Luận văn nghiên cứ tính sạch pectinase từ canh trường nuôi cây bẻ sau Asperrgillus awamori - chương 3.
CHƯƠNG 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 35CHƯƠNG 3Nguyên liệu và phương phápNguyên liệu và phương pháp3.1 3.1 NGUYÊN LIỆUNGUYÊN LIỆU3.1.1 Vi sinh vậtTrong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng chủng Aspergillus awamori L1 được cung cấp từ Bộ môn Công nghệ Sinh học, Đại học Bách Khoa TP. Hồ Chí Minh.Chủng nấm sợi được bảo quản trên môi trường thạch nghiêng, theo phương pháp cấy chuyền đònh kỳ. Môi trường giữ giống được được sử dụng là môi trường Czapek (Xem phụ lục A) [16]. Điều kiện bảo quản là 30oC. Thời gian giữa 2 lần cấy chuyền liên tiếp là 3 tháng. 3.1.2 Môi trường nuôi cấyTrong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng bột vỏ bưởi khô như nguồn carbon cho nấm sợi sinh trưởng và tổng hợp pectinase. Bột vỏ bưởi khô được thu nhận bằng cách sấy khô vỏ quả bưởi (Năm Roi, Tiền Giang) và nghiền thành bột có độ ẩm 7%.Môi trường cơ bản nuôi cấy nấm mốc Aspergillus awamori L1 sinh tổng hợp pectinase như sau (g/lít môi trường): hàm lượng pectin trong bột vỏ bưởi khô: 0.788; NH4NO3: 0.402; KH2PO4: 4.0; Na2HPO4, FeSO4.7H2O: 0.2; CaCl2, H3BO3: 0.01; MnSO4.7H2O: 0.07. Sau quá trình tiệt trùng ở 1210C trong 15 phút, pH môi trường được điều chỉnh đến 5.0. [4, 8,12, 52] 3.1.3 Hóa chất– Pectin chuẩn (Sigma, St Louis, US): dùng để xác đònh hoạt tính endo-polygalacturonase.– Sephadex G-75 (Pharmacia, Uppsala, Sweden): dùng để tinh sạch enzyme.– Chế phẩm Pectinex Ultra SPL (Novodisk, Denmark).LUA N VA N TO T NGHIE PÄ Ê Á Ä CHƯƠNG 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 36– Hóa chất phân tích các loại.3.2 3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUPHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU3.2.1 Sơ đồ nghiên cứuGiai đoạn 1Khảo sát quá trình tinh sạch pectinase bằng phương pháp kết tủa với các tác nhân sau:- Dung môi hữu cơ: ethanol, isopropanol, acetone- Polymer hữu cơ: PEG 4000, PEG 6000- Muối vô cơ: (NH4)2SO4, NaClChọn loại tác nhân cho hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch pectinase cao để tiếp tục tinh sạch bằng lọc gelGiai đoạn 2Khảo sát tiếp hiệu quả tinh sạch pectinase bằng phương pháp sắc ký lọc gel trên cột Sephadex G-75Giai đoạn 3Xác đònh một số tính chất đặc trưng của chế phẩm thu được:- Hệ số Km và Vmax- Nhiệt độ và pH tối thích- Độ bền nhiệt và pH của chế phẩmSo sánh tính chất của chế phẩm thu được với chế phẩm thương mạiHình 3.1 Sơ đồ nghiên cứu3.2.2 Thuyết minh sơ đồ nghiên cứu3.2.2.1 Giai đoạn 1: Tinh sạch enzyme bằng phương pháp kết tủaTrong giai đoạn đầu, chúng tôi tiến hành thu nhận enzyme pectinase từ nấm sợi Aspergillus theo phương pháp nuôi cấy bề sâu. Quá trình nuôi cấy nấm sợi để thu nhận enzyme được thực hiện trong bình lên men (Bio-stat) chứa 2,5 lít môi trường. Điều kiện nuôi cấy được tóm tắt như sau: [4, 6]– Tỉ lệ cấy giống : 34 mg chất khô bào tử/L môi trường– pH (điều chỉnh) : 5.0– Nhiệt độ (điều chỉnh) : 36oC– Thời gian nuôi : 24 giờLUA N VA N TO T NGHIE PÄ Ê Á Ä CHƯƠNG 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 37Khi quá trình nuôi cấy kết thúc, canh trường được đem ly tâm và lọc để tách bỏ pha rắn và thu nhận dòch enzyme thô. Chúng tôi tiếp tục tinh sạch chế phẩm enzyme thô bằng phương pháp kết tủa với các tác nhân sau đây:1- Dung môi hữu cơ: ethanol, isopropanol, acetonNội dung:– Khảo sát hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch của enzyme thu được khi kết tủa với các dung môi kể trên theo tỷ lệ thể tích Venzyme:Vdung môi lần lượt là 10:90; 20:80; 30:70; 40:60; 50:50; 60:40. – Chọn dung môi và tỉ lệ thích hợp để hiệu suất thu hồi enzyme và độ tinh sạch của chế phẩm pectinase là cao nhất.Thực hiện: – Chuẩn bò dung dòch enzyme thô và các dung môi: ethanol, isopropanol, acetone.– Hút dung dòch enzyme (4oC) cần kết tủa, cho vào ống nghiệm và bổ sung dung môi (-18oC) với tỉ lệ như đã dự kiến. Để quá trình kết tủa enzyme hoàn toàn cần để yên dung dòch sau khi tủa khoảng 30 phút ở 2 – 4oC.– Sau quá trình kết tủa, tiến hành ly tâm lạnh (4oC) hỗn hợp ở 5500vòng/phút trong 15 phút. Sau ly tâm, đổ bỏ phần dòch lỏng phía trên và hòa tan kết tủa vào dung dòch đệm sodium acetate pH 4.5.– Xác đònh hoạt tính chế phẩm và hàm lượng protein thu được.– Tất cả các nghiệm thức được thực hiện lặp lại 3 lần.2- Các polymer hữu cơ: PEG 6000 và PEG 4000Nội dung:– Khảo sát hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch của enzyme thu được khi kết tủa với polyethylene glycol (PEG-4000 và PEG-6000) ở các nồng độ khác nhau: 5%, 10%, 15%, 20%, 25%.– Chọn loại PEG và tỉ lệ thích hợp để hiệu suất thu hồi enzyme và độ tinh sạch của chế phẩm pectinase là cao nhất.Thực hiện:– Chuẩn bò dung dòch enzyme thô và các polymer hữu cơ (PEG-4000 và PEG-6000).– Hút 10 mL dung dòch enzyme (4oC) cần kết tủa, cho vào ống nghiệm và bổ sung tác nhân kết tủa ở dạng rắn theo tỉ lệ như đã dự kiến. Để quá trình kết tủa enzyme xảy ra hoàn toàn, cần để yên dung dòch sau khi tủa khoảng 30 phút ở 2 – 4oC.LUA N VA N TO T NGHIE PÄ Ê Á Ä CHƯƠNG 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 38– Sau quá trình kết tủa, tiến hành ly tâm lạnh (4oC) hỗn hợp ở 5500vòng/phút trong 15 phút. Sau ly tâm, đổ bỏ phần dòch lỏng phía trên và hòa tan kết tủa vào dung dòch đệm sodium acetate pH 4.5.– Xác đònh hoạt tính chế phẩm và hàm lượng protein thu được.– Tất cả các nghiệm thức được thực hiện lặp lại 3 lần.3- Muối vô cơ: ammonium sulphate và sodium chlorideNội dung:– Khảo sát hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch của enzyme thu được khi kết tủa với các muối vô cơ sau:o Ammonium sulphate: ở các nồng độ 76.1%, 65.7%, 56.1%, 47.2%, 39%, 31.4% và 25.1% w/v (độ bão hòa tương ứng là 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%).o Sodium Chloride: ở những nồng độ 35%, 30%, 25%, 20%, 15% (w/v).