Nghiên cứu tinh sạch Endo-PGase từ canh trường nuôi cây bẻ sau Asperrgillus awamori bằng sắc ký lọc gel

KHẢO SÁT HIỆU QUẢ TINH SẠCH ENDO-PGase BẰNG SẮC KÝ KHẢO SÁT HIỆU QUẢ TINH SẠCH ENDO-PGase BẰNG SẮC KÝ LỌC GEL

Kết quả lọc gel đối với enzyme đã qua kết tủa với ammonium sulphate 70%

Điều này một lần nữa khẳng định protein-enzyme có trong chế phẩm mà chúng tôi cần tinh sạch được phân bố chủ yếu trong các peak 5, 6, 7. – Kết quả đo hàm lượng protein và hoạt tính endo-PGase cho thấy, tổng số đơn vị hoạt độ chế phẩm sau lọc gel thu hồi được là 51.014U và lượng protein tương ứng là 3.073mg. – Lý luận tương tự như ở thí nghiệm trong phần 4.2.1, do hoạt tính endo-PGase chủ yếu tập trung ở các peak 5,6 và 7 nên chúng tôi chỉ thu lấy 3 phân đoạn này làm chế phẩm tinh sạch cuối cùng.

Tương tự, chế phẩm sau khi thu hồi được bảo quản ngay trong điều kiện lạnh đông để chuẩn bị cho bước khảo sát tiếp theo. * Kết quả thu hồi hoạt tính và độ tinh sạch của chế phẩm bằng phương pháp sắc ký lọc gel được tính trên các phân đoạn 5, 6 và 7. * Kết quả thu hồi hoạt tính và độ tinh sạch của chế phẩm bằng phương pháp lọc gel tính trên các phân đoạn 5, 6 và 7.

– Trong tất cả các trường hợp, độ tinh sạch của chế phẩm sau khi qua lọc gel đều tăng lên đáng kể so với enzyme thô và enzyme đã qua kết tủa. Sau khi lọc gel, độ tinh sạch của chế phẩm cũng đạt được giá trị cao nhất là 47.2 lần, tức là tăng thêm được 5.49 lần so với sau khi kết tủa enzyme. Tuy nhiên, hiệu suất thu hồi hoạt tính enzyme sau quá trình lọc gel giảm xuống còn 51.60% (giảm 37% so với hiệu suất kết tủa enzyme).

Như vậy, phương án sử dụng enzyme đã qua kết tủa bởi isopropanol thích hợp trong vấn đề tinh sạch chế phẩm hơn là thu hồi hoạt tính chế phaồm. Để thuận tiện cho việc so sánh, chúng tôi lập bảng 4.15 để đánh giá hiệu quả kinh tế cho từng phương án tinh sạch. Theo đó, nếu không tính đến độ tinh sạch của chế phẩm thì phương án có sử dụng ammonium sulphate là phương án mang tính khả thi cao và dễ áp dụng ở quy mô công nghiệp.

***Chi phí thu hồi cho 1 đơn vị hoạt độ chế phẩm sau quá trình lọc gel: chưa tính đến chi phí cho quá trình lọc gel. Như vậy, từ những kết quả thu được, chúng tôi đề xuất sử dụng phương pháp kết tủa enzyme bằng ammonium sulphate 70% kết hợp với sắc ký lọc gel để tinh sạch pectinase. Chế phẩm thu được từ 2 giai đoạn tinh sạch nói trên được sử dụng để nghiên cứu các tính chất động học trong phần tiếp theo.

XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA CHẾ PHẨM XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA CHẾ PHẨM

Vì trong thực tế sản xuất, không phải lúc nào nhiệt độ phản ứng cũng luôn ổn định tại giá trị nhiệt độ tối thích. Để có thể xác định khoảng nhiệt độ phản ứng thích hợp, trong thí nghiệm tiếp theo chúng tôi sẽ khảo sát độ ổn định hoạt tính của chế phẩm ở các giá trị nhiệt độ khác nhau. Theo kết quả nghiên cứu từ một số loài nấm sợi, người ta thấy rằng nhiệt độ tối thích của endo-PGase thường nằm trong khoảng 30-50oC (Jayani R.

Như vậy, chế phẩm endo-PGase trong nghiên cứu của chúng tôi có nhiệt độ tối thích là tương đối cao. Trong thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành xác định hoạt tính chế phẩm ở các giá trị pH khác nhau theo trình tự đã nêu trong phần 3.2.2.3. Chúng ta đã biết, endo-PGase được ứng dụng chủ yếu trong lĩnh vực sản xuất các loại thức uống từ rau quả.

Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của chế phẩm luôn được quan tâm nhiều nhất trong sản xuất và sử dụng enzyme. Khi ứng dụng chế phẩm enzyme trong thực tế sản xuất, người ta thường quan tâm nhiều hơn đến khoảng nhiệt độ mà tại đó enzyme hoạt động ổn định và có hoạt tính cao. Khoảng nhiệt độ này thường dao động xung quanh giá trị nhiệt độ toỏi thớch cuỷa cheỏ phaồm.

Chúng tôi đã xác định được nhiệt độ và pH tối thích của chế phẩm endo-PGase là 55oC và 4.5. Trong phần này, chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến độ bền hoạt tính của enzyme. Chỉ sau 40 phút phản ứng, hoạt tính còn lại chỉ bằng 10% so với hoạt tính ban đầu và sau 240 phút phản ứng, toàn bộ enzyme gần như vô hoạt hoàn toàn.

Thực tế hiện nay, thời gian xúc tác phản ứng thủy phân pectin trong sản xuất thức uống từ rau quả thường chỉ kéo dài từ 1 đế 2 giờ. Do đó, khả năng ổn định hoạt tính ở nhiệt độ cao (55oC) trong thời gian dài (4h) cũng là một ưu điểm rất lớn đối với chế phẩm của chúng tôi. Tiếp theo, chúng tôi khảo sát ảnh hưởng của pH phản ứng đến hoạt tính chế phẩm theo thời gian.

Khi sử dụng chế phẩm, nếu pH dung dịch phản ứng bị thay đổi theo thời gian thì sẽ làm giảm hoạt tính xúc tác của chế phẩm. Do đó, trong một số trường hợp, ta có thể dùng dung dịch đệm để ổn định giá trị pH trong suốt thời gian xúc tác phản ứng.