trí theo kiểu hồn tồn ngẫu nhiên với lần lặp lại Mỗi lần lặp lại mẫu/lồi/cơng thức Các tiêu theo dõi: (số mẫu sạch) Tỷ lệ mẫu (%) = ——————— x 100 (tổng số mẫu) (số mẫu tái sinh) Tỷ lệ mẫu tái sinh (%) = ——————— x 100 (tổng số mẫu) - Khảo sát ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng BA Kinetin đến khả tạo cụm chồi lan Hạc vỹ, Hoàng thảo ngọc thạch Tam bảo sắc: chồi lan tuần tuổi mơi 15 SỐ 06 NĂM 2019 KHOA HỌC KỸ THUẬT TẠP CHÍ KHOA HỌC CƠNG NGHỆ VÀ MƠI TRƯỜNG 16 KHOA HỌC KỸ THUẬT trường ni cấy khởi động chuyển sang mơi trường nhân nhanh chồi Thí nghiệm bố trí yếu tố theo kiểu hồn tồn ngẫu nhiên với lần lặp lại (yếu tố A gồm nồng độ BA ký hiệu sau: B1: mg/L, B2: 0,1 mg/L, B3: 0,3 mg/L; yếu tố B gồm nồng độ Kinetin ký hiệu sau: K1: mg/L, K2: 0,1 mg/L, K3: 0,3 mg/L).Mỗi lần lặp lại mẫu/lồi/cơng thức Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng chất điều hịa sinh trưởng thực vật BA kết hợp với Kinetin lên khả tạo cụm chồi lan Hạc vỹ, Hoàng thảo ngọc thạch, Tam bảo sắc BA (mg/L) Kinetin (mg/L) 0,1 0,3 B1K1 B2K1 B3K1 0,1 B1K2 B2K2 B3K2 0,3 B1K3 B2K3 B3K3 Các tiêu theo dõi: (Số chồi hình thành) HSN chồi (%) = —————————— x 100 (Số chồi ban đầu) Hình thái chồi - Khảo sát ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng NAA đến khả tạo lan in vitro hoàn chỉnh: Các chồi invitro lan Hạc vỹ, Hoàng thảo ngọc thạch, Tam bảo sắc đủ 2-3 thật, cao 2-3cm chuyển sang mơi trường tạo rễ với nồng độ NAA theo thí nghiệm (Bảng 2.2) Thí nghiệm bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với lần lặp lại Mỗi lần lặp lại 10 mẫu/công thức Các tiêu theo dõi bao gồm số rễ trung bình (rễ/ chồi), chất lượng rễ Bảng 2.2 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng thực vật NAA lên khả tạo lan Hạc vỹ, Hoàng thảo ngọc thạch, Tam bảo sắc in vitro hoàn chỉnh STT Ký hiệu công thức N1 N2 N3 N4 N5 Nồng độ NAA (mg/L) 0,2 0,5 0,7 Tất môi trường nuôi sử dụng môi trường Knuds, bổ sung 20g/l saccarose + 100ml/l nước dừa + 0,5g/l than hoạt tính + 7g/l agar chất kích thích sinh trưởng khác tùy thuộc vào giai đoạn nuôi cấy, riêng môi trường tạo cum chồi bổ sung 0,2 mg/l NAA Môi trường điều chỉnh pH=5,8, khử trùng 121oC, áp suất 1atm 20 phút Điều kiện nuôi cấy: nhiệt độ 25oC, cường độ ánh sáng 2000 lux; thời gian chiếu sáng: 10 giờ/ngày Kết thảo luận 3.1 Ảnh hưởng chất khử trùng thời gian khử trùng đến khả tạo mẫu tái sinh lan Hạc vỹ, Hoàng thảo ngọc thạch Tam bảo sắc Các đoạn chồi lan sau khử trùng dung dịch HgCl2 0,1% NaClO 5% thời gian khác cấy vào môi trường nuôi cấy khởi