– Chọn loại tác nhân thích hợp sao cho hiệu suất thu hồi enzyme và độ tinh sạch của chế phẩm pectinase là cao nhất.Thực hiện:– Chuẩn bò dung dòch enzyme thô và muối.– Hút 10 mL dung dòch enzyme (4oC) cần kết tủa, cho vào ống nghiệm và bổ sung muối ở dạng tinh thể với hàm lượng như đã dự kiến. Khuấy nhẹ để muối hòa tan hoàn toàn trong dung dòch. Để quá trình kết tủa enzyme hoàn toàn cần để yên dung dòch sau khi tủa khoảng 30 phút ở 2 – 4oC.– Sau quá trình kết tủa, tiến hành ly tâm lạnh (4oC) hỗn hợp ở 5500vòng/phút trong 15 phút. Sau ly tâm, đổ bỏ phần dòch lỏng phía trên và hòa tan kết tủa vào dung dòch đệm sodium acetate pH 4.5.– Xác đònh hoạt tính chế phẩm và hàm lượng protein thu được.– Tất cả các nghiệm thức được thực hiện lặp lại 3 lần.3.2.2.2 Giai đoạn 2: Tinh sạch endo-PGase bằng phương pháp lọc gelNội dung:Khảo sát hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch của enzyme bằng phương pháp sắc ký lọc gel (Sephadex G-75), sử dụng chế phẩm pectinase thu được sau giai đoạn tinh sạch bằng LUA N VA N TO T NGHIE PÄ Ê Á Ä CHƯƠNG 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 39phương pháp kết tủa. Từ đó, đề xuất quy trình tinh sạch chế phẩm pectinase, sử dụng kết hợp 2 phương pháp: kết tủa enzyme và sắc ký lọc gel.Thực hiện:Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng cột sắc ký có φ=2 cm và l=50 cm. Cột được nhồi bằng gel sephadex G-75. Phương pháp chuẩn bò cột và phân tích được trình bày trong phần phụ lục C. Khi cột gel đã sẵn sàng, chúng tôi triển khai quá trình lọc gel theo từng bước sau đây:– Bước 1: Kết tủa dòch enzyme thô bằng các tác nhân như ethanol, isopropanol, ammonium sulphate. Điều kiện thí nghiệm tương tự như đã trình bày trong phần 3.2.2.1. Sau khi kết tủa enzyme xong, hòa tan kết tủa vào một lượng thể tích nhất đònh dung dòch đệm acetate 0.05N sao cho nồng độ enzyme dao động trong khoảng 1-10mg/mL.– Bước 2: Hút một lượng thể tích enzyme nhất đònh sau tinh sạch ở bước 1, cho vào cột và triển khai quá trình sắc ký qua cột gel. Mỗi thí nghiệm được thực hiện 3 lần ứng với mỗi loại tác nhân kết tủa để so sánh hiệu quả tinh sạch. Trình tự thực hiện phương pháp sắc ký lọc gel được trình bày trong phụ lục C.3.2.2.3 Giai đoạn 3: Xác đònh một số tính chất của chế phẩm sau tinh sạch3.2.2.3.1 Xác đònh pH tối thích và nhiệt độ tối thích của chế phẩmNhiệt độ tối thích của chế phẩmTiến hành xác đònh hoạt tính của chế phẩm ở nhiều giá trò nhiệt độ khác nhau (30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70oC) tại pH 4.5. Nhiệt độ tối thích của chế phẩm được đònh nghóa là nhiệt độ mà tại đó hoạt tính chế phẩm là cao nhất.pH tối thích của chế phẩmTiến hành xác đònh hoạt tính của chế phẩm ở những giá trò pH của dung dòch phản ứng khác nhau: 3.0; 3.5; 4.0; 4.5; 5.0; 5.5; 6.0; 6.5; 7.0. Phản ứng được thực hiện tại nhiệt độ tối thích của chế phẩm. 3.2.2.3.2 Khảo sát độ bền nhiệt và pH của chế phẩmĐộ bền nhiệt của chế phẩmGiữ chế phẩm ở nhiều giá trò nhiệt độ khác nhau từ 40 đến 70oC tại pH 4.5. Sau những khoảng thời gian xác đònh, tiến hành đo hoạt tính hoạt tính enzyme thu được. Khảo sát độ bền nhiệt của chế phẩm trong 4 giờ.LUA N VA N TO T NGHIE PÄ Ê Á Ä CHƯƠNG 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 40Độ bền pH của chế phẩmGiữ dung dòch chế phẩm ở trong các dung dòch đệm có pH khác nhau từ 4.0 đến 7.0 tại nhiệt độ phòng và nhiệt độ tối thích của chế phẩm. Sau những khoảng thời gian xác đònh, đo hoạt tính của chế phẩm.3.2.2.3.3 Các thông số động học của endo-polygalacturonaseMục đích:So sánh khả năng xúc tác của các chế phẩm pectinase thông qua 2 thông số động học quan trọng là Km và Vmax. Nội dung: xác đònh Km và Vmax theo phương pháp Lineweaver & Burk.Thực hiện:– Chọn các nồng độ cơ chất ([S]pectin) khác nhau: 0.5÷6.0g/L.– Thể tích dung dòch cơ chất pectin là 15mL dung dòch pectin. Cơ chất được pha trong đệm acetate 0.1N (pH 4.5). Hút 0.5mL chế phẩm pectinase sau quá trình tinh sạch bằng phương pháp lọc gel và cho vào hỗn hợp. Phản ứng được tiến hành ở 55oC và được khuấy liên tục trong suốt thời gian phản ứng. Sau những thời điểm khác nhau (t = 0, 1, 2, 4, 6 phút) lấy mẫu một lần để xác đònh độ nhớt của dòch thủy phân. Mẫu trước khi tiến hành phân tích phải được vô hoạt ở 100oC trong 5 phút.– Ứng với mỗi nồng độ cơ chất, xác đònh vận tốc ban đầu của phản ứng thuỷ phân. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đònh nghóa vận tốc phản ứng là độ giảm độ nhớt tương đối (tính bằng % so với độ nhớt ban đầu) của dòch thuỷ phân theo thời gian (t). Từ đó, xây dựng đường cong µ = f(t) biểu diễn tương quan giữa độ nhớt dòch thuỷ phân theo thời gian. Vận tốc ban đầu của phản ứng được xác đònh bởi công thức: o0dVdttµ== −.– Xây dựng đường cong mo max maxK1 1 1 1=f + .V [S] V V [S] = . Từ đó, xác đònh được Km và Vmax.LUA N VA N TO T NGHIE PÄ Ê Á Ä CHƯƠNG 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 41 Tung đo ä gốùcHoành độ gốcHệ số go ùc1[S]Hình 3.2 Đồ thò xác đònh Km và Vmax theo phương pháp Lineweaver & Burk3.2.3 Các phương pháp phân tích3.2.3.1 Xác đònh hoạt tính endo-polygalacturonaseEndo-polygalacturonase tác dụng phân cắt mạch pectin, làm giảm độ nhớt của dung dòch pectin. Dùng nhớt kế, ta sẽ đo được mức độ giảm độ nhớt của dòch pectin và nhờ đó, có thể xác đònh gián tiếp hoạt tính endo-polygalacturonase.Trong nghiên cứu này, một đơn vò hoạt độ (U) của endo-polygalacturonase được đònh nghóa là lượng enzyme cần để thủy phân làm giảm 50% độ nhớt của dòch pectin có nồng độ 1% (w/v) sau thời gian 30 phút ở 45oC.Trình tự tiến hành được trình bày chi tiết ở phụ lục B.1.3.2.3.2 Đònh lượng protein hòa tan bằng phương pháp Lowry Nguyên tắc của phương pháp dựa trên phản ứng tạo màu giữa gốc Tyrosine và Tryptophan (2 thành phần acid amin thường gặp trong protein) của phân tử protein với thuốc thử Folin. Cường độ màu của hợp chất tạo thành sau phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ protein trong 1 phạm vi nhất đònh. Dựa vào phương trình đường chuẩn, ta có thể xác đònh được hàm lượng protein trong mẫu thí nghiệm. Hợp chất tạo thành có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 750nm. Trình tự tiến hành được trình bày chi tiết ở phụ lục B.2.LUA N VA N TO T NGHIE PÄ Ê Á Ä CHƯƠNG 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 423.2.4 Các công thức tính toán3.2.4.1 Tinh sạch enzyme bằng phương pháp kết tủa– Hoạt tính riêng của chế phẩm (Hei, U/mg protein):eiTổng số đơn vò hoạt độ của enzyme có trong mẫu (U)HTR = Tổng hàm lượng protein có trong mẫu (mg)Trong đó: Hei: Hoạt tính enzyme thô (i=0) hoặc sau quá trình kết tủa (i=1) (U/mL);– Hiệu suất thu hồi enzyme sau quá trình kết tủa (HSTHe1):.100%e1Tổng số đơn vò hoạt độ của chế phẩm sau kết tủa (U)HSTH (%) = Tổng số đơn vò hoạt độ của chế phẩm trước kết tủa (U)– Độ tinh sạch của chế phẩm sau kết tủa (ĐTSe1, lần)e1Hoạt độ riêng của chế phẩm sau kết tủa (U/mg protein)ĐTS = Hoạt độ riêng của chế phẩm trước kết tủa (U/mg protein)3.2.4.2 Tinh sạch enzyme bằng phương pháp lọc gel– Tổng hàm lượng protein (C, mg/mL) của dung dòch enzyme sau khi qua lọc gel được tính như sau:i iProtein1enzymeCVCVni ==∑Trong đó: Cprotein: tổng hàm lượng protein của dung dòch sau khi qua lọc gel (mg/mL);Ci: nồng độ protein của mỗi phân đoạn hoặc peak (mg/mL);Vi: thể tích của mỗi phân đoạn hoặc peak (mL);Venzyme: thể tích dòch enzyme thí nghiệm (mL).– Tổng hoạt tính enzyme He2 (U/mL) sau khi qua lọc gel được tính như sau:i ie21enzymeHVHVni ==∑Trong đó: He2: tổng hoạt tính dòch enzyme sau khi qua lọc gel (U/mL);Hi: Hoạt tính enzyme ở mỗi phân đoạn hoặc peak (U/mL);Vi: thể tích của mỗi phân đoạn hoặc peak (mL);Venzyme: thể tích dòch enzyme qua lọc gel (mL).LUA N VA N TO T NGHIE PÄ Ê Á Ä CHƯƠNG 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 43– Hiệu suất thu hồi hoạt tính enzyme sau lọc gel so với enzyme thô (%H):2e0H%H .100%He=Trong đó: He2 và Heo: hoạt tính enzyme sau lọc gel và enzyme thô, U/mL. – Hoạt tính riêng của dung dòch enzyme sau lọc gel (HTRe2, U/mg protein):e2e2proteinHHTRC=– Độ tinh sạch enzyme sau khi qua lọc gel (ĐTS, lần):e2eoHTRĐTSHTR=Trong đó: HTRe2 và HTReo: hoạt tính riêng của enzyme sau quá trình lọc gel và enzyme thô, U/mg protein. LUA N VA N TO T NGHIE PÄ Ê Á Ä . Á Ä CHƯƠNG 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 36 – Hóa chất phân tích các loại .3. 2 3. 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUPHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU3.2.1 Sơ đồ nghiên cứuGiai. sánh tính chất của chế phẩm thu được với chế phẩm thương mạiHình 3. 1 Sơ đồ nghiên cứu3.2.2 Thuyết minh sơ đồ nghiên cứu3.2.2.1 Giai đoạn 1: Tinh sạch