động Sau tuần ni cấy, kết q trình thực nghiệm trình bày bảng 3.1 Bảng 3.1 Ảnh hưởng chất khử trùng thời gian khử trùng đến khả tạo mẫu tái sinh lan Hạc vỹ, Hoàng thảo ngọc thạch, Tam bảo sắc CTTN KT1 Chất khử trùng NaClO 5% Tỷ lệ mẫu (%) Tỷ lệ mẫu tái sinh (%) Thời gian khử trùng Hạc Hoàng thảo Tam bảo Hạc Hoàng thảo Tam bảo (phút) vỹ ngọc thạch sắc vỹ ngọc thạch sắc 10 16,67 13,33 10 16,67 13,33 KT2 15 63,33 60 60 60 56,67 60 KT3 20 66,67 63,33 60 46,67 46,67 43,33 KT4 HgCl2 0,1% 10 33,33 36,66 30 30 30 30 KT5 86,67 83,33 80 60 56,67 56,67 KT6 10 93,33 90 90 23,33 23,33 26,67 Tỷ lệ mẫu tất công thức thí nghiệm tăng thời gian khử trùng tăng Đối với nhóm cơng thức khử trùng với HgCl2 0,1% đạt cao lan Hạc Vỹ 93,33% với thời gian khử trùng 10 phút, nhóm cơng thức NaClO 5% đạt tỷ lệ cao 66,67% khử trùng Hạc vỹ Tuy nhiên sử dụng chất khử trùng thời gian dài tỷ lệ mẫu tái sinh giảm, điều thấy rõ sử dụng HgCl2 0,1% để khử trùng thời gian 10 phút (tỷ lệ mẫu tái sinh ba loại lan 30% dù tỷ lệ mẫu 90%) Căn vào kết chọn cơng thức khử trùng HgCl2 0,1% phút NaClO 5% 15 phút Ở thấy chênh lệch tỷ lệ mẫu ba loại lan sử dụng chất khử trùng thời gian giống Hạc vỹ loại lan thu tỷ lệ mẫu lớn nhất, lý cấu tạo hình thái chồi (giả hành) khác ba loại lan, dẫn đến hiệu khử trùng khác 3.2 Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng thực vật BA kết hợp với Kinetin lên khả tạo cụm chồi lan Hạc vỹ, Hoàng thảo ngọc thạch, Tam bảo sắc Bảng 3.2 Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng thực vật BA kết hợp với Kinetin lên khả tạo cụm chồi lan Hạc vỹ, Hoàng thảo ngọc thạch, Tam bảo sắc Hệ số nhân cụm chồi (%) Hình thái chồi CTTN Hạc Hồng thảo Tam bảo Hạc Hoàng thảo Tam bảo vỹ ngọc thạch sắc vỹ ngọc thạch sắc B1K1 0,9 0,8 0,95 + B1K2 B1K3 + 2,85 2,9 2,85 + 3,8 3,65 3,75 + + B2K1 3,35 3,15 3,15 + + + B2K2 3,3 3,2 3, ++ ++ ++ B2K3 3,85 3,7 3,7 ++ ++ ++ B3K1 4,65 4,3 4,45 +++ +++ +++ B3K2 4,8 4,7 4,7 +++ +++ +++ B3K3 5,55 5,3 5,45 +++ +++ +++ + + + + Ghi chú: (+): chồi nhỏ, ngắn màu xanh nhạt, (++): chồi trung bình, kích thước khơng đồng đều, (+++): chồi mập, màu xanh đậm, kích thước đồng Kết thực nghiệm sau tuần cho thấy: hệ số nhân nhanh chồi có khác biệt rõ ràng cơng thức thí nghiệm (đạt từ 0,9 đến 5,55 %) Nhìn chung bổ sung riêng rẽ Kinetin BA hệ số nhân chồi thấp so với phối hợp chúng với Ở môi trường sử dụng tổ hợp 0,3mg/l Kinetin + 0,3 mg/l BA cho hệ số nhân nhanh chồi cao loại lan (từ 5,3 đến 5,55 %), chất lượng thể chồi tốt, chồi to, mập, đồng 3.3 Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng thực vật NAA kết lên khả tạo lan in vitro hoàn chỉnh Khi khảo sát ảnh hưởng NAA lên khả rễ loại lan Hạc vỹ, Hoàng thảo ngọc thạch, Tam bảo sắc, nhận thất công thức N3 có bổ sung 0,5mg/l NAA cho số rễ nhiều từ 3,95 - 4,08 rễ/ chồi, chiều dài rễ trung bình lớn từ 3,2 - 3,25cm Tuy nhiên cơng thức thí nghiệm bổ sung NAA nhiều có số lượng rễ chiều dài rễ ngắn Bảng 3.3 Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng thực vật NAA lên khả tạo lan in vitro hồn chỉnh Số rễ trung bình (rễ/chồi) Chiều dài rễ (cm) CTTN Hạc Hoàng thảo Tam bảo Hạc Hoàng thảo Tam bảo vỹ ngọc thạch sắc vỹ ngọc thạch sắc N1 1,58 1,75 1,58 1,8 1,68 1,7 N2 3,03 3,05 2,76 2,59 2,65 N3 3,95 3,98 4,08 3,23 3,2 3,25 N4 3,63 3,55 3,55 3,01 2,9 3,1 N4 3,45 3,43 3,4 2,72 2,79 2,81 Kết luận - Khử trùng chồi (giả hành) lan Hạc vỹ, Tam bảo sắc, Hoàng thảo ngọc thạch HgCl2 0,1% phút khử trùng NaClO 5% 15 phút cho tỷ lệ mẫu mẫu tái sinh cao (mẫu tái sinh đạt 55%) - Môi trường Knuds bổ sung 20g/l saccarose + 100ml nước dừa + 0,5g/l than hoạt tính + 7g/l agar + 0,3 mg/l BA + 0,3 mg/l Kinetin cho hệ số nhân nhanh chồi đạt cao (từ 5,3-5,55%), chất lượng chồi tốt, chồi to, mập - Môi trường Knuds bổ sung 20g/l saccarose + 100ml nước dừa + 0,5g/l than hoạt tính + 7g/l agar + 0,5mg/l NAA cho tỷ lệ chồi rễ đạt cao (từ 3,95 - 4,08 rễ/ chồi), chiều dài rễ lớn (từ 3,2 - 3,25cm)./ TÀI LIỆU THAM KHẢO Trần Văn Minh, Nguyễn Văn Uyển (2001).Vi nhân giống phong lan Dendrobium quy mô cơng nghiệp Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, 1,1-9 Nguyễn Thị Quỳnh Trang, Vũ Thị Kim Huệ, Khuất Thị Hải Ninh, Nguyễn Thị Thơ (2013) Nhân giống in vitro lan Phi điệp tím (Dendrobium anosmum) Tạp chí Khoa học Công nghệ Lâm nghiệp,3,16-21 Asghar S, Ahmad T, Ahmad Hafiz I et al (2011) In vitro propagation of orchid (Dendrobium nobile) var Emma white African journal of Biotechnology, 10(16), 3097-3103 17 SỐ 06 NĂM 2019 KHOA HOÏC KỸ THUẬT ... thời gian khử trùng đến khả tạo mẫu tái sinh lan Hạc vỹ, Hoàng thảo ngọc thạch Tam bảo sắc Các đoạn chồi lan sau khử trùng dung dịch HgCl2 0,1% NaClO 5% thời gian khác cấy vào môi trường nuôi cấy. .. thấy chênh lệch tỷ lệ mẫu ba loại lan sử dụng chất khử trùng thời gian giống Hạc vỹ loại lan thu tỷ lệ mẫu lớn nhất, lý cấu tạo hình thái chồi (giả hành) khác ba loại lan, dẫn đến hiệu khử trùng... Tất môi trường nuôi sử dụng môi trường Knuds, bổ sung 20g/l saccarose + 100ml/l nước dừa + 0,5g/l than hoạt tính + 7g/l agar chất kích thích sinh trưởng khác tùy thuộc vào giai đoạn nuôi cấy,